賈 月，華 欣，劉思國

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院， 吉林 長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；3. 東北林業(yè)大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

近10 年來，隨著臨床上抗生素使用頻率的逐年增加，不斷出現(xiàn)新的細菌抗性機制，導致各種耐藥細菌相繼出現(xiàn)，對人畜健康造成巨大損害。多粘菌素（Polymyxin B）是陽離子多肽類抗生素，帶正電荷的多粘菌素與帶負電荷的類脂A結(jié)合，增加細胞膜的通透性，破壞革蘭氏陰性菌的細胞膜結(jié)構(gòu)，被認為是人類抵抗革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”[1]。然而，一些細菌對多粘菌素逐漸產(chǎn)生耐藥性，研究證實由質(zhì)粒介導的多粘菌素耐藥基因mcr-1 可在不同地區(qū)、不同種屬之間通過接合型質(zhì)粒相互傳播[2]。MCR-1 蛋白的氨基酸序列與磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族高度相似，具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性，作用于類脂A 的pNetN 部分；磷酸乙醇胺由R1 基團和R2 基團組成，在MCR-1 的催化下，R1 基團的?；I斷裂轉(zhuǎn)移至類脂A 的4 號位或1 號位上形成類脂A 復合物，降低了類脂A與多粘菌素的親和力[3-4]。因此，要延長多粘菌素作為臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的使用期限，研發(fā)高效的MCR-1 抑制劑是最可行的方法。

綿馬酚（Aspidinol）是鱗毛蕨科植物的主要活性成分，在香鱗毛蕨中較為常見。香鱗毛蕨的主要活性成分為酚類化合物，其中間苯三酚類化合物最為常見，具有抗炎癥、抗菌、抗病毒等活性，對于治療真菌性疾病有良好的效果。綿馬酚為單環(huán)間苯三酚類化合物，化學式為C12H16O4[5-7]?，F(xiàn)在對于綿馬酚的研究還很少，但由于間苯三酚類化合物具有的多種生理活性，國際上對綿馬酚的研究仍然十分關注。

本研究發(fā)現(xiàn)綿馬酚可以抑制MCR-1 蛋白活性，通過聯(lián)合藥敏試驗、殺菌效果測定、透射電鏡觀察菌體形態(tài)、質(zhì)譜檢測類脂A 的結(jié)構(gòu)及Biacore 大分子互作驗證綿馬酚與MCR-1 蛋白結(jié)合情況等實驗確定了綿馬酚具有抑制MCR-1 蛋白的抗多粘菌素的耐藥特性，從而為開發(fā)更多的MCR-1 蛋白抑制劑提供了相關實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購自BioFlux 公司，ExTaq、DL2000 DNA Marker、DL10000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker購自TaKaRa 公司，BamH Ⅰ、XhoⅠ、T4 連接酶購自Thermo 公司； 24 株mcr-1 陽性大腸桿菌，即JD01、JD02、 JD03、 JD04、 JD05、 JD06、 JD07、 JD08、JD09、JD010、JD11、JD012、ZD01、ZD02、ZD03、ZD04、ZD05、ZD06、ZD07、ZD08、ZD09、ZD10、ZD11 及ZD12，其中JD01～JD12 來源于黑龍江省某雞場，ZD01～ZD12 來源于黑龍江省某豬場，均由本實驗室于2016 年分離并保存；參考株ATCC25922 為本實驗室保存；pET-28a 載體、DH5α和BL21 感受態(tài)細胞均購自TaKaRa 公司；多粘菌素B、卡那霉素購自Sigma-Aldrich，純度均為98%；綿馬酚為本實驗室提取，純度為98%；LB 瓊脂培養(yǎng)基（LB Agar）、LB 肉湯培養(yǎng)基（LB Broth）購自美國BD醫(yī)療器械有限公司。

1.2 主要儀器Biacore 大分子互作儀購自美國GE公司，型號為Biacore T200；質(zhì)譜儀購自SCIEX 公司，型號為TripleTOF 6600。

