孫 澎， 劉利思， 王 剛， 黃世光

（1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，深圳市人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，廣東深圳518020；2暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632；3中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔分院牙體牙髓病科，廣東中山528403）

含T 細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白（T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein，Tim）家族是T細(xì)胞表面的跨膜蛋白家族。目前發(fā)現(xiàn)在人類 Tim 家族中有 3 個(gè)蛋白（Tim-1、Tim-3 和Tim-4），其基因定位于染色體5q33.2區(qū)域，與變應(yīng)性鼻炎、超敏反應(yīng)、哮喘和免疫缺陷密切相關(guān)［1-2］。Tim-3 為輔助性T 細(xì)胞1（T helper 1 cells，Th1 細(xì)胞）表面標(biāo)志分子，也可表達(dá)在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）、Th17 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（macrophages，Mφ）及樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）上，在腫瘤細(xì)胞，如胃癌和黑色素瘤細(xì)胞上亦有表達(dá)［1，3］。半乳糖凝集素 9（galectin-9，Gal-9）是Tim-3的配體之一。研究顯示，Tim-3 與Gal-9 結(jié)合可對(duì)Th1 細(xì)胞的免疫功能產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)而導(dǎo)致Th1 細(xì)胞死亡，結(jié)合體內(nèi)阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Tim-3可能是終止Th1 細(xì)胞免疫應(yīng)答的抑制性分子［4］。Mφ 在固有免疫及適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在炎癥過(guò)程中當(dāng)病原體侵入宿主后，Mφ 可有效清除病原體。Mφ作為牙周疾病中重要的免疫活性細(xì)胞，在免疫應(yīng)答反應(yīng)、病損發(fā)展、長(zhǎng)期炎癥等方面有重要地位［5］。研究表明，組織內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞因子的變化、病程的演變等在不同疾病中均可誘導(dǎo)產(chǎn)生不同類型的Mφ 來(lái)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［6］。CD68是分布于細(xì)胞表面的相對(duì)分子質(zhì)量為110 kD的跨膜糖蛋白，在單核細(xì)胞表面較少，但向Mφ 轉(zhuǎn)化后表達(dá)增加，因此CD68 是常用于鑒定Mφ 的表面標(biāo)志物［7-10］。目前，在人慢性牙周炎組織Mφ 上Tim-3 和Gal-9 的表達(dá)情況尚未見報(bào)道。本研究采用免疫熒光雙染色法，觀察人慢性牙周炎牙齦組織標(biāo)本中CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況，探討慢性牙周炎牙周組織破壞程度與Tim-3和Gal-9在Mφ上表達(dá)的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

1.1 病例選擇 選擇2018年8月～2019年4月在暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)中心口腔頜面外科和牙周病科就診的自愿接受本次研究的患者，年齡16～65歲，其中男性43名，年齡（39.0±15.1）歲，女性37名，年齡（34.0±13.9）歲。受試者均無(wú)系統(tǒng)性疾病如血液病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；近3個(gè)月未服用激素類藥物或抗生素；女性受試者為非妊娠或哺乳期；1年內(nèi)未接受過(guò)牙周手術(shù)治療。慢性牙周炎的納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)1999 年美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)的牙周病新分類［11］。操作符合人體試驗(yàn)委員會(huì)制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并獲得批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 分組及取材 （1）健康對(duì)照組20 例:牙齦無(wú)炎癥，無(wú)附著喪失（attachment loss，AL），X 線照片顯示無(wú)牙槽骨吸收，取自因正畸需要拔除的前磨牙或牙周健康的智齒；（2）輕度慢性牙周炎組20例:牙齦有炎癥，牙周袋≤4 mm，AL 1～2 mm，X 線照片顯示牙槽骨吸收≤根長(zhǎng)1/3，取自因需要接受臨床牙冠延長(zhǎng)術(shù)者；（3）中度慢性牙周炎組20 例:牙齦有明顯炎癥，探診明顯出血，也可有膿，X 線照片顯示牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/3，但不超過(guò)根長(zhǎng)的1/2，牙齒可出現(xiàn)松動(dòng)，多根牙可出現(xiàn)根分叉感染，取自需要接受牙周翻瓣術(shù)的內(nèi)斜切口牙齦組織；（4）重度牙周炎組20例:取自牙周翻瓣術(shù)中切取、無(wú)法保留或預(yù)后差的需拔牙的重度牙周炎患者，牙齦有明顯炎癥，牙周袋＞6 mm，AL≥5 mm，X 線照片顯示牙槽骨吸收＞根長(zhǎng)1/2，甚至達(dá)到根長(zhǎng)的2/3，牙齒松動(dòng)III度［12］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 組織標(biāo)本的采集和處理 按照分組條件采集的各組牙齦組織標(biāo)本于4%甲醛溶液中固定超過(guò)48 h，隨后脫水、石蠟包埋，制成5 μm 厚頰舌向牙齦組織連續(xù)切片，行HE染色。

