郁 志 ， 黃桂璇， 張玉平， 陳小惠， 沈 琦， 陳存特，譚廣銷， 曹長姝， 李揚(yáng)秋， 李 萡△

（1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，2暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所，廣東廣州510632；3廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東廣州510180；4深圳市人民醫(yī)院，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院血液內(nèi)科，廣東深圳518020；5暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系，廣東廣州510632）

再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）是一種主要以T細(xì)免疫介導(dǎo)造血干/祖細(xì)胞破壞引起骨髓造血功能衰竭的血液系統(tǒng)疾病。AA 在我國發(fā)病率為7.4/106人，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美國家［1］。

T 細(xì)胞活化需要雙信號（第一信號和第二信號）共同作用。第二信號主要包括共刺激分子和免疫抑制受體，其中共刺激分子包括CD28、CD27、OX40、4-1BB、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）、可誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子（inducible T cell costimulator，ICOS）、皰疹病毒侵入介質(zhì)（herpesvirus entry mediator，HVEM）等，免疫抑制受體包括程序性死亡蛋白1（programmed cell death protein-1，PD-1）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）、淋巴細(xì)胞活化基因3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）、含T 細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3（T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，TIM-3）等［2-4］。這些正性或負(fù)性調(diào)控T 細(xì)胞活化的第二信號分子是保證恰當(dāng)、有效T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的必要因素。

CD4+T細(xì)胞與AA 的發(fā)病有一定關(guān)系，目前有關(guān)AA 患者CD4+T細(xì)胞中第二信號分子的研究并不多，因此通過系統(tǒng)分析AA 患者CD4+T 細(xì)胞參與T 細(xì)胞活化調(diào)控第二信號分子的特點(diǎn)將為全面了解AA 的T細(xì)胞免疫發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

材 料 和 方 法

1 樣本資料

共收集12 例健康成人（healthy individuals，HI）外周血（其中男性8 例，女性4 例，中位年齡38 歲）作為對照組，16 例AA 患者［包括5 例非重型再生障礙性貧血（non-severe aplastic anemia，NSAA）、5 例重型再生障礙性貧血（severe aplastic anemia，SAA）和6例極重型再生障礙性貧血（very severe aplastic anemia，VSAA），其中男性9 例，女性7 例，中位年齡30 歲］外周血作為實(shí)驗(yàn)組。收集這些外周血樣本時已告知本人，并通過暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 主要試劑與儀器

CD3-FITC（HIT3a）、CTLA-4-BV421（BNI3）、GITR-PerCP/Cy5.5（108-17）和HVEM-APC（TR2）抗體購自 BioLegend；CD4-APC-H7（RPA-T4）、OX40-PE（ACT35）、4-1BB-BV421（4B4-1）、ICOS-PE（DX-29）、TIM-3-Alexa Fluor（7D3）和 LAG-3-PE（T47-530）抗體購自BD Biosciences；紅細(xì)胞裂解液購自BD Biosciences；細(xì)胞染色緩沖液購自BioLegend。FACSVerse流式細(xì)胞儀為BD Biosciences產(chǎn)品.

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測

3.1 CD4+T 細(xì)胞中共刺激分子檢測 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室流式細(xì)胞術(shù)檢測常規(guī)方法，配制預(yù)混液等試劑后［5］，分別取2個流式管（A:對照管；B:全染管），每管加入 200 μL 的健康人或 400 μL 的 AA 患者外周血，各管中加入相當(dāng)于10 倍外周血體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫避光放置10 min，隨后使用350×g離心 5 min。棄上清，加入 2 mL 的 1× PBS 洗滌，350×g離心5 min，棄上清，重復(fù)一次。棄上清，加入50 μL的細(xì)胞染色液緩沖液重懸細(xì)胞，形成單細(xì)胞懸液，在A 管中加入配好的抗體預(yù)混液（包含有流式抗體CD3 1 μL，CD4 1 μL，OX40-ISO 20 μL，GITR-ISO 5 μL，4-1BB-ISO 5 μL，ICOS-ISO 20 μL，HVEM-ISO 20 μL）；同樣，在B 管中加入抗體預(yù)混液（包含流式抗體 CD3 1 μL，CD4 1 μL，OX40 20 μL，GITR 5 μL，4-1BB 5 μL，ICOS 20 μL，HVEM 20 μL）；輕輕混勻，室溫下避光孵育20 min。上述流式管中加入2 mL 的 1× PBS，350×g離心 5 min，棄上清，再重復(fù)一次。棄上清，據(jù)細(xì)胞數(shù)情況在管中加入300～500 μL的細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞。

