蔡志波， 林 艷， 陳英虎

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 1藥劑科，2感染科，浙江杭州310052）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）不僅是一種以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊。?］，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人們殘疾的主要病因［2］，同時(shí)還給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。由于人們對(duì)RA 發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制尚不完全清楚，因此，目前尚無(wú)特異性治療RA 的策略，且許多常用的RA非特異性治療藥物具有眾多副作用［3］。因此，對(duì)RA的發(fā)病和進(jìn)展機(jī)制以及抗RA 藥物的篩選仍需持續(xù)研究。

黃芩苷（baicalin，Bai）是從黃芩苷根中提取的黃酮類單體之一，可用于支氣管炎、上呼吸道感染、風(fēng)濕痛和關(guān)節(jié)痛的治療。近年來(lái)研究［4-6］報(bào)道，黃芩苷可通過(guò)維持輔助性T 細(xì)胞17（T helper 17 cells，Th17）/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）反應(yīng)平衡來(lái)減輕過(guò)敏性哮喘、佐劑誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠的免疫炎癥反應(yīng)。膠原蛋白誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠模型與人RA 在病因和病理學(xué)改變相似［7］。而黃芩苷對(duì)CIA 的具體作用和機(jī)制尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。因此，本研究通過(guò)觀察黃芩苷對(duì)CIA 小鼠炎癥反應(yīng)和Th17 細(xì)胞比例的影響，并分析其潛在的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑

黃芩苷（純度＞98%）購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司；雞源II 型膠原蛋白（chick collagen type II，CII）、完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）、不完全弗氏佐劑（incomplete Freund's adjuvant，IFA）、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和離子霉素購(gòu)自Sigma-Aldrich；小鼠白細(xì)胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）和 IgG2a 的 ELISA 試劑盒購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；小鼠IL-17A ELISA試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；抗B淋巴細(xì)胞刺激物（B-lymphocyte stimulator，BLyS）抗體購(gòu)自Santa Cruz；莫能霉素、小鼠白細(xì)胞分化抗原4（cluster of differentiation 4，CD4）和IL-17A 抗體購(gòu)自BD Biosciences；小鼠CD4+T 細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自Miltenyi Biotec；小鼠可溶性BLyS購(gòu)自Peprotech。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只 7 周齡 SPF 級(jí)雄性 DBA/1 小鼠（18～20 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。將小鼠飼養(yǎng)在22～24℃、50%～60%濕度和12 h/12 h 明暗循環(huán)的SPF 動(dòng)物房中，小鼠可自由飲食飲水。小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行CIA造模。

3 方法

3.1 CIA 造模與分組 小鼠分為正常小鼠組（n=8）和關(guān)節(jié)炎小鼠組（n=32）。通過(guò)CII 誘導(dǎo)法構(gòu)建關(guān)節(jié)炎小鼠模型［8］，首先將CII溶于0.1 mol/L 的冰醋酸制成濃度為1 g/L 的溶液，并與等量的CFA 或IFA 混合成乳劑，然后在第1天取0.2 mL CII與CFA混合的乳劑于小鼠背部皮下分4 個(gè)部位注射致敏，第21 天取0.2 mL CII與IFA 混合的乳劑于小鼠尾根部皮下分4個(gè)部位注射強(qiáng)化免疫。關(guān)節(jié)炎小鼠分為4 個(gè)亞組，分別是CIA 亞組及黃芩苷低、中和高劑量處理亞組，每個(gè)亞組包含8 只小鼠；其中黃芩苷低、中和高劑量處理亞組小鼠在第28 天起通過(guò)灌胃方式分別給予50、100 和 200 mg·kg-1·d-1黃芩苷，持續(xù) 14 d［5-6］；CIA亞組在第28 天起通過(guò)灌胃方式給予等體積生理鹽水，持續(xù)14 d。正常小鼠第1 天和21 天注射0.2 mL 0.1 mol/L 的冰醋酸（方式同CIA 造模方式），并在第28 天起通過(guò)灌胃方式給予等體積生理鹽水，持續(xù)14 d。

