唐豪，陳榮清，劉虹杉，吳麗娜，齊思博，閻春蘭

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430074)

工業(yè)廢水中的污染物種類繁多，成分復(fù)雜.其中合成染料對環(huán)境的影響極為惡劣，分子結(jié)構(gòu)中多含有穩(wěn)定性極強的苯環(huán)，難以在環(huán)境中自然降解，使得從工業(yè)廢水中移除合成染料或使之脫色成為目前染料廢水處理過程中面臨的主要問題之一[1-3].三苯甲烷類染料是印染工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一類染料，約占所有合成染料中的30%～40%[4].結(jié)晶紫是一類典型的三苯甲烷類染料，廣泛應(yīng)用于印染、生物和醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域.結(jié)晶紫分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難降解，具有高殘留、高生物毒性和致癌、致畸、致突變作用.許多研究者嘗試采用化學(xué)還原、物理沉淀或絮凝、光催化氧化、吸附、電化學(xué)處理、反滲透和生物降解等多種處理方法來移除廢水中的結(jié)晶紫染料[5],其中生物解除法作為一種高效低耗、環(huán)境友好型處理方式越來越受到廣泛關(guān)注[6,7].目前細菌降解結(jié)晶紫染料的研究相對較少.

本研究從湖北仙桃某皮革廠廢水中分離純化到一株結(jié)晶紫高效脫色菌株，對其形態(tài)特征、生理特性、脫色可能機制等進行研究，為該菌株在染料廢水中的脫色應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養(yǎng)基

菌種來自湖北仙桃某皮革廠廢水. 無機鹽培養(yǎng)基 (MSM培養(yǎng)基，pH值7.0)：1 L 培養(yǎng)基中含有15.13 g Na2HPO4，3.0 g KH2PO4，0.5 g NaCl，1.0 g NH4Cl，0.491 g MgSO4·7H2O，0.026 g CaCl2·2H2O；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 (pH值7.4～7.6)：1 L 培養(yǎng)基中含有3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl.

1.2 主要儀器與試劑

結(jié)晶紫(上海麥克林)；dNTPs和Taq聚合酶(Takara)，PCR產(chǎn)物及DNA凝膠回收試劑盒(博大泰克). 生化試劑均為分析純.

Centrifuge5424離心機(Eppendorf)；紫外可見光分光光度計(UV2600型，島津)；PCR儀 (T-personal 48，Biometra)；自動凝膠圖像分析儀(上海培清)；引物序列 (表1)，均由天一輝遠公司合成.

表1 PCR引物

1.3 實驗方法

1.3.1 結(jié)晶紫脫色菌株的馴化、分離和純化

取皮革廠廢水按10 %的接種量接入加有10 mg/L結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)一周后，吸取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至含20 mg/L結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，連續(xù)馴化，轉(zhuǎn)接多次至結(jié)晶紫的終濃度為100 mg/L. 取100 μL菌液在含結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨平板上進行涂布檢測，觀察是否有菌株生長，以及對結(jié)晶紫的降解情況，之后在涂布平板上挑取不同形態(tài)特征的單菌落，重新轉(zhuǎn)接至含結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨平板上多次劃線，直至分離獲得單一形態(tài)的結(jié)晶紫脫色菌株的純培養(yǎng)物.

1.3.2 菌株的16S rRNA基因的PCR擴增與序列分析

提取菌株的基因組DNA做為PCR模板，采用通用引物16S-F/16S-R進行16S rDNA擴增. PCR擴增條件參考文獻[8]. PCR產(chǎn)物回收后送天一輝遠測序. 利用Blast軟件與該菌株的16S rDNA序列進行比較分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹. 采用Mega 7.0程序?qū)ο到y(tǒng)進化樹進行分析[9].

1.3.3 菌株的生長實驗

采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，菌種接種量為5 %，在30 ℃，180 r/min下分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、16、20、24 h，分光光度計測量OD600值，繪制生長曲線.

