杜 娟，鄭云鵬，董洪濤，張鳳霞*

(1.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司集團(tuán)實(shí)驗(yàn)室，北京 100015；2.飛鶴(龍江)乳品有限公司，黑龍江 齊齊哈爾 161100)

α-乳白蛋白(α-La)是乳清蛋白中主要的優(yōu)質(zhì)蛋白，主要存在于哺乳動物的乳汁中，能作為載物與鈣、鎂、錳、鈉、鉀以及鋅結(jié)合[1-2]，約占乳清蛋白的10%～20%[3-5]，在牛乳中占總蛋白質(zhì)的2%～3%，在母乳中占總蛋白質(zhì)的20%～25%[2]。α-La能提供最接近母乳的氨基酸組合，促進(jìn)嬰兒的大腦發(fā)育，同時還提高蛋白質(zhì)的生物利用率，降低蛋白質(zhì)總量，從而有效減輕腎臟負(fù)擔(dān)。β-乳球蛋白(β-Lg)是牛乳中的主要乳清蛋白，約占牛乳總蛋白的10%，占乳清蛋白的40%～50%[6-9]。據(jù)報(bào)道，近兩年全國嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)量約90萬噸，其原料絕大多數(shù)為牛乳，并且添加了脫鹽乳清粉、乳清蛋白粉、濃縮乳清蛋白粉等蛋白類原料來調(diào)整蛋白質(zhì)比例，使其接近母乳水平[10]。據(jù)估算乳清粉類原料用量約為嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)量的8%～25%，因此乳清蛋白粉的品質(zhì)優(yōu)良至關(guān)重要。而乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的含量是衡量其品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。

目前，α-La和β-Lg含量檢測的報(bào)道較少，已有方法有凝膠色譜法[11]、高效液相色譜法[12-13]、毛細(xì)管電泳法[14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[18]等。然而，目前的檢測方法主要是針對嬰幼兒配方奶粉、牛乳等樣品基質(zhì)。而針對乳清蛋白類原料等的分析研究主要停留在總蛋白含量測定水平上，尚無相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測α-La和β-Lg含量，已有的反相高效液相色譜法特異性較差[10]，不可避免地產(chǎn)生了乳清蛋白粉的監(jiān)管盲區(qū)。針對上述情況，本研究基于三重四極桿質(zhì)譜MRM/SRM定量思路的靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，利用蛋白專屬的肽段序列完成定量分析。方法通過采用堿性胰蛋白酶為酶切工具，烷基化與酶解乳清蛋白類原料，特異肽段內(nèi)標(biāo)法超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)分析，降低了復(fù)雜樣品中共流出的背景干擾，從而實(shí)現(xiàn)了UPLC-MS/MS對乳清蛋白粉類樣品中α-La和β-Lg含量的準(zhǔn)確測定。本方法前處理簡單快速，試劑用量少，定量準(zhǔn)確，對實(shí)際乳清蛋白粉類樣品的檢測結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(Xevo-TQD，沃特世科技(上海)有限公司)；電子分析天平(ME204，梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)；渦旋混合器(VORTEX-2，美國Scientific Industries公司)；超聲波水浴(KQ-700DE，昆山超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水器(Milli-Q Advantage A10，默克化工技術(shù)有限公司)。

牛α-La特異肽段(序列 VGINYWLAHK，分子量 1 199.7 Da，純度≥99%)；牛β-Lg特異肽段(序列：IDALNENK，分子量 915.5 Da，純度≥99%)；牛α-La同位素特異肽段(序列：VGI*NYWL*AHK，分子量1 214.4 Da，純度≥95%)；牛β-Lg同位素特異肽段(序列：I*DAL*NENK，分子量 929.5 Da，純度≥95%)；碳酸氫銨(生化試劑級)、二硫蘇糖醇(DTT,生化試劑級)、碘代乙酰胺(IAA，生化試劑級)、堿性胰蛋白酶(生化試劑級)。以上特異肽段、同位素特異肽段及試劑均由杭州璞湃科技有限公司提供。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純,美國默克公司)。共計(jì)5個國外品牌的脫鹽乳清粉D70、7個國外品牌的脫鹽乳清粉D90、3個國外品牌濃縮乳清蛋白粉和1個國外品牌α-乳白蛋白粉，共計(jì)16個。樣品均由黑龍江飛鶴乳品有限公司提供。實(shí)驗(yàn)用水均為二級水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制α-La和β-Lg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(2 μmol/L)：標(biāo)準(zhǔn)品20 nmol，準(zhǔn)確加入10 mL水定容，即得α-La和β-Lg(2 μmol/L)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并于-20 ℃冰箱中保存。