3.2 各組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）的評(píng)估 采用AI 積分評(píng)價(jià)第42 天時(shí)各組小鼠關(guān)節(jié)炎癥程度。根據(jù)踝關(guān)節(jié)和趾之間病變程度分別對(duì)小鼠每只爪進(jìn)行打分:0 分，無(wú)紅腫現(xiàn)象；1 分，趾關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)紅斑和輕度腫脹；2 分，踝關(guān)節(jié)蔓延至足跖中段均呈現(xiàn)紅斑和輕度腫脹；3 分，踝關(guān)節(jié)、足爪和趾均呈現(xiàn)紅斑和中度腫脹；4 分，踝關(guān)節(jié)、足爪和趾均呈現(xiàn)紅斑和重度腫脹。4 只爪的AI 分?jǐn)?shù)之和為每只小鼠的總AI積分。

3.3 血液和組織樣本收集 在第42 天，麻醉各組小鼠并脫頸處死，每只小鼠收集2 mL 頸動(dòng)脈血，并收集小鼠后腿膝關(guān)節(jié)、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，MLN）組織樣本。

3.4 ELISA 檢測(cè) 取各組小鼠血液樣品至于4℃冰箱中呈45度角靜置1 h，然后3 000×g離心5 min收集血清。取各組小鼠后腿膝關(guān)節(jié)組織，用RIPA 裂解液進(jìn)行勻漿，并收集組織勻漿液。分別取血清和組織勻漿液按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行ELISA 反應(yīng)。顯色后，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）檢測(cè)波長(zhǎng)540 nm（用于IL-1β 和TNF-α 測(cè)定）和450 nm（用于IgG、IgG2a 和IL-17A 測(cè)定）處的吸光度（A），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IL-1β、TNF-α、IL-17A、IgG 和 IgG2a 的含量和膝關(guān)節(jié)組織中 IL-17A 的含量。

3.5 后腿膝關(guān)節(jié)HE 染色 取各組小鼠后腿膝關(guān)節(jié)組織并用4%甲醛固定48 h，5%硝酸脫鈣2 h，在二甲苯浸泡后將組織包埋在石蠟中，制作5 μm 厚度的石蠟切片，并行常規(guī)HE 染色。HE 染色后，用DP73顯微鏡（Olympus）觀察組織形態(tài)變化，并隨機(jī)獲取4個(gè)不同視野的圖像。HE 染色組織病理學(xué)圖像使用炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜成纖維細(xì)胞增生和關(guān)節(jié)腔損傷的參數(shù)積分計(jì)算軟骨評(píng)分。每個(gè)參數(shù)的評(píng)分范圍為0～4，其中0代表正常表型，4代表最嚴(yán)重的變化，3個(gè)參數(shù)的評(píng)分之和為軟骨評(píng)分。

3.6 流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+IL-17A+T細(xì)胞比例 從各組小鼠的脾臟組織和MLN 組織中分離出單核細(xì)胞懸液，用PMA（100 μg/L）、離子霉素（500 μg/L）和莫能霉素（2 μmol/L）刺激4 h 后，在4°C 的暗室下分別孵育1:1 000 稀釋比例的抗CD4（PE）和抗IL-17A（FITC）單克隆抗體30 min。用FACS CantoTMII 流式細(xì)胞儀（BD）通過(guò)CD4+門(mén)控圈出Th 細(xì)胞，然后生成流式散點(diǎn)圖，并使用FlowJo 7.6.1 軟件分析CD4+IL-17A+T細(xì)胞比例。

3.7 Western blot檢測(cè) 取各組小鼠后腿膝關(guān)節(jié)、脾臟和MLN組織樣品，并分別用RIPA裂解液提取總蛋白。蛋白經(jīng)BCA 法定量后，用常規(guī)Western blot 法檢測(cè)組織中BLyS蛋白表達(dá)。BLyS和GAPDH 抗體的稀釋比例分別為 1∶2 000 和1∶8 000。用ECL 發(fā)光液將目的條帶曝光于膠片，并用ImageJ 軟件量化目的條帶灰度值。

