孫夢桐 呂欣然 林 洋 崔天琦 白鳳翎 勵建榮

（渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013）

嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體環(huán)境中，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌和條件致病菌，也可導致典型的人-獸-魚共患病。對水產養(yǎng)殖業(yè)而言，嗜水氣單胞菌感染的主要魚類包括鱸魚、鯉魚、鯰魚和羅非魚等主要經濟魚類品種[1]。目前，這類魚病的防治策略主要采用抗生素等藥物，而頻繁使用抗生素的危害是使細菌產生耐藥性，耐藥菌的繁殖會使抗生素的用量不斷增加，如此形成惡性循環(huán)，致使藥物在魚體內大量殘留，導致養(yǎng)殖水體環(huán)境污染嚴重[2]。

大量研究表明，嗜水氣單胞菌具有AhyI/R 群體感應（Quorum sensing，QS）信號傳導途徑，利用N-酰基高絲氨酸內酯（AHLs） 信號分子如N-丁酰-L-高絲氨酸內酯（C4-HSL）和N-3-己酰-DL-高絲氨酸內酯（C6-HSL）作為信號分子，AHLs 與嗜水氣單胞菌生物膜和多種毒力因子密切相關[3-5]。采取干擾、破壞和阻斷細菌群體感應手段，使其生物膜和毒力因子形成受阻，是控制由嗜水氣單胞菌引起水產養(yǎng)殖疾病的一條新途徑。

從自然生態(tài)環(huán)境中分離篩選對群體感應具有抑制作用的活性物質即群體感應抑制劑（Quorum sensing inhibitor，QSI） 是當前該領域研究的熱點之一。革蘭氏陰性菌QSI 主要來源于植物、動物和微生物[6-8]。Mohabi 等[9]研究發(fā)現白櫟提取物（Quercus infectoria galls extract，QIFGE） 對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）群體感應具有抑制活性，使其不能形成毒力因子，從而達到控制銅綠假單胞菌感染的作用。微生物源性QSI 一般來源于真菌和細菌。Chang 等[10]從北大西洋浮游微生物根瘤菌（Rhizobium sp.）中分離培養(yǎng)和篩選對銅綠假單胞菌PAO1 具有抑制活性的QSI，獲得的次級代謝產物N-丁酰高絲氨酸內酯（C4-AHL）類似物具有破壞銅綠假單胞菌生物膜結構的能力，且可以通過降低AHLs 介導的毒力因子，如彈性蛋白酶活性和鐵載體的產生來控制銅綠假單胞菌PAO1 毒力因子的致病作用。

乳酸菌通過產生細菌素、有機酸、羅伊菌素等代謝產物以及生態(tài)位和營養(yǎng)物競爭方式抑制其它種微生物的生長繁殖[11-13]。乳酸菌生物制劑已廣泛應用于乳制品、肉制品、水產品及果蔬制品等的防腐保鮮[14-16]。目前，有關細菌源性QSI 的國內外研究相對較少，以乳酸菌為革蘭氏陰性菌QSI 的研究鮮見報道。Park 等[17]研究發(fā)現，從泡菜中篩選的菌株清酒乳桿菌 （Lactobacillus sakei）NR28 通過對大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC43894 的AI-2受體淬滅的方式來抑制群體感應，達到降低其致病性的目的。Sha 等[18]在蝦餌料中同時添加戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）HC-2 和副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）E1，結果表明戊糖乳桿菌HC-2 中l(wèi)uxS 基因的過多表達限制了副溶血弧菌E1 接近組織受體或影響其群體感應基因的轉錄來抑制的群體感應和毒力相關基因的表達。本文從傳統(tǒng)腌漬蔬菜中篩選對嗜水氣單胞菌群體感應具有抑制作用的乳酸菌，并研究其作用機理，為研發(fā)一種新型、安全、高效的水產養(yǎng)殖微生態(tài)制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 目標菌株：乳酸菌菌株及來源，見表1。

表1 傳統(tǒng)腌漬蔬菜分離的乳酸菌菌株及來源Table 1 Sources of LAB isolated from traditional pickled vegetables