1.3.4 菌株的碳源與氮源利用實驗[10]

采用MSM基本培養(yǎng)基，菌種接種量為5 %，探究碳源實驗時，以0.1 % (W/V) 氯化銨為氮源，分別以葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氫鈉作為碳源，加入量為0.5 % (W/V)；探究氮源實驗時，以0.5 % (W/V) 葡萄糖為碳源，分別以蛋白胨、亞硝酸鈉、酵母提取物、硝酸鉀、氯化銨作為氮源，加入量為0.1 % (W/V)，在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)0、24、48、72 h，測量OD600值.

1.3.5 菌株的生理生化特性

IMViC試驗，采用大腸桿菌IMViC生化鑒定試劑盒鑒定菌株的生化特征，其中包括吲哚試驗、甲基紅試驗、伏-普試驗和檸檬酸鹽試驗；

硫化氫試驗，將菌株在醋酸鉛試管培養(yǎng)基中做穿刺培養(yǎng)，37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基顏色變化.

淀粉水解試驗，將菌株在淀粉培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌種生長情況，在平板上滴加碘液，觀察是否出現(xiàn)無色透明圈.

油脂水解試驗，將菌株在油脂培養(yǎng)基上劃線接種，37 ℃溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌苔顏色.

尿素試驗，將菌株在尿素培養(yǎng)基上劃線接種，35 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基顏色變化.

1.3.6 菌株的脫色影響因素研究

(1)培養(yǎng)時間 以牛肉膏蛋白胨為培養(yǎng)基，加入終濃度為20 mg/L的結(jié)晶紫，菌液接種量為5 %，30 ℃，180 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7 d，研究不同時間下菌株的脫色效果.

(2)培養(yǎng)溫度 分別設(shè)定培養(yǎng)溫度為20、25、30、37、40 ℃.

(3)培養(yǎng)基初始pH值 用1.0 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值至2、4、5、6、7、8、9、10.

(4)接種量 按1 %、2 %、3 %、5 %、7 %、10 %的接種量分別接種到加有終濃度為20 mg/L結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中.

(5)碳氮源 將供試碳源 (葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氫鈉) 分別添加到MSM培養(yǎng)基中，使其終濃度為0.5 % (W/V)，以0.1 % (W/V) 氯化銨為氮源；將供試氮源 (蛋白胨、亞硝酸鈉、酵母提取物、硝酸鉀、氯化銨) 分別添加到MSM培養(yǎng)基中，以0.5 % (W/V) 葡萄糖為碳源.

(2)～(5)接種和培養(yǎng)方法同 (1). 所有的實驗均重復(fù)3組以上，并同時設(shè)置不加菌液的培養(yǎng)基為對照.

1.3.7 菌株脫色前后的紫外-可見光光譜掃描分析

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加結(jié)晶紫至終濃度為20 mg/L，接種菌株后于30 ℃培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)液10000 r/min離心10 min，取上清液，以未接種的含結(jié)晶紫的溶液離心后的上清液為對照，進行紫外-可見光光譜掃描.

1.4 脫色率計算[3]

混合培養(yǎng)物在10000 r/min離心10 min后，上清液用分光光度計在580 nm處 (結(jié)晶紫的最大吸收峰) 測定吸光度，對照組為同等條件下不接菌組.脫色率通過以下的公式進行計算：

脫色率= (A0-AC)/A0×100 %

(A0：未接種菌液的染料培養(yǎng)基吸光度，AC：接入菌液培養(yǎng)一段時間后的染料培養(yǎng)基的吸光度)

1.5 菌株脫色機理的初步研究

根據(jù)菌株16S rDNA分子鑒定的菌株結(jié)果，合成簡并引物，對菌株中可能與結(jié)晶紫脫色相關(guān)的基因如三苯甲烷還原酶、漆酶等基因進行PCR驗證，并對擴增成功的基因進行回收，測序(天一輝遠)，與Genbank中序列進行比對. 基因引物如表1所示.

2 結(jié)果與分析

2.1 ZTS-1菌株的分離鑒定

經(jīng)過馴化、分離與純化，從皮革廠廢水中共分離得到6株細菌，經(jīng)過對結(jié)晶紫脫色的初步分析，ZTS-1的脫色效果最好，該菌株為桿菌，G-，菌長在0.8～2.5 μm左右，寬在0.5 μm左右，菌落呈乳白色，邊緣圓整，稍隆起，菌落較小，濕潤.

