楊 黎，劉 星*，廖夏云，劉常凱，余仁連，蘇小婷

(1.廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,廣西 南寧 530021)

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部最新頒布的第250號公告中，氯霉素及其鹽、酯被列入食品動物中禁用的藥品及其他化合物清單[1]。蜂膠作為一種動物源性食品，氯霉素及其鹽、酯應(yīng)禁止檢出。2002年，蜂膠被我國衛(wèi)健委公布為可用于保健食品原料的一種中藥，隨著對蜂膠抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、胰島素抵抗等多種生物活性[2-5]的深入研究，蜂膠被開發(fā)成各種劑型的保健食品。氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟甲砜霉素(FF)同屬于氯霉素類藥物，甲砜霉素和氟甲砜霉素為氯霉素的衍生物，藥理活性類似，均具有廣譜抗菌能力，常被用于預(yù)防和治療蜜蜂細(xì)菌性疾病[6]。如在蜂產(chǎn)品原料的收獲期違規(guī)使用此類藥物，將導(dǎo)致蜂膠及蜂膠原料保健食品中氯霉素類藥物的殘留[7]。

我國蜂膠原料保健食品消費(fèi)規(guī)模巨大，對蜂膠的主要關(guān)注點(diǎn)多在真?zhèn)舞b別[8-11]、藥理作用[12-15]及有效成分研究[16-22]等方面，對其安全性指標(biāo)關(guān)注較少。我國發(fā)布有關(guān)蜂膠的標(biāo)準(zhǔn)，僅對蜂膠的質(zhì)量指標(biāo)做了有限規(guī)定，在獸藥殘留等安全性指標(biāo)上的檢驗(yàn)方法及規(guī)定幾乎空白，因此有必要建立蜂膠及蜂膠原料保健食品中獸藥殘留的檢測方法。國內(nèi)已有關(guān)于蜂膠原料或蜂膠提取物中氯霉素殘留測定的文獻(xiàn)報(bào)道[23-25]，肖利龍等[26]采用液液萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法同時(shí)測定蜂膠中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素；國外Boboni等[7]建立了意大利市售蜂膠提取物中氯霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。但以蜂膠為原料的保健食品基質(zhì)復(fù)雜，添加有油脂、成型輔料等成分，上述方法不一定適用于蜂膠原料保健食品。近年來，蜂膠原料保健食品中氯霉素等獸藥殘留已引起關(guān)注[27-28]。但目前國內(nèi)外均無適用于蜂膠及蜂膠原料保健食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素同時(shí)檢測的方法，建立簡單、有效的檢測方法迫在眉睫。本文以0.1 mol/L鹽酸為提取溶劑，經(jīng)HLB與NH2固相萃取柱組合凈化，采用HPLC-MS/MS同時(shí)測定蜂膠、蜂膠原料保健食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留，可為蜂膠及蜂膠原料保健食品中獸藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)制訂和蜂膠產(chǎn)品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPLC I-Class高效液相色譜儀、Waters TQ-XS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司)；Mettler Toledo ML204電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；多管式渦旋振蕩器(德國Heidolph公司)；Thermo Multifuge X3R低溫冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；Organomation N-EVAP 112氮吹儀(美國Organomation公司)；ZABN2000氮?dú)獍l(fā)生器(南京日立產(chǎn)機(jī)有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：氯霉素(純度99.9%)、甲砜霉素(純度99.9%)、氟甲砜霉素(純度99%)，均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、正己烷、甲酸(色譜純)，均購于默克公司；25%氨水、鹽酸、二氯甲烷(分析純)，均購于廣東光華科技股份有限公司；Oasis HLB 固相萃取柱(6 mL/200 mg，Waters公司)；Agela Cleanert NH2-SPE 柱(3 mL/500 mg，Agela公司)。

樣品：蜂膠原料、蜂膠原料保健食品均為本地市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取適量氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，-20 ℃冰箱保存。準(zhǔn)確移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用乙腈配制成100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃冰箱保存。

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.1%甲酸水-乙腈(90∶10，體積比)配制成氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素質(zhì)量濃度為0.10～20.0 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理蜂膠原膠、硬膠囊劑型、片劑：蜂膠原膠置于-20 ℃冰箱冷凍過夜，取出立即打碎成均勻粉末；硬膠囊劑型直接取膠囊內(nèi)容物；片劑研磨成均勻的粉末作為樣品。準(zhǔn)確稱取樣品(2.00±0.05) g于50 mL離心管中，精密加入0.1 mol/L鹽酸10.0 mL，置于渦旋混合器上高速渦旋2 min，超聲5 min后以10 000 r/min離心10 min。將HLB固相萃取柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化，精密吸取5.0 mL上清液上樣后，用5 mL水、5 mL 5%甲醇淋洗，負(fù)壓抽干10 min。將NH2柱用5 mL甲醇活化，保持柱體濕潤，串接在抽干后的HLB柱下，用5 mL甲醇、5 mL 4%氨化甲醇洗脫。收集洗脫液,50 ℃以下氮吹至干，用1.0 mL 0.1%甲酸水-乙腈(90∶10)復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，待測定。