1.3 聯(lián)合藥敏試驗采用棋盤微量稀釋法[8]測定綿馬酚（10 240 μg/mL）和多粘菌素（10 240 μg/mL）的最小抑菌濃度（MIC），然后依據(jù)CLSI 公布測定不同藥物組合對分離菌的抑制作用的標準方法，在96 孔板中加入100 μL 稀釋后的藥物，使多粘菌素的濃度由上到下依次降低2 倍，綿馬酚的濃度由左到右依次降低2 倍，隨后分別加入24 株mcr-1 陽性大腸桿菌分離株菌液100 μL（終濃度為5×105cfu/mL），37 ℃培養(yǎng)14 h～16 h，得出多粘菌素與綿馬酚聯(lián)合使用時各自的MIC，并根據(jù)綿馬酚及多粘菌素的MIC 值得到其FIC 指數(shù)[9]，F(xiàn)IC=（聯(lián)合時甲藥的MIC/甲藥的MIC）+（聯(lián)合時乙藥的MIC/乙藥的MIC），當FIC<0.5為協(xié)同作用，即兩種藥物聯(lián)合后的藥效大于同樣濃度的兩種藥物抗菌作用的總和；0.52 為拮抗作用，即兩種藥物聯(lián)合后的抗菌活性小于單獨一種藥物的抗菌作用。

1.4 綿馬酚聯(lián)合多粘菌素使用時對mcr-1 陽性大腸桿菌的殺菌效果的檢測根據(jù)1.3 結(jié)果進一步驗證綿馬酚聯(lián)合多粘菌素的殺菌效果，在2 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中復蘇mcr-1 陽性大腸桿菌JD08，37 ℃培養(yǎng)1 h，隨后向JD08菌株中分別加入終濃度為10 μg/mL的多黏菌素、終濃度為32 μg/mL 的綿馬酚和終濃度為10 μg/mL 的多黏菌素+32 μg/mL 的綿馬酚聯(lián)合作用各1管，置于37 ℃培養(yǎng)，分別于1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h 和12 h 各取100 μL 菌液加到LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上，倒置37 ℃過夜培養(yǎng)，次日進行細菌計數(shù)。根據(jù)活菌數(shù)繪制時間-活菌數(shù)曲線，同時以正常培養(yǎng)的JD08 菌株為陰性對照，驗證綿馬酚聯(lián)合多粘菌素使用時對mcr-1 陽性大腸桿菌的殺菌效果。

1.5 透射電鏡觀察mcr-1 陽性大腸桿菌菌體形態(tài)根據(jù)1.3及1.4實驗結(jié)果，由于經(jīng)過驗證綿馬酚單獨使用對mcr-1 陽性大腸桿菌無效，因此選取聯(lián)合作用試驗組進一步試驗。將mcr-1 陽性大腸桿菌JD08 菌液培養(yǎng)至OD650nm0.6 時分成三份，每份2 mL，取出2 份分別轉(zhuǎn)接入含10 μg/mL 多粘菌素的LB 液體培養(yǎng)基中及含10 μg/mL 的多粘菌素+32 μg/mL 的綿馬酚的LB 液體培養(yǎng)基中，另外一份作為陽性對照。將3 份菌液37 ℃培養(yǎng)4 h 后送哈爾濱獸醫(yī)研究所電鏡室進行透射電鏡觀察。

1.6 綿馬酚對MCR-1 蛋白的活性鑒定MCR-1 是一種磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，在磷酸乙醇胺存在的情況下，MCR-1 催化磷酸乙醇胺的酰基鍵斷裂，生成類脂A 復合物和甘油二酯。通過體外模擬MCR-1 催化磷酸乙醇胺反應，可檢測綿馬酚對MCR-1 的蛋白活性。本試驗采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法[10]分別提取mcr-1 陽性大腸桿菌JD08 菌株和含有16 μg/mL 的綿馬酚的mcr-1 陽性大腸桿菌JD08 菌株中類脂A，利用質(zhì)譜儀檢測類脂A 的結(jié)構(gòu)。