將ZTS-1菌株的16S rDNA序列與GenBank中的序列進行比對，發(fā)現(xiàn)該菌株與Ochrobactrum屬中的多株細菌的相似性均在99%以上；選取同源性高的菌株用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示.從圖中可以看出，ZTS-1菌與Ochrobactrum屬的多種菌株，如O.intermediumL3、O.intermediumL22、O.intermediumC1 等均聚在一起，細菌序列高度吻合，因此可以鑒定ZTS-1細菌是蒼白桿菌屬細菌 (Ochrobactrum).

圖1 ZTS-1菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 ZTS-1菌株的生長及生理生化特征

從圖2-A中可以看出，0～2 h為菌株生長的延滯期，2～16 h為菌株生長的指數(shù)期，菌株在此期間生長較為迅速，16 h后菌株進入穩(wěn)定期.

ZTS-1菌株的碳源利用實驗如圖2-B所示，對于檢測的碳源物質(zhì)，ZTS-1 菌株不能利用麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、葡萄糖、碳酸氫鈉作為碳源物質(zhì)，能夠利用酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨等作為碳源，其中以對酵母提取物利用效果最佳；在氮源利用實驗(圖2-C)中，ZTS-1菌株不能利用亞硝酸鈉、硝酸鉀和氯化銨作為氮源，可利用蛋白胨和酵母提取物，以對酵母提取物的利用效果最佳.

A)生長曲線；B)碳源；C)氮源

ZTS-1菌株的生理生化特征結(jié)果如表2所示.在IMViC試驗中，吲哚試驗結(jié)果為陰性，說明該菌株不具有色氨酸酶，不能利用色氨酸；甲基紅試驗和V.P.試驗結(jié)果為陰性，說明該菌株在利用葡萄糖的過程中既不能進行混合酸發(fā)酵也不能進行丁二醇發(fā)酵；檸檬酸鹽的結(jié)果顯示該菌株不能利用檸檬酸鹽.

表2 ZTS-1菌的生理生化實驗結(jié)果

在大分子水解實驗中，油脂水解試驗結(jié)果為陽性，說明ZTS-1菌株可利用油脂，而淀粉水解試驗、尿素和硫化氫試驗結(jié)果均為陰性，說明該菌株不能利用淀粉，不能產(chǎn)生尿素酶，也不能利用含硫化合物產(chǎn)生硫化氫.

2.3 菌株ZTS-1對結(jié)晶紫的脫色特性

2.3.1 不同培養(yǎng)時間對脫色的影響

以牛肉膏蛋白胨為培養(yǎng)基，加入終濃度為20 mg/L的結(jié)晶紫，菌液接種量為5 %，30 ℃，180 r/min恒溫振蕩器培養(yǎng)0、1、2、3、4、5、6、7 d. 從圖3中可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株ZTS-1對結(jié)晶紫的脫色率增加，第5 d時的脫色率最高，達到了59.32%，但是第3 d到第7 d的脫色率之間不具有顯著性差異 (P>0.05)，即在菌株培養(yǎng)值第3 d就基本達到最大的脫色效果.

圖3 不同培養(yǎng)時間對菌株降解結(jié)晶紫的影響

2.3.2 培養(yǎng)溫度對脫色的影響

將菌株ZTS-1以5 %的接種量，接種到加有終濃度為20 mg/L的結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20、25、30、37、40 ℃，培養(yǎng)3 d后可以看出(圖4)，溫度對菌株ZTS-1的脫色作用具有顯著的影響，在20～37 ℃之間，脫色率隨著溫度的升高而升高，在37 ℃達到了最高的脫色率64.54%；當(dāng)溫度繼續(xù)升高到40 ℃時，脫色率有所下降，但仍超過了60%，說明該菌株對結(jié)晶紫的脫色溫度適應(yīng)性較強.總體上，微生物的生長速率會隨著溫度的升高而增加，菌株對結(jié)晶紫的降解率也會隨著溫度的升高而升高，過低或過高的溫度均會抑制細胞中酶的活性，進而使得結(jié)晶紫的脫色率降低[11,12].