軟膠囊劑型：稱取內(nèi)容物(2.00±0.05) g于50 mL離心管中，精密加入0.1 mol/L 鹽酸10.0 mL，加入10 mL正己烷，置于渦旋混合器上高速渦旋5 min，超聲5 min后以10 000 r/min離心10 min，此時(shí)混合溶液分為3層，中間層為提取液，下層為固體，棄去上層正己烷層。將HLB固相萃取柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水活化，吸取中間澄清提取液5.0 mL上樣后，用5 mL水、5 mL 5%甲醇淋洗，負(fù)壓抽干10 min。后續(xù)步驟與其他3種樣品相同。

1.3 分析條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3.0 min，10%～25%B；3.0～3.5 min，保持25%B；3.5～5.0 min，25%～75%B；5.0～5.5 min，保持75%B；5.5～6.0 min，75%～10%B；6.0～8.5 min，保持10%B。

離子源：電噴霧離子(ESI)源，負(fù)離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，分段采集；毛細(xì)管電壓：-0.30 kV，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流速：1 000 L/h，錐孔氣流速：150 L/h，碰撞氣(氬氣)流速：0.15 mL/min，其他MRM參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

蜂膠原膠中含有大量的樹脂、蜂蠟以及蜜蜂上腭腺分泌的粘液質(zhì)等成分[29]，軟膠囊劑型添加了甘油、明膠、油脂等輔料，因此提取溶劑需將樣品完全融化并減少共提取物。考察了乙酸乙酯、乙腈、0.5%氫氧化鈣、0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH 4.0)、4%醋酸鉛、0.1 mol/L鹽酸作為提取溶劑時(shí)對軟膠囊劑型的效果。結(jié)果顯示，采用乙酸乙酯和乙腈提取時(shí)，軟膠囊劑型的提取液顏色很深，共提取干擾物多，回收率不理想；0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖液(pH 4.0)不能使軟膠囊劑型的內(nèi)容物均勻分散，渦旋后內(nèi)容物呈團(tuán)塊狀，不利于目標(biāo)成分溶出；0.5%氫氧化鈣和4%醋酸鉛能很好地溶解樣品，但會破壞部分目標(biāo)物，導(dǎo)致響應(yīng)降低；0.1 mol/L鹽酸能較好地溶解軟膠囊劑型的內(nèi)容物，且提取溶液顏色較淺，并可使目標(biāo)化合物離子化，增強(qiáng)在HLB固相萃取柱上的吸附，實(shí)驗(yàn)最終采用0.1 mol/L鹽酸為提取溶劑。另外，軟膠囊劑型多以植物油脂(如大豆油等)作為輔料，提取時(shí)加入正己烷可除去樣品中的脂溶性雜質(zhì)，有助于提取和凈化。

片劑和硬膠囊劑型主要添加固體類輔料，實(shí)驗(yàn)證明0.1 mol/L鹽酸適用于片劑、硬膠囊劑型及蜂膠原料的提取。

2.2 凈化方式的選擇

固相萃取是獸藥殘留檢測的常用凈化手段，其中HLB柱填料為聚苯乙烯/二乙烯苯以及親水性的吡咯烷酮基團(tuán)，同時(shí)具有親水性和疏水性，對各類極性和非極性化合物均具有吸附作用，能夠去除樣品中的不保留基質(zhì)組分，如鹽類、糖類、極性脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HLB柱上樣后必須經(jīng)水、5%甲醇淋洗步驟，否則試管底部會有大量未知粘稠物，影響復(fù)溶及目標(biāo)物的回收率。比較了6 mL/200 mg和6 mL/500 mg兩種規(guī)格HLB萃取柱對回收率的影響，結(jié)果顯示兩柱對目標(biāo)化合物的回收率無明顯影響，綜合考慮成本，選擇HLB(6 mL/200 mg)柱。NH2柱具有弱陰離子交換和正相保留作用，對脂肪酸、極性色素和糖具有很好的結(jié)合力，因此本實(shí)驗(yàn)在HLB柱后串接NH2柱，以去除基質(zhì)中脂肪酸(如油酸、棕櫚酸、亞油酸)、有機(jī)酸、部分色素、金屬離子、糖類等干擾物，提高凈化效果。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