α-La-IS和β-Lg-IS的混合同位素內(nèi)標(biāo)使用液(2 μmol/L)：標(biāo)準(zhǔn)品20 nmol，準(zhǔn)確加入10 mL水定容，即得α-La-IS和β-Lg-IS(2 μmol/L)混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 樣品前處理烷基化與酶解：稱取適量試樣1.0 g，置于25 mL具塞玻璃比色管中，先用5 mL水溶解，再定容至刻度。移取25 μL至2 mL離心管中，加入200 μL內(nèi)標(biāo)混合溶液和10 μL的二硫蘇糖醇(DTT)還原，50 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫后加入30 μL的碘代乙酰胺(IAA)烷基化后，靜置30 min，加入200 μL緩沖溶液(500 mmol/L碳酸氫銨)、10 μL增活劑CaCl2和50 μL堿性胰蛋白酶溶液，37 ℃恒溫酶解過夜，10 μL甲酸終止酶解。采用水定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

1.2.3 測定條件色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300?(100 mm×2.1 mm i.d.,1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～1 min，5%B;1～4.5 min，5%～40%B；4.5～4.6 min，40%～100%B；4.6～6.0 min，100%B；6.0～6.1 min，100%～5%B；6.1～8 min，5%B。質(zhì)譜條件：電噴霧模式：ESI+；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子噴霧電壓：3.0 kV；脫溶劑溫度：500 ℃，脫溶劑氣流量：800 L/h；干燥氣：氮?dú)?；碰撞氣：氬氣；MRM參數(shù)見表1。

表1 α-La和β-Lg及其內(nèi)標(biāo)在MRM模式下的主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of α-La，β-Lg and their internal standards(IS) under multiple reaction monitoring(MRM) mode

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性多肽的選擇

本文選擇堿性胰蛋白酶作為酶切工具，將蛋白粉中的α-La和β-Lg酶切形成肽段。利用其高度專一性，水解精氨酸與賴氨酸羧基端的肽鍵。通過Uniprots數(shù)據(jù)庫的PeptideMass工具分析，α-La和β-Lg理論上可以通過酶解獲得9條和13條長短不一的多肽產(chǎn)物，從MS系統(tǒng)的檢測性和穩(wěn)定性上考慮，應(yīng)選擇特定氨基酸上修飾少，長度6～12個氨基酸的多肽作為目標(biāo)肽段[19]。其中氨基酸數(shù)量少于6個的肽段不具有足夠的特異性，氨基酸數(shù)量大于12個的肽段色譜分辨率低，故不進(jìn)行進(jìn)一步分析。經(jīng)篩選其中α-La有2條肽段VGINYWLAHK和LDQWLCEK，β-Lg有6條肽段TPEVDDEALEK、VLVLDTDYK、WENGECAQK、LIVTQTMK、IDALNENK和ALPMHIR符合要求。本文通過單離子掃描模式(SIM)與MRM方式對各個多肽的響應(yīng)值進(jìn)行評估，最終選擇色譜分離過程中無干擾、響應(yīng)值高的VGINYWLAHK和IDALNENK分別作為α-La和β-Lg的特異性多肽。通過Uniprots數(shù)據(jù)庫的BLAST分析工具對牛乳中的其他已知蛋白進(jìn)行比對分析，未在其他蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)本肽段的存在。表明本文選擇的多肽具有高度的特異性。