2.2 CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD68-Gal-9 雙陽(yáng)性細(xì)胞免疫熒光雙染色 I 抗:CD68 抗體（Abcam），稀釋比1∶100；Tim-3 抗體（武漢博士德），稀釋比1∶200；Gal-9抗體（武漢博士德），稀釋比1∶200。Ⅱ抗:山羊抗小鼠IgG（H+L）Alex Flour?555 和山羊抗兔IgG（H+L）Alex Flour?488（Cell Signaling Technology），稀釋比1∶200。組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水，在修復(fù)盒經(jīng)微波爐加熱修復(fù)抗原；遮光條件下采用牛血清白蛋白孵育、Ⅰ抗孵育、Ⅱ抗孵育，封片并立即在熒光顯微鏡下觀察拍照。DAPI 核染為藍(lán)色熒光，Tim-3 陽(yáng)性和Gal-9 陽(yáng)性信號(hào)為紅色熒光，CD68 陽(yáng)性信號(hào)顯現(xiàn)為綠色熒光，定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，紅光和綠光在顯微鏡同一視野下重疊后為橘黃色熒光。由2 名病理醫(yī)師觀察免疫熒光雙染色切片中CD68-Tim-3和CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并通過(guò)測(cè)量組織面積以獲得每mm2的細(xì)胞個(gè)數(shù)，再取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)取得的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 分析處理。CD68-Tim-3 和CD68-Gal-9 雙陽(yáng)性細(xì)胞平均密度的比較采用單因素方差分析。采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊時(shí)，兩兩比較選用Bonferroni 法，方差不齊時(shí)選用Tamhane's T2 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織學(xué)觀察結(jié)果

HE 染色結(jié)果顯示，健康對(duì)照組結(jié)締組織中未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖1A；輕度慢性牙周炎組可見淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞少量散在分布，見圖1B；中度慢性牙周炎組可見較多的慢性炎癥細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）浸潤(rùn)，呈局灶狀，見圖1C；重度慢性牙周炎組可見固有層中大量炎癥細(xì)胞（如漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等）聚集，見圖1D。

Figure 1.HE staining of human gingival tissues（scale bar=50 μm）.A:healthy control group；B:slight chronic periodontitis group；C:moderate chronic periodontitis group；D:severe chronic periodontitis group.圖1 各組牙齦組織HE染色結(jié)果

2 CD68-Tim-3雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果顯示，各組牙齦組織中Mφ均表達(dá)Tim-3。健康對(duì)照組牙齦組織中只觀察到極少量的CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞；輕度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞呈散在分布，且密度較健康對(duì)照組顯著增加；中度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加；重度牙周炎組牙齦組織中可見大量CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞；各組牙齦組織標(biāo)本的陰性對(duì)照未見熒光表達(dá)。統(tǒng)計(jì)CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞的密度，結(jié)果顯示，慢性牙周炎組CD68-Tim-3雙陽(yáng)性細(xì)胞密度均比健康對(duì)照組高（P＜0.01）；中度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞密度較輕度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01）；重度慢性牙周炎組CD68-Tim-3 雙陽(yáng)性細(xì)胞密度較輕、中度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01）。見圖2。