3.8 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn) 取正常小鼠的脾臟，按照小鼠CD4+T 細(xì)胞分離試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，通過(guò)磁珠法分離CD4+T 細(xì)胞亞群。CD4+T 細(xì)胞亞群接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，并分為對(duì)照（control，Con）組（常規(guī)培養(yǎng) 48 h）、BLyS 組（添加 2 μg/L BLyS 處理 48 h）和 BLyS+Bai 組（添加 2 μg/L BLyS 和20 μmol/L黃芩苷處理48 h）。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞上清液用于檢測(cè)上清液中IL-1β 和TNF-α 水平（檢測(cè)方法同3.4）；收集細(xì)胞用于分析CD4+IL-17A+T細(xì)胞比例（檢測(cè)方法同3.6）。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），使用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 黃芩苷減輕CIA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹和病理學(xué)改變

如圖1A 所示，正常組小鼠關(guān)節(jié)、足爪和趾均正常，CIA組小鼠關(guān)節(jié)（膝、踝和趾關(guān)節(jié)）、足爪和趾表現(xiàn)為嚴(yán)重腫脹、紅斑和關(guān)節(jié)僵硬等癥狀；黃芩苷處理組炎癥狀得到減輕，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)、足爪和趾的腫脹和紅斑消退。AI積分結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，CIA 組小鼠AI 積分顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷劑量依賴性降低AI積分（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。膝關(guān)節(jié)HE染色組織學(xué)分析顯示，正常組小鼠關(guān)節(jié)未見(jiàn)病理學(xué)改變，CIA 組小鼠關(guān)節(jié)表現(xiàn)為滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和骨破壞的現(xiàn)象，黃芩苷處理組顯示關(guān)節(jié)病理學(xué)改變有減輕，見(jiàn)圖1B；軟骨評(píng)分結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，CIA 組小鼠軟骨評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷劑量依賴性降低軟骨評(píng)分（P＜0.05），見(jiàn)圖1D。

2 黃芩苷抑制促CIA進(jìn)展相關(guān)因子的生成

ELISA 結(jié)果顯示，與正常組對(duì)比，CIA 組血清中IL-1β、TNF-α、總IgG、同種型特異性IgG2a 和IL-17A的水平及關(guān)節(jié)組織中IL-17A 的水平均顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷以劑量依賴性方式降低上述指標(biāo)的水平（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 1.Effects of baicalin（Bai）on joint swelling and pathological changes in CIA mice.A:representative images of the hind paws in different groups；B:representative HE staining images of the hind leg knee joints in different groups（scale bar=500 μm）；C:arthritis index（AI）scores in different groups；D:cartilage scores in different groups.Mean±SD. n=8.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖1 黃芩苷對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)的腫脹程度和病理學(xué)改變的影響

3 黃芩苷降低CIA小鼠的Th17細(xì)胞比例

流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與正常組比較，CIA 組脾臟和MLN 中的CD4+IL-17A+T 細(xì)胞的比例均顯著升高（P＜0.01）；與CIA 組比較，黃芩苷劑量依賴性降低脾臟和MLN 中CD4+IL-17A+T 細(xì)胞的比例（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

4 黃芩苷抑制CIA小鼠BLyS的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與正常組比較，CIA 組關(guān)節(jié)、脾臟和MLN 組織中BLyS 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；黃芩苷劑量依賴性降低關(guān)節(jié)、脾臟和MLN 組織中BLyS表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

5 黃芩苷抑制BLyS 誘導(dǎo)的Th17 細(xì)胞分化及促炎因子IL-1β和TNF-α的生成

流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BLyS 組中CD4+IL-17A+T 細(xì)胞的比例顯著升高（P＜0.01）；與BLyS 組比較，BLyS+Bai 組中 CD4+IL-17A+T 細(xì)胞的比例顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5A。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BLyS 組中 IL-1β 和 TNF-α 的水平顯著升高（P＜0.01）；與BLyS 組比較，BLyS+Bai 組中IL-1β和TNF-α的水平顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖5B。

