費 晶，鞏 平

石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 新疆石河子 832000

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，多種因素導致胃癌的發(fā)生和發(fā)展，其發(fā)病機制非常復雜[1]。據(jù)報道[2]，我國胃癌的療效在一定程度上有所改善，但由于缺乏特定癥狀，早期胃癌診斷困難。胃切除術聯(lián)合放療廣泛用于胃癌的治療，然而晚期胃癌患者的預后并不理想?；蛑委熢谀[瘤治療中越來越受到重視，許多癌基因和抑癌基因的異常表達可能影響腫瘤細胞凋亡、放射敏感性和患者預后[3]。因此，已經(jīng)提出了腫瘤基因治療和放射治療聯(lián)合的治療手段。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]是一種修復DNA鏈斷裂的基因，參與維持基因組的完整性[4]。研究[5]表明，腫瘤細胞經(jīng)X射線照射后PARP-1的表達迅速升高，可修復DNA損傷進而降低腫瘤細胞的放射敏感性。已有報道[6-8]發(fā)現(xiàn)沉默PARP-1基因可增強卵巢癌細胞、乳腺癌細胞及宮頸癌細胞等的放射敏感性。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，PARP-1在胃癌組織中亦呈高表達。本研究觀察了干擾PARP-1的表達對胃癌細胞增殖、凋亡及放射敏感性的影響，以期為胃癌的基因治療提供可能的作用靶點。

1 材料與方法

1.1材料人正常胃黏膜上皮細胞GES-1及人胃癌細胞MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27均購自美國ATCC細胞庫。PARP-1抗體、GAPDH抗體、Caspase-3抗體、Caspase-8抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國CST公司，CCK-8檢測試劑盒購自日本Dojindo公司，Annexin-Ⅴ/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司，特異性PARP-1 siRNA和非特異性siRNA(si-NC)均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國Promega公司，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，細胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL化學發(fā)光試劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27細胞均在含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。根據(jù)各細胞生長狀態(tài)及時更換培養(yǎng)基，待細胞生長至匯合度達80%以上時，使用胰蛋白酶消化細胞，并進行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3不同細胞PARP-1mRNA表達的檢測采用Trizol法分別提取GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27細胞的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。PARP-1引物序列：上游5’-AAGGCGAATGCCAGCGTTAC-3’，下游5’-GGCACTCTTGGAGACCATGTCA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游5’-AUAAUUUCAUGAAGUGCUCTT-3’。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)熒光定量PCR檢測試劑盒說明進行擴增，以GAPDH為內(nèi)參。20 μL反應體系：cDNA模板0.8 μL，上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.8 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7.6 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算PARP-1 mRNA的相對表達量。實驗重復3次。

1.4HGC-27細胞轉(zhuǎn)染及分組取HGC-27細胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁生長，匯合度達50%時分為3組，si-PARP-1組和陰性對照組采用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染特異性PARP-1 siRNA和si-NC，未轉(zhuǎn)染的HGC-27細胞為空白對照。轉(zhuǎn)染后各組細胞置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。以下實驗每組細胞設置3個平行孔，重復3次。

1.53組HGC-27細胞PARP-1mRNA和蛋白表達的檢測轉(zhuǎn)染48 h后提取3組HGC-27細胞的總RNA，同1.3方法檢測PARP-1 mRNA的表達。分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組HGC-27細胞，加入細胞裂解液提取蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，在蛋白樣品中加入適量加樣緩沖液，沸水浴中加熱15 min致蛋白變性。在上樣孔中加入等量變性蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，分離蛋白后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，置于含50 g/L脫脂奶粉中封閉2 h。加入PARP-1一抗(1∶800稀釋)，4 ℃下過夜。再加入按1∶3 000稀釋的二抗，室溫下1 h，采用ECL化學發(fā)光，顯影，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.63組HGC-27細胞增殖能力的檢測轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時，分別取3組細胞，每孔細胞中加入CCK-8試劑10 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，使用酶標儀檢測波長490 nm處吸光度(A)值。

1.73組HGC-27細胞凋亡檢測分別收集轉(zhuǎn)染48 h后3組HGC-27細胞，胰蛋白酶消化后，加入100 μL結合緩沖液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，采用Annexin-Ⅴ/PI雙染法，室溫下避光進行，再加入400 μL結合緩沖液，在1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測凋亡率。

1.83組HGC-27細胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達的檢測采用Western blot法檢測3組HGC-27細胞Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達，方法同1.5，其中Caspase-3和Caspase-8一抗均按1∶1 000稀釋。