指示菌株：紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026；受試菌株：嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）LY-2，分離自遼寧綏中養(yǎng)殖大菱鲆體表。以上菌株由本微生物學與分子生物學實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑 LB 培養(yǎng)基、MRS 培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限公司；堿性蛋白酶（200 000 μ/g）、木瓜蛋白酶（200 000 μ/g）、胃蛋白酶（15 000 μ/g）、胰蛋白酶（250 000 μ/g）、中性蛋白酶（200 000 μ/g），華藍化學有限公司；卡那霉素、細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、DNA marker-D、Taq PCR Master mix，上海生工生物工程有限公司；乳酸菌生化鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-2N 超級潔凈工作臺，北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；IKA Vortex GENIUS 3 振蕩器，德國IKA 公司；SPX-25 生化培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；5804R 高速冷凍離心機、ABI stepone plus PCR 儀，德國Eppendorf 公司；DYY-8C 電泳儀，北京市六一儀器廠；Quantity One 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Imark 酶標儀，美國BIO-RAD；Labconco Free Zone 2.5 臺式真空冷凍干燥機，美國LABCONCO 公司；S-4800 掃描電鏡、E-1045 鍍金儀，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌無細胞上清液 （Cell free supernatants，CFS） 和嗜水氣單胞菌AHLs 粗提物的制備 將乳酸菌菌株接種于MRS 液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，傳代2 次。以2.0%接種于MRS 液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h 后，在4 ℃下6 500 r/min 離心15 min，用0.45 μm 濾膜過濾獲得CFS，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Vattem 等[19]的方法，將-80 ℃保藏的嗜水氣單胞菌LY-2 接種于LB 肉湯中，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，傳代2 次后以1.0%接種量30 ℃培養(yǎng)12 h，在4 ℃下6 500 r/min 離心15 min，得上清液。將上清液與乙酸乙酯等體積混合振蕩，靜置15 min待分層，取乳化層，重復2 次。50 ℃120 r/min 旋轉蒸發(fā)至乙酸乙酯完全蒸干。用甲醇溶解AHLs粗提物，-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抑制嗜水氣單胞菌群體感應乳酸菌的篩選

將紫色桿菌CV026 以2.0%接種量于LB 肉湯中30 ℃培養(yǎng)24 h，傳2 代后，取200 μL 接種于10 mL 含10 μg/mL 卡那霉素的LB 肉湯中，30 ℃培養(yǎng)24 h。將其與10 mL 含有100 μL AHLs 的LB 培養(yǎng)基混合，倒入底層鋪有10 mL 素瓊脂的平板中。用牛津杯法在每孔加入180 μL 乳酸菌CFS，對照組中加入MRS 肉湯，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，用V3 型全自動菌落計數儀記錄孔周圍出現的不透明的白色渾濁圈直徑，每個菌株做3 個平行試驗。

1.3.3 乳酸菌粗提物的制備 取100 mL 乳酸菌CFS 置于250 mL 的分液漏斗中，分5 次加入100 mL 乙酸乙酯進行萃取，溶劑加入后振蕩，靜置分層后收集乳化層于錐形瓶中。在50 ℃120 r/min條件下，真空旋轉蒸發(fā)至有機溶劑氣味消失，收集殘留液，真空冷凍干燥成粉末置于-18 ℃冰箱保存。

1.3.4 乳酸菌粗提物對紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長曲線的影響 將活化嗜水氣單胞菌LY-2 用LB 肉湯制成約106CFU/mL 菌懸液，在96 孔板中每個孔中添加190 μL 菌懸液，再分別加入10 μL 32.0，24.0，20.0，16.0，8.0，4.0，2.0 mg/mL 的乳酸菌粗提物，對照組為不加乳酸菌粗提物的LB 肉湯，30 ℃培養(yǎng)24 h，每2 h 測定OD595值。