3.2 CD4+T 細(xì)胞中免疫抑制受體檢測 該檢測中外周血紅細(xì)胞裂解及單細(xì)胞懸液制備方法同上。在A 管中加入抗體預(yù)混液（包含流式抗體CD3 1 μL 和CD4 1 μL）；同樣，在B 管中加入抗體預(yù)混液（包含流式抗體CD3 1 μL，CD4 1 μL，TIM-3 5 μL，CTLA-4 5 μL，LAG-3 5 μL）；輕輕混勻，室溫下避光孵育20 min（TIM-3、LAG-3 和 CTLA-4 的流式圈門選用 FMO對照）。之后洗滌及重懸細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞步驟同上。收集CD4+T細(xì)胞中共刺激分子和免疫抑制受體流式細(xì)胞術(shù)檢測原始數(shù)據(jù)后，采用FlowJo 軟件（Becton，Dickinson and Company）進(jìn)行分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)均用箱圖（box plot）表示:箱（box）中的橫線表示中位數(shù)（median）；箱的上、下邊（ends）分別表示上、下四分位數(shù)（quartiles）；上、下誤差線（whiskers）分別表示最大值（maximum）和最小值（minimum）。組間差異采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney 檢驗(yàn)）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AA患者外周血CD4+T細(xì)胞中共刺激分子比例

12 例健康人外周血中CD4+T 細(xì)胞中OX40、ICOS、4-1BB、GITR 和 HVEM 的比例依次為 3.26%、2.40%、1.39%、25.95%和49.60%；16 例AA 患者（5例 NSAA、5 例 SAA 和 6 例 VSAA）外周血 CD4+T 細(xì)胞上述信號分子的比例依次為8.01%、2.44%、1.16%、11.55%和82.20%。AA患者外周血中CD4+OX40+T細(xì)胞比例顯著高于健康人，而CD4+GITR+T 細(xì)胞的比例顯著低于健康人（P＜0.01）；不同病情程度AA 患者CD4+GITR+T 細(xì)胞比例均顯著低于健康人（P＜0.05）；SAA 和 VSAA 患者 CD4+OX40+T 細(xì)胞比例均顯著高于健康人（P＜0.05）；VSAA 患者CD4+HVEM+T細(xì)胞顯著高于健康人（P＜0.05），見圖1。

2 AA患者外周血CD4+ T細(xì)胞免疫抑制受體比例

健康人外周血 CD4+T 細(xì)胞中 TIM-3、LAG-3 和CTLA-4 的比例依次為4.47%、1.37%和4.27%；而AA 患者外周血CD4+T 細(xì)胞的比例依次為7.85%、1.72%和5.38%。AA 患者外周血CD4+T 細(xì)胞中TIM-3、LAG-3 和CTLA-4 的比例與健康人相比均無顯著差異，不同病情程度AA 患者與健康人，以及不同病情程度AA 患者之間上述分子的表達(dá)亦無顯著差異，見圖2。