在應(yīng)用UPLC-MS/MS法檢測多肽時，多肽的響應(yīng)值受到基質(zhì)以及參與反應(yīng)的化學(xué)試劑的影響，導(dǎo)致響應(yīng)信號增益或抑制?；谏鲜鰡栴}，本文選擇同位素特異肽VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK作為內(nèi)標(biāo)，在預(yù)處理之前加至被測樣品中。同位素特異肽的理化性質(zhì)與目標(biāo)多肽完全一致，色譜-質(zhì)譜行為也一致(見圖1)，能校正由基質(zhì)效應(yīng)所帶來的檢測響應(yīng)值波動。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，選用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽段不但能降低基質(zhì)效應(yīng)還能校正樣品前處理過程的誤差。

圖1 乳清蛋白粉樣品中α-La和β-Lg特異肽及其同位素特異肽的色譜圖Fig.1 Chromatograms of α-La and β-Lg signature peptides and their isotope-labeled analogs in the whey powder samples

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇C4和C18的固定相均由疏水烷基鏈構(gòu)成，蛋白質(zhì)組分與反向固定相的疏水作用大小除與反相固定相的烷基鏈長有關(guān)外，還與蛋白質(zhì)的疏水性相關(guān)。C4的烷基鏈較短，更適合分離質(zhì)量大的蛋白，而小分子的多肽需用烷基鏈更長、疏水性較強(qiáng)的C18分離。本實(shí)驗(yàn)選用C18色譜柱，分別考察了Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300 ?(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Waters ACQUITY UPLC-BEH HILIC(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)2款色譜柱對分離效果的影響。結(jié)果顯示，前者能將標(biāo)準(zhǔn)特異肽段、同位素特異肽段分離，且目標(biāo)物的出峰時間短，峰形好，可以滿足質(zhì)譜定量的峰形要求；而后者得到的峰形較寬，峰形拖尾不對稱(圖2)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇Waters ACQUITY UPLC-BEH C18，300 ?色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 采用BEH HILIC色譜柱分離的標(biāo)準(zhǔn)特征肽段的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of α-La and β-Lg separated with a BEH HILIC column

2.2.2 流動相的優(yōu)化乳清粉中蛋白的極性較大，常用乙腈和水作為流動相[20]。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和水的流動相體系，發(fā)現(xiàn)色譜峰毛刺較多且拖尾?？紤]到待測物的化學(xué)性質(zhì)，分別嘗試乙腈-0.1%甲酸水溶液的流動相體系和0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液的流動相體系。對比后發(fā)現(xiàn)在乙腈和水中均加入甲酸可改善目標(biāo)化合物的峰形。推測一方面是由于待測化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)含有酸性或堿性基團(tuán)，另一方面是甲酸可通過調(diào)節(jié)流動相pH，與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用來改善峰形，克服毛刺和拖尾問題。在綜合峰形和分離度前提下，最終選擇的流動相及梯度洗脫條件如“1.2.3”所述。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

用0.1%甲酸水溶液分別配制系列濃度為40、100、200、500、1 000 nmol/L的α-La標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為400 nmol/L；濃度為80、200、400、1 000、2 000 nmol/L的β-Lg標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度為400 nmol/L。以α-La和β-Lg的特異肽段定量離子濃度(X)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的目標(biāo)分析物與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，α-La和β-Lg分別在40～1 000 nmol/L和80～2 000 nmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.998 7和0.998 9。以信噪比S/N≥10計(jì)算方法的定量下限(LOQ)，得到α-La和β-Lg的定量下限均為0.020 g/100 g。方法的靈敏度可滿足乳清蛋白粉中目標(biāo)物的檢測要求。

2.4 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

稱取1 g脫鹽乳清粉D70作為本底，α-La和β-Lg加標(biāo)量分別為本底含量的0.5、1.0、1.5倍，即α-La的3個加標(biāo)水平分別為0.75、1.50、2.25 g/100 g，β-Lg的3個加標(biāo)水平分別為2.50、5.00、7.50 g/100 g。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，將每個加標(biāo)水平平行測定6次，其平均回收率為84.7%～95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.6%～5.8%(見表2)。方法的準(zhǔn)確度及精密度能夠滿足定量分析的基本要求。

表2 脫鹽乳清粉D70中α-La和β-Lg的3水平加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of α-La and β-Lg in demineralised whey powder 70% at three spiked levels(n=6)

