徐如飛，金哲晨，許 良，蔣培蓉，陳美雯，孫梅好，蒲首丞,2*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004; 2.浙江華茗園茶業(yè)有限公司，浙江 永康 321300)

安吉白茶是綠茶類植物，其茶葉擁有低溫敏感的特性，浙江湖州的安吉縣是其盛產之地[1]。安吉白茶含有許多有效的保健成分，具有提神消乏、降低血脂和保護牙齒等作用[2]。其中，茶多酚是茶葉中主要的有效成分之一。茶多酚又叫茶單寧或茶鞣質[3]，在茶葉干基中的含量為15%～35%，遠高于其他植物?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚具有消除人體自由基與抵抗衰老、預防心血管病、促進血糖血脂減低、抗癌治病、改善腸道吸收、抑菌、抗輻射、沉淀重金屬等一些特殊有效的藥理作用[4-11]。安吉白茶在清明后有大量的“粗老茶”，茶葉口感風味較差，直接飲用價值較低，容易滯銷。優(yōu)化安吉白茶水溶性多酚提取工藝，可對低值老茶葉加以利用，擴大安吉白茶的經濟效益。目前，國內對安吉白茶中茶多酚提取的研究報道較少。茶多酚普遍分布在細胞內，使用水浴超聲提取的方法不但環(huán)保且具有較高的安全性，且可有效地破碎細胞并加速茶多酚的向外滲透[12]，縮短提取時間。而響應面法不局限于孤立的試驗點，可在試驗范圍連續(xù)進行分析得出最優(yōu)方案。因此選擇超聲波提取方法，響應面法優(yōu)化安吉白茶水溶性茶多酚提取的最佳條件，以期為安吉白茶水溶性多酚的工業(yè)化開發(fā)應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

安吉白茶，購于安吉縣茶葉市場。

儀器：UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津UV-2550；BT-224S電子天平，德國賽多利斯；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；5810R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司。

試劑：沒食子酸、福林酚試劑和碳酸鈉試劑均為分析純；試驗用水均為去離子水。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制 使用高精度電子天平準確稱量5 mg的標準沒食子酸樣品，并用去離子水在50 mL容量瓶中準確定容，配制成0.1 mg/mL沒食子酸標準液。分別移取0 mL、0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL、1.25 mL和1.50 mL標準液，然后分別吸取0.5 mL的福林酚試劑和2 mL質量分數(shù)為12%的碳酸鈉試劑依次加入后，去離子水定容至25 mL，搖晃均勻，平行3組。在常溫下做遮光處理，進行避光反應0.5 h，避光反應結束后，使用紫外分光光度計，在765 nm波長處測各組樣品的吸光度。以配制的沒食子酸標準液濃度C(μg/mL)為橫坐標，測得的吸光度A為縱坐標繪制標準曲線圖，并得到回歸方程式[13-14]：

A=0.104 2C+ 0.014 8 (R2=0.992 1)

1.2.2 安吉白茶中茶多酚的提取及含量測定 取50 g 安吉白茶，置于研缽中研碎，將粉末保存于錐形瓶中，密封待用。

稱取安吉白茶粉末0.5 g，裝入50 mL試管中，以100℃去離子水為溶劑，水浴超聲下提取一段時間，過濾定容后分別吸取2 mL的樣品溶液至4支試管里，分別將等量的0.5 mL福林酚試劑與2 mL質量分數(shù)為12%的碳酸鈉試劑依次移加，定容并做遮光處理及吸光度的測定，根據(jù)之前的沒食子酸標準曲線，將得到的數(shù)據(jù)代入回歸方程計算安吉白茶粉末中茶多酚含量[13-14]。

1.2.3 單因素試驗 在較高溫度下茶多酚提取量較高，為便于控制溫度，在100℃左右進行試驗，對水浴超聲的提取時間、提取茶多酚次數(shù)及安吉白茶與去離子水的料液比進行分析，通過單因素試驗考察各因素提取茶多酚的最佳條件[13]。

1) 料液比。在超聲處理0.5 h，安吉白茶與去離子水的料液比(g∶mL，下同)分別為1∶20、1∶40、1∶60和1∶80條件下各提取1次，測定茶多酚含量，下同。

2) 提取時間。在料液比1∶20，超聲處理時間分別為0.5 h、1 h、1.5 h和2 h條件下各提取1次。

3) 提取次數(shù)。在料液比為1∶20，超聲提取時間0.5 h條件下分別提取1次、2次、3次和4次。

1.2.4 響應面試驗設計[15-17]基于單因素試驗結果，取安吉白茶與水的料液比、水浴超聲提取的時間以及提取次數(shù)3個因素作為自變量，安吉白茶多酚提取量為響應值，進行3因素3水平響應面試驗設計。通過Design Expert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行回歸解析，得到安吉白茶多酚提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。其因素水平見表1。

表1 超聲波提取安吉白茶茶多酚的響應面試驗因素及水平

1.2.5 最佳工藝的驗證 在響應面試驗的最佳工藝條件下進行安吉白茶茶多酚的提取，并進行測定。

2 結果與分析

2.1 不同因素對安吉白茶茶多酚提取量的影響

從圖1看出不同料液比、提取時間及提取次數(shù)的安吉白茶茶多酚含量變化。

2.1.1 料液比 隨著料液比的增加，提取到的安吉白茶茶多酚含量先急劇增多，后增加速率變慢，當料液比超過1∶60后，提取到的茶多酚含量減少。因為料液比增加將有助于安吉白茶的茶多酚和浸提液之間的分子接觸及向外溢出，從而利于多酚的提取。但試驗使用的是超聲波輔助提取法，其原理是通過共振使細胞破裂。當液料比增大到1∶60之后，整個溶液體系的體積過于龐大，使超聲波的共振效果下降，從而導致提取效果下降。因此，料液比宜在1∶60左右。