1.3.5 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響

1.3.5.1 96 孔板法測定嗜水氣單胞菌生物膜抑制率 在96 孔板中的每孔加入180 μL 106CFU/mL嗜水氣單胞菌LY-2 菌懸液和20 μL 粗提物，對照組添加20 μL MRS 肉湯，30 ℃培養(yǎng)24 h。移出孔內培養(yǎng)液，用200 μL 無菌水清洗3～5 次，加入200 μL 0.4%結晶紫染色5 min，無菌水清洗3 次，60 ℃干燥10 min，每孔加200 μL 95%乙醇，每孔移除150 μL 到另一96 孔板內，酶標儀測定OD595值，每個樣品做3 個平行試驗。嗜水氣單胞菌的抑制率按式（1）計算。

式中，ODcontrol——對照組OD 值；ODQSI——乳酸菌粗提物處理組OD 值。

1.3.5.2 光鏡觀察 在24 孔板中放入無菌蓋玻片（R=1.4 cm），孔內加入1 mL LB 肉湯和10 μL嗜水氣單胞菌LY-2 菌懸液及100 μL 乳酸菌粗提物，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，超純水潤洗3 次蓋玻片，0.4%結晶紫染色20 min，油鏡（1 000×）下觀察。

1.3.5.3 掃描電鏡觀察 24 孔板中放入無菌蓋玻片（R=1.4 cm），孔內加入1 mL LB 肉湯、10 μL 嗜水氣單胞菌LY-2 菌懸液及100 μL QSI 粗提物，30 ℃培養(yǎng)24 h 后，超純水潤洗3 次蓋玻片，4 ℃下2.5%戊二醛溶液中固定24 h，超純水洗滌3 次除去殘留的戊二醛，分別用體積分數40%，70%，90%，100%乙醇脫水處理15 min，蓋玻片真空干燥，噴金，掃描電鏡觀察。

1.3.6 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌AHLs 的降解 參照Romero 等[20]方法稍作修改，取10 μL AHLs 粗提物加入1 mL 不同濃度乳酸菌粗提物中，37 ℃培養(yǎng)24 h。取2 mL 紫色桿菌CV026 與45～50 ℃的25 mL LB 固體培養(yǎng)基混勻倒入底層有10 mL 素瓊脂平板中。采用牛津杯打孔法，孔中加入180 μL 樣品，30 ℃培養(yǎng)24 h，0.0 mg/mL 的乳酸菌粗提物作為對照，V3 型全自動菌落計數儀記錄孔周圍出現的紫色圈。

1.3.7 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌群體感應抑制作用的影響因素 蛋白酶：乳酸菌粗提物pH值調至各蛋白酶最適pH 后，加入木瓜蛋白酶（pH 7.0）、胃蛋白酶（pH 2.0）、胰蛋白酶（pH 7.5）、中性蛋白酶（pH 7.0）和堿性蛋白酶（pH 10.0），使最終質量濃度為1.0 mg/mL，37 ℃孵育2 h，再將pH 值調為初始值。未處理的乳酸菌粗提物為對照，按

1.3.2 節(jié)方法測定其抑制群體感應活性。

溫度：分別在40，60，80，100，121 ℃條件下處理乳酸菌粗提物30 min，未處理的乳酸菌粗提物為對照，按1.3.2 節(jié)方法測定其抑制群體感應活性。

pH 值：用1.0 mol/L NaOH 和1.0 mol/L HCl將菌株上清液的pH 值分別調為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，按1.3.2 節(jié)的方法測定其活性。

1.3.8 乳酸菌菌株鑒定

1.3.8.1 生理生化鑒定 選擇具有群體感應抑制作用的乳酸菌菌株，參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行鑒定[21-22]。

1.3.8.2 16S rRNA 鑒定 取乳酸菌菌株12 h 菌懸液1.0 mL 加入1.5 mL EP 管中，8 000 r/min 離心15 min，用DNA 快速抽提試劑盒提取菌株DNA，使用16S rDNA 通用引物進行PCR 擴增。正向引物為27f （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物為1492r （5’ -TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）[23]。PCR 擴增反應體系：Taq PCR Master mix 12.5 μL、DNA 模板1.0 μL、dd H2O 9.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL，總體積25 μL。PCR 擴增反應程序：94 ℃2 min 預變性，94 ℃1 min 變性，60 ℃1 min 退火，72 ℃90 s 延伸，72 ℃保持10 min，30 次循環(huán)，4 ℃保溫。

PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，擴增結果用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。擴增成功的PCR 產物送至上海生物工程股份有限公司測序。測序結果經校對后與NCBI 上GeneBank 數據庫中的己有序列進行BLAST 比對，使用MEGA 5.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.9 數據處理 試驗數據采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計學分析，數據平行3 次，結果用平均值±標準偏差表示，用Origin 8.0 進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 抑制嗜水氣單胞菌群體感應乳酸菌的篩選

圖1是采用牛津杯打孔法從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中篩選得到的4 株對嗜水氣單胞菌QS 有抑制作用的乳酸菌菌株NNL1-5、CY2-4、DLH513 和LT2-2，其抑菌圈直徑分別為10.01，11.42，12.88 mm 和10.85 mm，由此表明菌株DLH513 對嗜水氣單胞菌QS 抑制作用最強。

圖1 乳酸菌對紫色桿菌CV026 產紫色素的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of LAB on violacein production of C.violaceum CV026

2.2 乳酸菌粗提物對紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長曲線的影響

為證明菌株DLH513 對嗜水氣單胞菌的抑制作用是通過群體感應而不是抑制菌體生長而發(fā)揮作用，研究0.0，2.0，4.0，8.0，16.0，20.0，24.0，32.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物對紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長的影響，結果見圖2。與對照相比，2.0，4.0，8.0，16.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物處理的紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌生長曲線呈正常生長趨勢，24 h 時OD 值分別達到1.02和0.86；20.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物處理的紫色桿菌CV026 及嗜水氣單胞菌OD 值分別下降至0.52 和0.64；24.0，32.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物處理的嗜水氣單胞菌及紫色桿菌CV026 的生長曲線明顯下降，OD 值分別下降至0.43 和0.20，表明24.0，32.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物能夠抑制嗜水氣單胞菌及紫色桿菌CV026 的生長。因此，選擇16.0 mg/mL 的菌株DLH513 粗提物做下一步試驗。

2.3 乳酸菌粗提物對生物膜形成的影響

利用96 孔板法測定8.0，16.0 mg/mL 菌株DLH513 粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 生物膜抑制率分別為21.7%和40.9%。圖3是菌株DLH513粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 生物膜影響的光鏡和電鏡觀察結果，可以看出對照組圖3a 中嗜水氣單胞菌LY-2 菌株緊密生長，試驗組圖3b 菌株生長稀疏；對照組圖3c 中嗜水氣單胞菌LY-2 形成的生物膜較完整，試驗組圖3d 中嗜水氣單胞菌LY-2 生長稀疏，不能形成大量的生物膜，由此表明菌株DLH513 粗提物對嗜水氣單胞LY-2 菌生物膜的形成有抑制作用。Santhakumari 等[24]研究發(fā)現海洋藍藻提取物（50～200 μg/mL）對哈維氏弧菌的生物膜抑制率達到25.0%，37.0%，53.0%和71.0%，而在創(chuàng)傷弧菌中，分別高達33.0%，47.0%，62.0%和84.0%，共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）分析表明與對照相比，200 μg/mL 質量濃度的提取物有效分解了生物膜，本試驗與此研究結果相似。

圖2 菌株DLH513 粗提物對紫色桿菌CV026 和嗜水氣單胞菌LY-2 生長曲線的影響Fig.2 Effect of strain DLH513 crude extraction on growth curves of C.violaceum CV026 and A.hydrophila LY-2

圖3 菌株DLH513 粗提物對嗜水氣單胞菌生物膜形態(tài)的影響Fig.3 Effect of strain DLH513 crude extraction on biofilm microscopic of A.hydrophila