討 論

目前普遍認(rèn)為AA 是異常T 細(xì)免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病，多項研究表明AA 中存在異常T 細(xì)胞活化［6］。T 細(xì)胞活化需要雙信號，其中第二信號又包括共刺激分子和免疫抑制受體，這是兩類執(zhí)行不同調(diào)控功能的信號分子。共刺激分子促進(jìn)T 細(xì)胞活化，而免疫抑制受體起到“剎車”的作用，控制T 細(xì)胞不發(fā)生過度活化。因此，二者之間的平衡可保證機(jī)體的正常T 細(xì)胞免疫功能，這個平衡一旦打破，將會引起T 細(xì)胞免疫缺陷或T 細(xì)胞免疫亢進(jìn)［7］。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)AA 患者外周血中與T 細(xì)胞活化的TCR/CD3復(fù)合物各組成基因（CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ）和第二信號分子CD28 的mRNA 表達(dá)升高并參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制對CD3ζ表達(dá)影響［8-10］。

CD4+T 細(xì)胞又稱輔助性T 細(xì)胞，其主要功能是促進(jìn)B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞增殖和分化，協(xié)調(diào)不同類型免疫細(xì)胞之間的相互作用。根據(jù)所分泌細(xì)胞因子的不同特點(diǎn)，CD4+T 細(xì)胞大致可以分為Th1、Th2、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞亞群，最近還檢測到 Th9、Th22 和 Tfh 等細(xì)胞亞群［11］。AA 中異常CD4+T 細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)Th1 免疫格局偏移，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞數(shù)量和功能異常以及Th17 細(xì)胞數(shù)量異常等［12-14］。有關(guān)AA 中CD4+T 細(xì)胞異常T 細(xì)胞活化第二信號分子的研究不多，我們前期研究也提示不同病情程度AA 患者 CD4+CD27+T 細(xì)胞比例均顯著升高［15］。有報道顯示 AA 患者 CD4+PD-1+T 細(xì)胞的比例升高［16］。因此，本研究全面分析了AA患者中CD4+T細(xì)胞多種第二信號分子的變化。

OX40 屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，主要在活化的T 細(xì)胞上表達(dá)，在CD4+T 細(xì)胞上表達(dá)更高。OX40 與其配體OX40L 識別后，促進(jìn)T 細(xì)胞增殖和存活［17］。本研究結(jié)果表明 AA 患者 CD4+OX40+T 細(xì)胞比例顯著高于健康人，而且在SAA 和VSAA 患者中更高，結(jié)果說明AA 患者CD4+T 細(xì)胞中OX40 可能與T細(xì)胞過度活化有關(guān)。

Figure 1.The expression features of co-stimulatory molecules in peripheral blood CD4+ T cells of AA patients.A:the logic diagram of flow cytometry for detecting CD4+ OX40+，CD4+ ICOS+，CD4+ 4-1BB+，CD4+ GITR+ and CD4+ HVEM+ T cells；B:the proportion of CD4+ OX40+，CD4+ ICOS+，CD4+ 4-1BB+，CD4+ GITR+ and CD4+ HVEM+ T cells in peripheral blood of healthy individuals（HI）and AA patients；C:the proportion of CD4+OX40+，CD4+ICOS+，CD4+4-1BB+，CD4+GITR+and CD4+HVEM+T cells in peripheral blood of HI and different degree of AA patients.The data were expressed as box plot，including median，first quartile，third quartile，minimum and maximum. n=12 in HI group；n=16 in AA group（n=5 in NSAA and SAA，n=6 in VSAA）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs HI group.圖1 AA患者外周血CD4+T細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)

Figure 2.The expression features of immune inhibitory receptors in peripheral blood CD4+ T cells of AA patients.A:the logic diagram of flow cytometry for detecting CD4+ TIM-3+，CD4+ LAG-3+ and CD4+ CTLA-4+ T cells；B:the proportion of CD4+TIM-3+，CD4+LAG-3+and CD4+CTLA-4+T cells in peripheral blood of healthy individuals（HI）and AA patients.The data were expressed as box plot，including median，first quartile，third quartile，minimum and maximum. n=12 in HI group；n=16 in AA group.圖2 AA患者外周血CD4+T細(xì)胞中免疫抑制受體的表達(dá)