圖4 溫度對菌株降解結(jié)晶紫的影響

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH值對脫色的影響

將菌株ZTS-1以5 %的接種量，接種到加有終濃度20 mg/L結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，溫度為30 ℃，用1.0 mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值至4、5、6、7、8、9、10，培養(yǎng)3 d，從圖5中可以看出，pH從4.0增加到5.0時，脫色率呈上升趨勢，在pH 5.0時，達到最大值56.90 %；之后隨著pH值的上升，脫色率略呈下降趨勢.結(jié)果表明，pH值在5.0～10.0之間時，菌株ZTS-1對結(jié)晶紫有較好的脫色效果，該菌株對菌株脫色的pH適應(yīng)性較強，實際應(yīng)用潛力較大.同時pH值偏酸性的環(huán)境下菌株的脫色率較高，最適pH值為5. 以往的研究表明，多個屬菌株，如Bacillussp.[13]、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌[14]等對結(jié)晶紫的降解或脫色時最適pH值為中性，偏酸或偏堿均會對脫色產(chǎn)生抑制作用. 菌株ZTS-1在偏酸或偏堿的條件下均有較好的脫色效果，pH值適應(yīng)性較強，在實際應(yīng)用中潛能較大.

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對菌株降解結(jié)晶紫的影響

2.3.4 不同接種量對脫色的影響

將菌株ZTS-1分別以1 %、2 %、3 %、5 %、7 %、10 %的接種量，接種到終濃度20 mg/L結(jié)晶紫的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，30 ℃，培養(yǎng)3 d后測定脫色率， 從圖6可以看出，在接種量從1%增加到3%時，菌株對結(jié)晶紫的脫色率隨著接種量的增加而增加，在接種量為3 %時，菌株的脫色率最高，達到58.40%.進一步增加接種量，不會增加菌株的脫色過程，反而會使菌株的脫色率有所下降，可能與菌體數(shù)量的增加，使得菌株對營養(yǎng)成分的競爭加劇，進而在一定程度上抑制了菌株對結(jié)晶紫的脫色作用[15]；也可能是因為高濃度接種量使得在1～2 d即可能達到最大脫色率，而實驗測定的是第3 d時的脫色率，沒有體現(xiàn)出來.

圖6 接種量對菌株降解結(jié)晶紫的影響

2.3.5 碳氮源對脫色的影響

將菌株ZTS-1分別按5%的接種量，分別接種于含有終濃度為0.5% (W/V)的葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、碳酸氫鈉的MSM培養(yǎng)基中，以0.1% (W/V) 氯化銨為氮源，添加終濃度為20 mg/L的結(jié)晶紫，30 ℃培養(yǎng)3 d后測定脫色率，考察碳源對于菌株降解結(jié)晶紫的影響；接種于含有終濃度為0.1 % (W/V)的蛋白胨、亞硝酸鈉、酵母提取物、硝酸鉀、氯化銨的MSM培養(yǎng)基中，以0.5 % (W/V) 葡萄糖為碳源，添加終濃度為20 mg/L的結(jié)晶紫，30 ℃ 180 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)3 d后測定脫色率，考察氮源對于菌株降解結(jié)晶紫的影響，結(jié)果如圖7所示.

從圖7-A可以看出，以酵母提取物為碳源時，菌株ZTS-1的脫色效果最佳，脫色率達到59.53 %，牛肉膏、蛋白胨、蔗糖次之，而以葡萄糖、麥芽糖、淀粉、甘露醇和碳酸氫鈉為碳源時，菌株對于結(jié)晶紫沒有脫色效果，說明碳源對該菌株脫色能力的影響較大；從7-B可以看出以葡萄糖為碳源時，以酵母菌提取物為氮源時脫色率最高，其次是蛋白胨和氯化銨，而以亞硝酸鹽和硝酸鉀為氮源時，菌株對結(jié)晶紫沒有脫色效果.也說明外加氮源對菌株ZTS-1脫色能力影響較大.