3 CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞雙染色結(jié)果

免疫熒光染色結(jié)果顯示，各組牙齦組織中Mφ均表達(dá)Gal-9。健康對(duì)照組牙齦組織中只觀察到極少量的CD68-Gal-9 雙陽(yáng)性細(xì)胞；輕度慢性牙周炎組CD68-Gal-9 雙陽(yáng)性細(xì)胞呈散在分布，且密度較健康對(duì)照組顯著增加；中度慢性牙周炎組CD68-Gal-9 雙陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加；重度牙周炎組牙齦組織中可見大量CD68-Gal-9 雙陽(yáng)性細(xì)胞；各組牙齦組織標(biāo)本的陰性對(duì)照未見熒光表達(dá)。統(tǒng)計(jì)CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞的密度，結(jié)果顯示，CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞密度在慢性牙周炎組均比健康對(duì)照組高（P＜0.01），在中度慢性牙周炎組較輕度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01），在重度慢性牙周炎組較輕、中度慢性牙周炎組顯著升高（P＜0.01）。見圖3。

討 論

牙周炎是牙齒支持組織的慢性感染性疾病，菌斑微生物通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子引發(fā)的宿主免疫反應(yīng)決定牙周炎的進(jìn)展［13］。Mφ 作為宿主免疫反應(yīng)的重要組成部分，在組織損傷或病原菌侵入時(shí)，可通過(guò)其表面的Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLR）識(shí)別清除病原菌并分泌多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答，在免疫反應(yīng)中起主要作用［14］。大量研究表明，Mφ 參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展。Mφ 作為牙周組織對(duì)抗牙周致病菌的第1道防線，通過(guò)吞噬作用清除病原體而減輕炎癥，但是其過(guò)度活化可破壞牙周組織，加重牙周炎的進(jìn)程。有研究顯示，牙周組織中的Mφ 主要為M1 型Mφ，同時(shí)可觀察到少量M2 型Mφ，齦溝液中可檢測(cè)到大量促炎因子和骨吸收因子，故M1 型Mφ 在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起主要作用［］。CD68 是Mφ 譜系中高度特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，可作為Mφ 的標(biāo)志物［7-10］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)慢性牙周炎患者的牙齦組織標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色觀察到，與健康對(duì)照組相比，慢性牙周炎牙齦組織中有大量CD68+細(xì)胞浸潤(rùn)，且CD68+陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量隨著牙周炎病變程度的加重而顯著上升，與Golijanin 等［17］的結(jié)果一致，表明 Mφ 譜系的 CD68+細(xì)胞參與牙周炎的進(jìn)程。