2.5 乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的含量分析

脫鹽乳清粉是將原料乳清中的礦物鹽脫去，改變?nèi)榍逯械碾x子平衡后即可得到。若將乳清直接烘干得到乳清粉末，再經(jīng)過澄清、超濾、干燥等過程即可得到濃縮乳清蛋白。濃縮乳清蛋白根據(jù)過濾程度不同，可以得到蛋白濃度從34%～80%不等的產(chǎn)品[12,21]。而脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉和α-乳白蛋白粉常作為蛋白類原料應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中，用于調(diào)整牛奶中α-La的比例。本實(shí)驗(yàn)選取了5個國家的4類乳清蛋白粉共計(jì)16個樣品為代表性基質(zhì)，其中脫鹽乳清粉D70 樣品5個，脫鹽乳清粉D90樣品7個，濃縮乳清蛋白粉樣品3個，α-乳白蛋白粉樣品1個。對其中α-La和β-Lg含量按“1.2”方法進(jìn)行前處理及測定，檢測值均以10 d連續(xù)雙平行測量的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表3～4。

表3 脫鹽乳清粉D70、D90中α-La和β-Lg的含量Table 3 Content of α-La and β-Lg in demineralised whey powder 70% and 90%

表4 濃縮乳清蛋白粉和α-乳白蛋白粉中α-La和β-Lg含量Table 4 Content of α-La and β-Lg in whey protein concentrate and α-lactalbumin powder

由表3～4可知，脫鹽乳清粉D70中,α-La和β-Lg的含量分別為 1.38～1.95 g/100 g和4.20～4.81 g/100 g；脫鹽乳清粉D90中，α-La和β-Lg的含量分別為 1.24～2.03 g/100 g和3.65～6.21 g/100 g；濃縮乳清蛋白粉中,α-La和β-Lg的含量分別為 8.98～11.36 g/100 g和37.12～42.03 g/100 g；α-乳白蛋白粉中,α-La和β-Lg的含量分別為31.35 g/100 g和15.32 g/100 g。通過對這3類蛋白粉中α-La和β-Lg含量進(jìn)行對比分析，可以看出全部樣品均檢出α-La和β-Lg。其中，脫鹽乳清粉D70和D90由于制作工藝相近，只是脫去礦物質(zhì)程度不同，因此其測得α-La和β-Lg的含量基本一致。濃縮乳清蛋白粉中α-La和β-Lg含量約為脫鹽乳清粉的6～10倍，而且3種乳清蛋白粉中β-Lg的含量約為α-La的2.15～4.67倍，與文獻(xiàn)一致[22]。本實(shí)驗(yàn)在α-乳白蛋白粉中檢出β-Lg，可能是由于α-乳白蛋白粉的生產(chǎn)工藝所決定。α-乳白蛋白粉由乳清粉進(jìn)行超濾、濃縮、噴霧干燥得到，其中的α-La含量較其他種類乳清粉高，但是β-Lg并未完全去除。所以α-乳白蛋白粉中還會殘留少量的β-Lg，但經(jīng)過濃縮后其α-La和β-Lg的含量較脫鹽乳清粉D70和D90中的高。

同一樣品檢測數(shù)據(jù)的日間平行性很好(RSD≤9.1%)，表明同類樣品不同品牌間波動性不大，所以做整體平均數(shù)時，采取平均值計(jì)算，可保障樣品中含量的普遍性。檢測結(jié)果還顯示，不同類產(chǎn)品中α-La含量最高為α-乳白蛋白粉，β-Lg含量最高為濃縮乳清蛋白粉，脫鹽乳清粉D70和D90中的α-La和β-Lg含量均低于另外兩種蛋白類產(chǎn)品。生產(chǎn)中可以根據(jù)實(shí)際需要，選擇添加不同種類的乳清蛋白粉。

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測乳清蛋白粉中α-La和β-Lg的方法。該方法簡便易行、定量準(zhǔn)確、精密度好，能滿足乳清蛋白粉類樣品中α-La和β-Lg的檢測要求，可為乳清蛋白粉等原料中關(guān)鍵指標(biāo)提供方法和數(shù)據(jù)參考，以及為評價原料和終產(chǎn)品優(yōu)劣提供有力和有效的技術(shù)手段。

致謝：感謝黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司為本實(shí)驗(yàn)提供脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉、α-乳白蛋白粉等樣品。