圖7 碳源 (A) 和氮源 (B) 對菌株降解結(jié)晶紫的影響

綜合以上實驗條件，在酵母提取物作為碳氮源的MSM培養(yǎng)基中，接種量為3 %，培養(yǎng)基初始pH為5，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)3 d后測定脫色率，發(fā)現(xiàn)菌株ZTS-1對于結(jié)晶紫的脫色率22.50 %；而牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，接種量為3 %，培養(yǎng)基初始pH為5，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min恒溫振蕩器中培養(yǎng)3 d后測定脫色率，發(fā)現(xiàn)菌株ZTS-1對于結(jié)晶紫的脫色率可達到60.59 %.說明該菌株在對結(jié)晶紫脫色過程中對于碳氮源具有一定的依賴性.

除結(jié)晶紫外，本實驗也測定了ZTS-1菌株對其他色素如果紅、甲基紅、溴酚藍、孔雀綠等染料的脫色效果，發(fā)現(xiàn)該菌株在接種量為5%，30 ℃, 180 r/min培養(yǎng)3 d時，對20 mg/L的孔雀綠、剛果紅也具有一定脫色效果，脫色率分別為81.16%和42.38%，而對于甲基紅和溴酚藍則沒有脫色效果.

2.4 菌株ZTS-1的脫色機理分析

圖8是菌株ZTS-1的生長細胞對20 mg/L結(jié)晶紫脫色前后的紫外-可見光光譜分析.結(jié)晶紫在580 nm處有一個特征吸收峰，從圖8中可以看出，經(jīng)過菌株ZTS-1脫色后，結(jié)晶紫在580 nm處的特征吸收峰降低，并且在紫外光譜區(qū)有新的吸收峰產(chǎn)生.

圖8 菌株ZTS-1脫色前后的全光譜掃描

微生物對染料的脫色原因可能有兩種，生物吸附(或富集)以及生物降解.若經(jīng)脫色后，染料的特征吸收峰完全消失且產(chǎn)生新的產(chǎn)物吸收峰，則脫色是由生物降解引起；若經(jīng)過脫色后，染料的全波長掃描圖譜中的吸收峰相應(yīng)降低，但并不產(chǎn)生新的吸收峰，則脫色是由生物富集或者吸附引起的[16,17].實驗結(jié)果表明，ZTS-1對結(jié)晶紫的脫色可能是吸附和生物降解相結(jié)合的結(jié)果.

對菌株中可能的與結(jié)晶紫降解相關(guān)的基因，如三苯甲烷還原酶基因、多酮氧化酶、漆酶基因等進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)菌株ZTS-1的基因組中存在多銅氧化酶基因和漆酶基因 (圖9)，但是不存在三苯甲烷還原酶基因 (結(jié)果未顯示).測序發(fā)現(xiàn)菌株ZTS-1中的漆酶蛋白與Ochrobactrumintermedium相似性為97%，與OchrobactrumanthropiATCC 49188 相似性為87 %. 染料微生物降解機理復(fù)雜多樣，普遍認為是在多種酶的協(xié)同作用下完成的，漆酶是其中關(guān)鍵酶之一[18]. 菌株ZTS-1基因組中漆酶基因的存在，結(jié)合結(jié)晶紫脫色前后的紫外-可見光光譜分析，進一步證明ZTS-1對結(jié)晶紫的脫色可能是吸附和生物降解相結(jié)合的結(jié)果.

M) BM2000 maker；T24)多酮氧化酶基因；LAC)漆酶基因

3 結(jié)語

從湖北某皮革廠分離篩選得到一株結(jié)晶紫高效降解菌株ZTS-1，經(jīng)鑒定屬于蒼白桿菌屬細菌(Ochrobactrum). 該菌株對結(jié)晶紫脫色的pH值和溫度的適應(yīng)性范圍較廣，最適脫色pH為5.0，最適脫色溫度為37 ℃，最佳接種量為3 %，供試碳源和氮源對菌株脫色能力影響較大，在最佳脫色條件下牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中脫色3 d，該菌株對20 mg/L的結(jié)晶紫脫色率可達60 %. 經(jīng)脫色前后的紫外-可見光光譜掃描分析和基因組中結(jié)晶紫降解相關(guān)酶基因顯示該菌株的對結(jié)晶紫的脫色可能是吸附和生物降解共同作用的結(jié)果.