1.7 重組載體pET-28a-mcr-1 的表達與純化根據(jù)GenBank登錄的mcr-1基因序列（KP347127.1），使用primer premier 5.0 設計特異性引物：F-5'-ATGGATC CAGTGCGCCAAAAGATACCATTT-3'/R-5'-GATCTCGA GTCAGCGGATGAATGCGGT-3'， 以JD08 菌 液 為 模板，PCR 擴增mcr-1 基因，預計片段大小為987 bp。PCR 擴增程序：95 ℃5 min、94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃1 min 40 s，30 個循環(huán)，72 ℃7 min。PCR 擴 增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化后，與pEF-28a 載體均用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細胞，經(jīng)PCR 鑒定及酶切鑒定后提取質(zhì)粒由吉林省庫美生物科技有限公司測序。 將驗證正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21 感受態(tài)細胞，經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG 誘導表達后離心和超聲破碎，上清經(jīng)鎳柱親和層析純化，收集洗脫液進行SDS-PAGE 電泳，觀察蛋白的表達，然后超濾濃縮即為重組蛋白MCR-1，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 MCR-1 蛋白與綿馬酚的Biacore 分子互作檢測使用pH 4.0 的醋酸鈉溶液將MCR-1 蛋白偶聯(lián)至CM5 芯片，將CM5 芯片裝進儀器后用不同濃度（1.56 μmol/L、3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L）的綿馬酚溶液置于質(zhì)譜儀中，按照操作程序進行檢測，試驗結(jié)束后擬合MCR-1 蛋白與綿馬酚之間的結(jié)合情況。

2 結(jié) 果

2.1 聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果選取24 株mcr-1 陽性大腸桿菌菌株進行藥敏試驗，經(jīng)過聯(lián)合用藥和單獨用藥試驗，結(jié)果顯示，單獨使用綿馬酚時，mcr-1 陽性大腸桿菌對綿馬酚均耐藥；單獨使用多粘菌素時，其MIC 值大多數(shù)為8 μg/mL（13 株），少數(shù)為4 μg/mL（7 株）和16 μg/mL（4 株）；綿馬酚與多粘菌素聯(lián)合作用時，多粘菌素的MIC 值均降低至1 μg/mL（14 株）或2 μg/mL（10 株）。本實驗中聯(lián)合使用多粘菌素及綿馬酚的MIC 值比單獨使用多粘菌素時有著明顯的下降，其FIC 指數(shù)為0.07（2 株）、0.133（11 株）和0.258（7 株），均小于0.5，屬于協(xié)同作用，僅有4 株mcr-1 陽性大腸桿菌的FIC 指數(shù)為0.508，為相加作用（表1）。表明綿馬酚與多粘菌素聯(lián)合使用時對mcr-1 陽性大腸桿菌產(chǎn)生了協(xié)同效果，抑菌效果明顯高于單獨使用多粘菌素或綿馬酚時的抑菌效果。同時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)mcr-1 陽性大腸桿菌的MIC值為8 μg/mL， JD08 菌株最具代表性，因此選取JD08 菌株進行后續(xù)實驗。

2.2 綿馬酚聯(lián)合多粘菌素使用時對mcr-1 陽性大腸桿菌的殺菌效果的檢測結(jié)果向JD08 菌株中加入終濃度為10 μg/mL（10 倍MIC）的多黏菌素、終濃度為32 μg/mL（4 倍MIC）的綿馬酚和終濃度為10 μg/mL 的多黏菌素+終濃度為32 μg/mL 的綿馬酚聯(lián)合作用，活菌數(shù)計數(shù)結(jié)果顯示，單獨使用32 μg/mL 綿馬酚對于mcr-1 陽性的大腸桿菌JD08 無殺菌效果，其活菌量與正常培養(yǎng)的JD08 菌株相似；10 μg/mL 的多黏菌素對JD08 菌株幾乎無殺菌效果；32 μg/mL 的綿馬酚聯(lián)合10 μg/mL 的多黏菌素使用時對JD08 菌株有較好的殺菌效果，在8 h 時細菌基本死亡，未檢測到活菌（圖1）。表明聯(lián)合使用綿馬酚和多粘菌素對mcr-1陽性大腸桿菌有良好的殺菌效果。

2.3 透射電鏡觀察mcr-1陽性大腸桿菌菌體形態(tài)結(jié)果通過電鏡觀察正常培養(yǎng)的JD08菌株、10 μg/mL多粘菌素作用的JD08 菌株及10 μg/mL 多粘菌素+32 μg/mL綿馬酚的作用的JD08菌株，結(jié)果顯示mcr-1陽性大腸桿菌JD08 菌體形態(tài)較好，外膜完整，僅有輕微形變，可能是制作切片過程中的損傷（圖2A）；10 μg/mL的多粘菌素作用的JD08菌體內(nèi)容物少量流失，電子密度降低（圖2B）；10 μg/mL的多粘菌素及32 μg/mL的綿馬酚共同作用的JD08菌體形變明顯，內(nèi)容物流失嚴重，多數(shù)菌體只剩外膜結(jié)構(gòu)，同時觀察到較多蛋白類物質(zhì)，疑似菌體內(nèi)容物（圖2C）。表明聯(lián)合使用綿馬酚和多粘菌素對mcr-1 陽性大腸桿菌菌體的外膜產(chǎn)生了較大損傷，綿馬酚加劇了多粘菌素對mcr-1 陽性大腸桿菌的損傷程度，這些損傷可造成細菌死亡。