配制100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用針泵直接進(jìn)樣，分別對毛細(xì)管電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、脫溶劑氣流速、錐孔氣流速、碰撞氣(氬氣)流速、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以確定化合物的母離子和碎片離子，以響應(yīng)強(qiáng)度較大的子離子作為定量離子，響應(yīng)強(qiáng)度略小的子離子作為定性離子，典型的多反應(yīng)監(jiān)測譜圖見圖1。由不同基質(zhì)加標(biāo)的圖譜可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下目標(biāo)化合物能與共流出物有效分離。

圖1 空白軟膠囊劑型基質(zhì)添加目標(biāo)分析物(10.0 μg/kg)的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)譜圖Fig.1 MRM chromatograms of blank soft capsule matrix adding target substance of 10.0 μg/kg

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提取干擾物與目標(biāo)化合物競爭電離所致[30]?；|(zhì)效應(yīng)會影響液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的靈敏度和精密度，從而影響定量準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)制備蜂膠原膠、片劑、硬膠囊劑型和軟膠囊劑型4種不同基質(zhì)的空白基質(zhì)，分別配制質(zhì)量濃度為0.10～20.0 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以及相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)[31]，若比值在0.8～1.2范圍內(nèi)，認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)不明顯。結(jié)果表明，4種基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)為0.92～1.18，說明本方法具有良好的凈化效果，基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

2.5 線性關(guān)系

按“1.2.1”配制質(zhì)量濃度為0.10～20.0 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，3種目標(biāo)化合物在0.10～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999。

2.6 檢出限與定量下限

在4種不同基質(zhì)的陰性樣品中添加0.5 μg/kg的目標(biāo)化合物，采用本方法提取凈化后進(jìn)行測定，以信噪比S/N≥3計(jì)算方法的檢出限，S/N≥10計(jì)算方法的定量下限。結(jié)果顯示，蜂膠原膠、片劑和軟膠囊劑型中3種目標(biāo)物的檢出限(LOD)為0.037～0.083 μg/kg，定量下限(LOQ)為0.12～0.28 μg/kg；硬膠囊劑型中的LOD為0.39～0.47 μg/kg，LOQ為1.28～1.57 μg/kg(見表2)。

2.7 回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

分別對蜂膠原膠、軟膠囊劑型、硬膠囊劑型和片劑樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在4種不同的陰性基質(zhì)中分別添加2.5、5.0、10.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度5份，采用本方法進(jìn)行處理和測定，計(jì)算3種目標(biāo)化合物的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，各基質(zhì)中3種目標(biāo)化合物的回收率為66.6%～120%，RSD為0.80%～11%(表2)，能夠達(dá)到檢測痕量殘留目標(biāo)物的要求。

表2 目標(biāo)化合物的檢出限、定量下限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Detection limits,quantitative limits,recoveries and relative standard deviations of the target analytes(n=5)

2.8 實(shí)際樣品檢測

按本法對實(shí)驗(yàn)室歷年收集的不同廠家共45批樣品進(jìn)行測定，其中10批樣品檢出氯霉素，檢出率為22.22%，殘留量為0.14～14.32 μg/kg；8批樣品檢出氟甲砜霉素，檢出率為17.78%，殘留量為0.22～21.62 μg/kg(見表3)，說明蜂膠及其原料保健食品中存在較大的氯霉素、氟甲砜霉素殘留風(fēng)險(xiǎn)。代表性陽性樣品的MRM譜圖見圖2。

圖2 同時(shí)檢出氯霉素和氟甲砜霉素的陽性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)譜圖Fig.2 MRM chromatograms of simultaneous detection of chloramphenicol and florfenicol positive samples

表3 陽性樣品的檢測結(jié)果Table 3 Determination results of positive samples

3 結(jié) 論

本文根據(jù)蜂膠原料及蜂膠原料保健食品的基質(zhì)特點(diǎn)，建立了同時(shí)檢測氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留的HPLC-MS/MS法，并對市售樣品進(jìn)行了檢測。結(jié)果同時(shí)檢出了氯霉素及氟甲砜霉素，兩者的最大殘留量分別為14.32、21.62 μg/kg，其中氟甲砜霉素陽性檢出為國內(nèi)外首次報(bào)道，說明關(guān)注蜂膠原料及蜂膠原料保健食品中的獸藥殘留是必要的。本方法操作簡單，靈敏度高，重復(fù)性好，應(yīng)用前景良好，可滿足實(shí)際檢驗(yàn)工作的需要。