2.1.2 提取時間 隨著提取時間的不斷延長，安吉白茶水溶性多酚的含量呈先增后降趨勢，1 h時，安吉白茶水溶性多酚的含量增加非常迅速，且其含量達較大值，為141.6 mg/g。這是因為提取時間太短，安吉白茶中的茶多酚無法被完全的有效提取出來，而當超聲提取時間太長時，茶多酚可能會被緩慢氧化，導致最后含量下降。因此超聲提取的適宜時間應為1 h。

2.1.3 提取次數(shù) 隨著提取次數(shù)增多，安吉白茶水溶性多酚的含量也不斷增加，從1次到3次的提取過程中，茶多酚含量的增長趨勢明顯，在3次提取后，茶多酚含量增長趨勢有所下降?？紤]到提取次數(shù)增多，時間與成本都會增加，故提取次數(shù)選擇3次為宜。

2.2 安吉白茶茶多酚的最佳提取工藝

2.2.1 二次回歸模型的建立 對表2中不同處理的安吉白茶茶多酚提取量進行回歸解析得到回歸模型：Y=181.46+6.11A+3.08B+4.39C+0.97AB-0.2AC-0.78BC-3.08A2-5.96B2-1.88C2。

表2 超聲提取安吉白茶的茶多酚提取量

經方差分析，該回歸模型的P<0.000 2，失擬項P=0.622 4，回歸模型極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，表明二次線性回歸方程顯著，重復試驗的數(shù)據(jù)擬合良好，可以對響應值進行很好的預測。其中因素A、B、C和B2對水溶性茶多酚提取率為顯著影響(P<0.01)。各種因素對提取水溶性多酚的影響從小到大依次為料液比、提取次數(shù)和提取時間。

2.2.2 響應面分析 從圖2可知，提取次數(shù)固定條件下，伴隨超聲波輔助提取時間的延長，水溶性茶多酚含量呈先增后減趨勢。而料液比若不斷增大，水溶性茶多酚的含量也呈增長趨勢且增大的速率逐步變緩。料液比對水溶性茶多酚含量的影響小于提取時間，與方差分析一致。此外，等高線圖的最中心總體為橢圓形，提取時間和提取料液比間相互作用顯著，且最高點落于試驗區(qū)間，說明料液比和提取時間的最適條件在探究范圍內，可根據(jù)最高點對應的數(shù)值得出最適條件。

從圖3可知，響應面表現(xiàn)為一個斜面，提取時間固定時，無論是增加提取次數(shù)還是增大安吉白茶與去離子水的比例，水溶性茶多酚含量均呈逐漸增加并趨于平穩(wěn)的趨勢。分析等高線圖發(fā)現(xiàn)，無法找到高點，最高點偏離試驗區(qū)間，且等高線表現(xiàn)為接近正圓，表示提取次數(shù)與提取料液比間的相互作用不顯著。

從圖4可知，若提取時間延長，水溶性茶多酚含量呈先增后減的變化。若提取次數(shù)增多，水溶性茶多酚含量呈先增后平穩(wěn)變化。從響應面的坡度分析可知，提取時間對水溶性茶多酚含量的影響較提取次數(shù)更顯著，提取次數(shù)和時間的相互作用也相對顯著。

2.2.3 最佳工藝及驗證 采用Box.Behnken響應面優(yōu)化法預測最優(yōu)工藝為安吉白茶與去離子水的料液比為1∶49.12(g∶mL)，提取時間為1.10 h，提取次數(shù)為3.99次，預測茶多酚提取量為187.1 mg/g。按得出的理論最優(yōu)工藝略作調整進行試驗，重復驗證，在安吉白茶與去離子水的料液比為1∶50(g∶mL)，提取時間為1.10 h，提取次數(shù)為4次時，得到茶多酚提取量為188.5 mg/g，實測值與預測值的差異為1.4 mg/g。與理論預測值基本符合，均在187 mg/g左右，表明模型擬合程度良好?？紤]到大規(guī)模工業(yè)生產時無法達到實驗室的精度要求，及大規(guī)模生產的效率問題，綜合RSM和提取成本，建議最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶50(g∶mL)、提取時間66 min、提取次數(shù)為3次，此時水溶性茶多酚提取含量為182.6 mg/g。

3 結論與討論

試驗結果表明，安吉白茶茶多酚提取的最佳工藝是料液比1∶50(g∶mL)、提取時間66 min、提取4次?？紤]到大規(guī)模工業(yè)生產時無法達到實驗室的精度要求，及大規(guī)模生產的效率問題，綜合RSM和提取成本，建議最優(yōu)提取工藝條件為料液比1∶50(g∶mL)、提取時間66 min、提取3次，此時水溶性茶多酚提取含量為182.6 mg/g。

茶葉可溶性多酚用途十分廣泛，在臨床醫(yī)藥[18]，保健品藥學[19]、美容化妝[20-21]和蔬果保鮮[22]等中均可應用。采用輔助超聲波破碎提取技術，較傳統(tǒng)的茶多酚提取方法在操作方法上更簡便，提取含量更多，性價比更高。