1.93組HGC-27細胞放射敏感性檢測轉(zhuǎn)染48 h后，3組HGC-27細胞分別接種于6孔板，待細胞貼壁后，分別給予6 MV X射線(單次劑量為0、2、4、6、8 Gy)照射6 h后于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)2周，用多聚甲醛固定30 min，吉姆薩染色15 min，洗去染液后晾干，在顯微鏡下觀察、計數(shù)，以>50個細胞的克隆為有效克隆，克隆形成率=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.10統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。應用單因素方差分析比較不同細胞間PARP-1 mRNA表達的差異，以及3組HGC-27細胞PARP-1 mRNA和蛋白表達水平、增殖能力、凋亡率、克隆形成率和Caspase-3、Caspase-8蛋白表達的差異，兩兩比較應用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.16種細胞中PARP-1mRNA表達水平的比較GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27細胞中PARP-1 mRNA的表達水平分別為(0.86±0.10)、(1.42±0.16)、(1.39±0.15)、(2.42±0.30)、(1.87±0.22)、(3.28±0.35)，PARP-1在人胃癌細胞中的表達均高于GES-1(P<0.05)，且在HGC-27細胞中表達量最高，因此選擇HGC-27細胞進行后續(xù)實驗。

2.23組HGC-27細胞中PARP-1表達水平的比較轉(zhuǎn)染48 h后，si-PARP-1組HGC-27細胞中PARP-1 mRNA和蛋白表達低于空白對照組和si-NC組(P<0.05)，而si-NC組和空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示轉(zhuǎn)染PARP-1 siRNA能夠干擾胃癌HGC-27細胞PARP-1的表達。見圖1和表1。

1～3：分別為空白對照組、si-NC組和si-PARP-1組

表1 3組HGC-27細胞中PARP-1 mRNA和蛋白表達水平的比較(n=3)

2.33組HGC-27細胞增殖能力比較轉(zhuǎn)染48、72和96 h，與空白對照組和si-NC組相比，si-PARP-1組HGC-27細胞A值降低，提示細胞增殖能力減弱，見表2。

表2 3組HGC-27細胞增殖能力比較(n=3)

2.43組HGC-27細胞凋亡率及Caspase-3和Caspase-8蛋白表達水平的比較與空白對照組和si-NC組相比，si-PARP-1組HGC-27細胞凋亡率升高，Caspase-3和Caspase-8蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖2和表3。

1～3：分別為空白對照組、si-NC組和si-PARP-1組

表3 3組HGC-27細胞凋亡率及Caspase-3和Caspase-8蛋白表達水平比較(n=3)

2.53組HGC-27細胞放射敏感性的比較與空白對照組和si-NC組相比，不同照射劑量下si-PARP-1組細胞克隆形成率均降低(P<0.05)，見表4。

表4 不同照射劑量下3組細胞克隆形成率比較(n=3) %

3 討論

胃癌是全球癌癥相關死亡的第二大常見原因；胃癌的發(fā)生率在世界不同地區(qū)之間存在明顯差異，在東亞尤其常見[10]。雖然手術是胃癌的主要治療方法，但放射治療在胃癌的輔助和姑息治療中也起著重要作用，而腫瘤細胞的放射敏感性決定了放療效果。放射治療的分子機制主要是通過電離輻射損傷DNA雙鏈，而多種修復途徑通過修復DNA損傷降低放射治療效果[11]。研究[12]證實，PARP-1基因具有DNA損傷修復的功能，可修復電離輻射導致的DNA雙鏈斷裂，因此靶向抑制PARP-1的表達對放射增敏具有重要意義。有研究[13]顯示，PARP-1的高表達與胃癌的侵襲和預后不良密切相關。但有關PARP-1基因參與胃癌細胞放射敏感性的研究鮮見報道。

本實驗首先通過qRT-PCR檢測了人正常胃黏膜上皮細胞GES-1及不同胃癌細胞中PARP-1 mRNA的表達情況，結果顯示，PARP-1 mRNA在胃癌細胞尤其是HGC-27細胞中的表達顯著高于GES-1細胞。將特異性PARP-1 siRNA轉(zhuǎn)染HGC-27細胞，結果表明，轉(zhuǎn)染特異性PARP-1 siRNA可有效干擾PARP-1的表達，且轉(zhuǎn)染后HGC-27細胞增殖受抑，細胞凋亡率升高，Caspase-3和Caspase-8蛋白表達水平升高；接受不同劑量X射線照射后，干擾PARP-1表達的HGC-27細胞克隆形成率降低，表明干擾PARP-1基因可提高HGC-27細胞的放射敏感性，這與Feng等[14]在乳腺癌，K?tter等[15]在胰腺癌PC3細胞、宮頸癌HeLa細胞和肺腺癌H1299細胞等中的研究相符。研究[16-17]顯示Caspase-3是細胞凋亡過程中的最終執(zhí)行者，其激活可促進細胞凋亡；而Caspase-8是細胞凋亡通路中的啟動基因，可激活下游Caspase-3。因此推測PARP-1影響胃癌細胞放射敏感性的機制可能與Caspase-8/Caspase-3途徑有關。

綜上，干擾PARP-1基因可抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，增加細胞的放射敏感性；PARP-1基因有望成為胃癌基因治療的新靶點。干擾PARP-1基因是否通過Caspase-8/Caspase-3途徑影響胃癌細胞的放射敏感性有待驗證。此外，本實驗在干擾PARP-1基因后只通過Western blot法檢測Caspase-3和Caspase-8蛋白的表達水平，未涉及Caspase-8/Caspase-3途徑上下游基因的變化，存在不足，后續(xù)實驗將對此進行補充并驗證。