Tim-3 作為Tim 超家族的一個(gè)成員，近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)是一種免疫調(diào)控分子。Tim-3 被證實(shí)在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起抑制性調(diào)節(jié)作用，與程序細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）作用類似，主要促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡并誘導(dǎo)免疫耐受的發(fā)生［18］。Gal-9 是半乳糖結(jié)合蛋白家族的成員，N 端和C 端兩個(gè)CRD 區(qū)域共同組成了Gal-9 的結(jié)構(gòu)，主要決定T 淋巴細(xì)胞的受體識(shí)別及死亡信號(hào)的啟動(dòng)［19］。目前，許多研究者認(rèn)為Gal-9 是一種能影響多種免疫細(xì)胞的多效性調(diào)節(jié)分子［20］。Gal-9 是 Tim-3 的配體，在結(jié)構(gòu)上是一種獨(dú)特的“串聯(lián)重復(fù)序列”。研究發(fā)現(xiàn)Tim-3-Gal-9信號(hào)通路在免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。Tim-3 和 Gal-9 結(jié)合可誘導(dǎo) CD4+、CD8+T 細(xì)胞凋亡，阻斷Tim-3/Gal-9 可增加效應(yīng)和記憶性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量。CD8+T 細(xì)胞受抗原刺激后主要分化為Th1 和 Th2 細(xì)胞［4］。研究顯示，介導(dǎo)細(xì)胞免疫的 Th1和介導(dǎo)體液免疫的Th2 間的平衡與慢性牙周炎的間歇性和進(jìn)展性有關(guān)［21］。慢性牙周炎早期階段，在多形核中性粒細(xì)胞和Mφ 分泌的IL-12 的介導(dǎo)下，激發(fā)機(jī)體固有免疫功能，導(dǎo)致Th1 免疫應(yīng)答，Th1 細(xì)胞所產(chǎn)生的干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）參與Mφ 活化，產(chǎn)生M1型Mφ，誘導(dǎo)炎癥因子（如IL-1β、IL-2及IL-6）的產(chǎn)生，促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集和破骨細(xì)胞形成，加重炎癥反應(yīng)和牙槽骨的破壞，同時(shí)上調(diào)Gal-9 的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致Tim-3+Th1 細(xì)胞發(fā)生凋亡［22-23］。當(dāng)牙周炎進(jìn)行性破壞發(fā)展到晚期，Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答占主導(dǎo)地位，IL-4和IL-13等可參與調(diào)節(jié)B 細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng)并極化Mφ 為M2 型Mφ，通過(guò)產(chǎn)生IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 等抗炎型細(xì)胞因子抑制炎癥反應(yīng)，在炎癥后期階段促進(jìn)局部組織修復(fù)和再生，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡［15］。研究顯示，Th1 細(xì)胞的Tim-3表達(dá)與IFN-γ呈負(fù)相關(guān)，而Th2細(xì)胞的Tim-3與IL-4無(wú)關(guān)，提示Tim-3可能參與Th1/Th2平衡改變，下調(diào)Th1 免疫應(yīng)答可能影響Th1/Th2 免疫應(yīng)答平衡，促使免疫逃逸［21］。同時(shí)，有研究報(bào)道，病原感染而誘導(dǎo)Mφ 表達(dá)Tim-3 上調(diào)，可能參與該類細(xì)胞的激活及細(xì)胞因子分泌［24］。此外，Tim-3 可抑制致病性促炎M1型Mφ 的極化，而下調(diào)或阻斷Tim-3 可致M1 反應(yīng)增加并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，因此Tim-3 過(guò)表達(dá)可降低M1 型Mφ 的反應(yīng)以減弱炎癥［24-26］。de Oliveira 等［27］在根尖周疾病的研究觀察到，Tim-3/Gal-9 可能介導(dǎo)Mφ 極化，Tim-3 可抑制致病性促炎M1 型Mφ 極化，而下調(diào)或者阻斷Tim-3 可致M1 反應(yīng)增加，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果均提示Tim-3 和Gal-9 可通過(guò)調(diào)節(jié)Mφ 的作用而參與炎癥反應(yīng)。

Figure 2.Densities of CD68-Tim-3 double positive cells in gingival tissues（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=20. *P＜0.01 vs healthy control group；#P＜0.01 vs slight chronic periodontitis group；△P＜0.01 vs moderate chronic periodontitis group.圖2 各組牙齦組織CD68-Tim-3雙陽(yáng)性細(xì)胞比較

Figure 3.Densities of CD68-Gal-9 double positive cells in gingival tissues（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=20. *P＜0.01 vs healthy control group；#P＜0.01 vs slight chronic periodontitis group；△P＜0.01 vs moderate chronic periodontitis group.圖3 各組牙齦組織CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞比較

目前，Tim-3 及其配體Gal-9 在人慢性牙周炎牙齦組織Mφ 上的表達(dá)情況尚未清楚。本研究通過(guò)免疫熒光雙染色，首次證實(shí)了在人慢性牙周炎牙齦組織的Mφ 可表達(dá)Gal-9 和Tim-3。同時(shí)，結(jié)果顯示CD68-Tim-3雙陽(yáng)性細(xì)胞和CD68-Gal-9雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量隨牙周炎病變程度加重而增多，提示Gal-9 和Tim-3陽(yáng)性細(xì)胞可能參與慢性牙周炎的病程發(fā)展。Tim-3可通過(guò)與其配體Gal-9結(jié)合識(shí)別Mφ并調(diào)節(jié)其吞噬作用。結(jié)合Tim-3-Gal-9信號(hào)通路在免疫逃逸機(jī)制中的研究，我們的結(jié)果提示 Gal-9 和 Tim-3 陽(yáng)性 Mφ 對(duì)慢性牙周炎可能具有促進(jìn)作用，但Gal-9 和Tim-3 陽(yáng)性Mφ 如何參與慢性牙周炎的免疫調(diào)控機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。