討 論

目前，盡管對(duì)RA 的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但T 細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)被認(rèn)為是關(guān)節(jié)發(fā)炎和骨破壞的主要誘因［9］。在CIA 小鼠模型中T 細(xì)胞特異性免疫異常反應(yīng)可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、軟骨降解和骨侵蝕［10-11］；并伴有非特異性促炎因子（如IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等）和自身抗體（IgG 和 IgG2a等）的過(guò)量生成，且其過(guò)量生成又能進(jìn)一步激化免疫異常反應(yīng)和活化炎癥細(xì)胞，最終能加劇CIA 的滑膜炎、軟骨損傷和骨吸收［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷可有效減輕CIA 小鼠的關(guān)節(jié)腫脹癥狀以及病理學(xué)改變，并降低血清中 IL-1β、TNF-α、IgG 和 IgG2a 的水平，提示黃芩苷具有抗RA的作用。

Figure 2.Effects of baicalin（Bai）on inflammatory indexes and immune markers in CIA mice.Meas±SD. n=8，##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖2 黃芩苷對(duì)CIA小鼠的炎癥指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響

Th17 細(xì)胞在RA 免疫性炎癥啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在CIA小鼠模型中，Th17細(xì)胞分泌的IL-17能募集滑膜炎性巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞沉積于關(guān)節(jié)處滑膜并能上調(diào)IL-1β、IL-6 和 TNF-α 等促炎因子分泌，最終加劇滑膜炎、軟骨損傷和骨吸收［8-11］。抑制 IL-17 可緩解 CIA 小鼠關(guān)節(jié)病變部分的炎癥反應(yīng)［13］。因此，抑制Th17 細(xì)胞分化可減輕RA的炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃芩苷可降低CIA小鼠脾臟和MLN 中Th17細(xì)胞比例，并降低血清和關(guān)節(jié)處的IL-17A 水平，提示黃芩苷可通過(guò)降低Th17 細(xì)胞生成來(lái)減輕CIA。

Figure 3.Effect of baicalin（Bai）on the the proportion of Th17 cells in spleen（A）and MLN（B）of CIA mice.Meas±SD. n=8.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖3 黃芩苷對(duì)CIA小鼠Th17細(xì)胞比例的影響

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了黃芩苷降低Th17 細(xì)胞生成的潛在調(diào)控分子機(jī)制。研究顯示，BLyS 可通過(guò)跨膜激活劑、鈣調(diào)節(jié)劑和親環(huán)蛋白配體相互作用物（transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor，TACI）等受體參與調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞分化和 T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)［14-15］。BLyS 在包括RA 在內(nèi)的多種自身免疫性疾病患者中高表達(dá)，且基因靶向抑制BLyS 可減輕RA 和系統(tǒng)性紅斑狼瘡損傷［16-17］。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)黃芩苷對(duì)CIA 小鼠中BLyS 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，黃芩苷可降低CIA 小鼠病變關(guān)節(jié)、脾臟和MLN 中BLyS的表達(dá)。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)黃芩苷可降低BLyS 刺激的 CD4+T 細(xì)胞群中 Th 細(xì)胞的比例、IL-1β 和 TNF-α 水平。這些結(jié)果提示，在CIA 小鼠中，黃芩苷能抑制BLyS 介導(dǎo)的Th17 細(xì)胞分化和Th17 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

Figure 4.Effect of baicalin（Bai）on the expressions of BLyS in joint，spleen and MLN tissues of CIA mice.Meas±SD. n=8.##P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs CIA group.圖4 黃芩苷對(duì)CIA小鼠膝關(guān)節(jié)、脾臟和MLN中BLyS表達(dá)的影響

Figure 5.Baicalin（Bai）inhibits Th17 cell differentiation and the levels of proinflammatory factors IL-1β and TNF-α in CD4+ T cell population induced by BLyS.A:the proportion of CD4+ IL-17A+ T cells in each group was detected by flow cytometry；B:the levels of IL-1β and TNF-α in each group were detected by ELISA.Meas±SD. n=8.##P＜0.01 vs Con group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs BLyS+Bai group.圖5 黃芩苷抑制BLyS誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞群中的Th17細(xì)胞分化及促炎因子IL-1β和TNF-α的水平

綜上所述，黃芩苷能通過(guò)抑制促炎因子IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的生成和 BLyS 介導(dǎo)的 Th17 細(xì)胞分化來(lái)發(fā)揮抗RA的作用。