HVEM 也屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，HVEM 高水平表達(dá)于初始和活化的T 細(xì)胞。根據(jù)所結(jié)合的配體不同，HVEM 對T 細(xì)胞活化的調(diào)控起到“雙面”調(diào)節(jié)作用，既可以發(fā)揮正性調(diào)控，也可以發(fā)揮負(fù)性調(diào)控。HVEM 在T 細(xì)胞上與LIGHT 結(jié)合是促進(jìn)T 細(xì)胞活化，而與 CD160 和 BTLA 的結(jié)合則抑制 T 細(xì)胞活化［18］。本研究僅在VSAA 患者中觀察到CD4+HVEM+T 細(xì)胞比例顯著高于健康人，至于HVEM 在VSAA 患者中異常T 細(xì)胞活化中的具體作用，需要今后從其所結(jié)合的配體去探討。

GITR 同樣屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。初始T 細(xì)胞上GITR 表達(dá)水平不高，T 細(xì)胞活化24 h后GITR 表達(dá)迅速增加。GITR 與其配體GITRL 促進(jìn)T 細(xì)胞活化/分化及存活，而且還可參與介導(dǎo)白細(xì)胞黏附和遷移［19］。此外，GITR 在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中組成性表達(dá)，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞中GITR 與一些自身免疫性疾病有關(guān)［20］。本研究檢測顯示不同病情程度AA 患者CD4+GITR+T 細(xì)胞比例均顯著降低，這首先說明CD4+GITR+T 細(xì)胞比例下降是所有AA 患者的一個共性變化特點(diǎn)。另外，結(jié)合有關(guān)AA 患者調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞中 GITR 未見明顯改變的報道［21］，也說明 AA 患者CD4+GITR+T 細(xì)胞比例降低可能主要發(fā)生在其他CD4+T 細(xì)胞亞群，比如 Th1、Th2 或者 Th17 細(xì)胞亞群。鑒于這些T 細(xì)胞亞群在AA 中特點(diǎn)，我們下一步將主要分析Th1 細(xì)胞亞群中GITR 的特點(diǎn)，以期最終明確AA 患者CD4+T 細(xì)胞中GITR 在異常T 細(xì)胞活化中的作用。

AA 患者中其他共刺激信號分子，如4-1BB 和ICOS，以及免疫抑制受體CTLA4、LAG-3、TIM-3 并未發(fā)生顯著變化。但是我們觀察到所分析的3 個免疫抑制受體呈現(xiàn)升高的趨勢。本研究所分析的共刺激分子和免疫抑制受體的結(jié)果間接提示AA 患者異常CD4+T 細(xì)胞活化可能與某些共刺激信號分子，如OX40、HVEM和GITR等密切相關(guān)。由于本研究所涉及樣本例數(shù)不多，今后需要進(jìn)一步加大樣本量觀察上述參與T 細(xì)胞活化調(diào)控分子在AA 患者CD4+T 細(xì)胞中的特點(diǎn)。同時SAA 和VSAA 患者中CD4+OX40+T 細(xì)胞比例升高，以及HVEM 在VSAA 患者中的特點(diǎn)也說明不同病情程度AA 患者中共刺激分子存在差異變化特點(diǎn)，通過對T 細(xì)胞活化第二信號分子的分析，明晰不同病情程度AA 患者的特征性改變，為今后臨床AA 免疫抑制治療療效評估也提供了一些參考資料。另外，我們將跟蹤分析經(jīng)免疫抑制治療后AA 患者共刺激分子和免疫抑制受體的變化，也為免疫抑制治療后AA 患者上述信號分子的變化特點(diǎn)積累基礎(chǔ)資料。總之，本研究首次報道了AA 患者CD4+T 細(xì)胞中參與調(diào)控T 細(xì)胞活化的多個第二信號分子的情況（總結(jié)示意圖見圖3），為今后更為全面了解AA 中CD4+T 細(xì)胞異常免疫狀態(tài)提供了新的基礎(chǔ)研究資料。

Figure 3.The schematic diagram of expression of co-stimulatory molecules and immune inhibitory receptors in CD4+ T cells from AA patients.圖3 AA患者CD4+T細(xì)胞共刺激分子和免疫抑制受體表達(dá)情況示意圖