2.4 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌的信號分子的降解

圖4是菌株DLH513 粗提物降解嗜水氣單胞菌LY-2 AHLs 的試驗結果。圖中可以看出，與對照組相比16.0 mg/mL 的菌株DLH513 粗提物處理的AHLs，紫色圈直徑明顯減小，降解率為51.1%；20.0 mg/mL 的菌株DLH513 粗提物處理的AHLs被完全降解。由此表明，菌株DLH513 粗提物可以通過降解嗜水氣單胞菌LY-2 信號分子AHLs。這與Naik 等[25]研究發(fā)現在Calibrin Z 粘土對哈維氏弧菌（V.harveyi）的群體感應具有顯著淬滅或干擾作用相近。

2.5 乳酸菌粗提物對嗜水氣單胞菌群體感應抑制作用的影響

圖5是不同蛋白酶處理的菌株DLH513 粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 群體感應抑制作用的影響結果?？梢钥闯龅鞍酌柑幚淼拇痔嵛飳κ人畾鈫伟鶯Y-2 群體感應喪失抑制。由此說明菌株DLH513 粗提物具有蛋白質特性。表2是不同溫度和pH 處理的菌株DLH513 粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 群體感應抑制作用的影響結果，結果顯示，40，60，80，100 ℃和121 ℃處理的粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 群體感應抑菌活性無顯著差異（P＞0.05），表明菌株DLH513 粗提物具有較好的耐熱性；pH 3.0～4.5 處理的粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 群體感應的抑制活性隨著pH 值的升高逐漸降低，pH 5.0～6.0 處理的粗提物無抑制活性，由此表明粗提物在低酸性條件下具有較好的抑制活性。

圖4 菌株DLH513 粗提物對嗜水氣單胞菌LY-2 AHLs 的降解Fig.4 AHLs-degradation of A.hydrophila LY-2 by crude extraction of strain DLH513

圖5 菌株DLH513 粗提物對蛋白酶的敏感性Fig.5 Effect of protease on the activity of crude extraction of strain DLH513

表2 溫度和pH 處理對菌株DLH513 粗提物的影響Table 2 Effect of temperature and pH on strain DLH513 crude extraction

2.6 乳酸菌菌株鑒定

表3是乳酸菌DLH513 生理生化鑒定結果，對照文獻[21]初步判定菌株DLH513 為乳桿菌屬植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖6是菌株DLH513 的16S rRNA 基因擴增電泳圖，圖中菌株DLH513 在1 500 bp 左右出現特異性亮帶，表示目標片段擴增成功，擴增產物送至生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得其核苷酸序列。測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7，圖中可看出菌株DLH513 與AB889712.1 （Lactobacillus plantarum）在同一分支上，置信度為100%。因此，鑒定菌株DLH513 為植物乳桿菌 （Lb.plantarum），此鑒定結果與生理生化鑒定結果相一致。

表3 菌株DLH513 的生理生化鑒定結果Table 3 Physiological and biochemical test results of strain DLH513

圖6 菌株DLH513 的16S rRNA 基因擴增電泳圖Fig.6 PCR amplification of 16S rRNA gene of strain DLH513

圖7 菌株DLH513 的16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree for sequences of strain DLH513

3 結論

本研究從遼寧大連酸黃瓜中獲得對嗜水氣單胞菌群體感應及生物膜形成具有抑制作用的乳酸菌菌株DLH513，菌株粗提物質量濃度16.0 mg/mL可降低嗜水氣單胞菌生物膜生成量，且可降解嗜水氣單胞菌群體感應AHLs 信號分子，降解率為51.1%。通過蛋白酶、溫度、pH 值對菌株粗提物抑制作用的研究發(fā)現菌株粗提物具有蛋白特性，并具有熱穩(wěn)定性，且在低酸性條件下較穩(wěn)定。經生理生化和16S rRNA 鑒定菌株DLH513 為植物乳桿菌（Lb.plantarum）。本研究從傳統(tǒng)腌漬蔬菜中獲得具有抑制群體感應特性的乳酸菌，為挖掘細菌作為革蘭氏陰性菌群體感應抑制劑資源提供借鑒與參考，也為尋找新型安全綠色的微生態(tài)制劑提供了一條新途徑。