表1 不同來源的mcr-1 陽性大腸桿菌的多粘菌素與綿馬酚聯(lián)合藥敏實驗Table 1 MIC values of the polymyxin B and aspidinol combination therapy for different sources of mcr-1 positive E.coli

圖1 綿馬酚聯(lián)合多粘菌素對mcr-1 陽性大腸桿菌的殺菌曲線Fig.1 Time-killing curves of polymyxin B combined aspidinol against mcr-1 positive E.coli

2.4 綿馬酚對MCR-1蛋白的活性檢測結(jié)果采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法提取類脂A，如圖3A 所示，在mcr-1 陽性大腸桿菌JD08 中分離出的類脂大小為1 920.3 U，相比于未經(jīng)修飾的正常的類脂A（1 797.1 U）增加了大約123 U。而如圖3B 所示，在綿馬酚存在的情況下，MCR-1蛋白的作用受到抑制，發(fā)生轉(zhuǎn)移的?；I含量大大減少。MCR-1蛋白具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的作用，與使用綿馬酚處理的JD08菌株中未修飾的類脂A的比例相比，未使用綿馬酚處理的JD08菌株中經(jīng)過修飾的類脂A的比例發(fā)生了顯著改變。表明綿馬酚影響了MCR-1蛋白發(fā)揮催化活性，使類脂A形成了類脂A 復合物，而綿馬酚有抑制MCR-1 蛋白的作用，使形成的類脂A復合物大量減少。

圖2 透射電鏡觀察mcr-1 陽性大腸桿菌JD08 形態(tài)Fig.2 The morphology of mcr-1 positive E.coli JD08 under transmission electron microscope

圖3 質(zhì)譜檢測JD08 菌株中類脂A 的變化情況Fig.3 Detection of Lipid A in JD08 strain by Mass spectrometry

2.5 MCR-1 蛋白的表達與純化結(jié)果將經(jīng)過雙酶切驗證及測序正確的pET-28a-mcr-1 重組載體經(jīng)IPTG 誘導后表達MCR-1 蛋白，上清通過鎳樹脂純化后進行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示在38 ku 處有目的蛋白表達，與預期一致，表明正確構(gòu)建了pET-28a-mcr-1 重組載體（圖4），并且MCR-1 蛋白在上清表達。對表達上清純化后經(jīng)CA 定量試劑盒測得蛋白質(zhì)濃度為11.17 mg/mL（圖5）。

2.6 MCR-1 蛋白與綿馬酚的Biacore 分子互作檢測通過不同濃度的綿馬酚與偶聯(lián)至CM5 芯片上的MCR-1 蛋白相互作用，檢測MCR-1 蛋白與綿馬酚的親和力，Biacore 分析結(jié)果顯示，綿馬酚與MCR-1 蛋白相互作用響應值隨綿馬酚濃度增高不斷增強，根據(jù)擬合結(jié)果分析顯示，MCR-1蛋白與其小分子抑制劑的親和力常數(shù)為1.47 μmol/L（圖6）。表明兩者之間存在直接結(jié)合，綿馬酚屬于MCR-1蛋白的小分子抑制劑。

圖4 重組載體pET-28a-mcr-1 酶切驗證結(jié)果Fig.4 The digestion rusult of recombinant vector pET-28a-mcr-1

圖5 重組蛋白MCR-1 的SDS-PAGE 檢測Fig.5 Detection of purified MCR-1 recombinant protein by SDS-PAGE

圖6 Biacore 測定綿馬酚與MCR-1 蛋白之間相互作用力Fig.6 The interaction between Mianmatol and MCR-1 protein by Biacore

3 討 論

mcr-1 是2015 年首次被報道的由質(zhì)粒介導的多粘菌素耐藥基因[1]，自發(fā)現(xiàn)以來已在30 多個國家檢出，這表明mcr-1 基因已在全球范圍內(nèi)存在，在我國已有25 個省/自治區(qū)分離到了攜帶有mcr-1 基因的細菌[11]。同時，在動物源性食品和醫(yī)院感染病人樣品中也分離出了攜帶有mcr-1 基因的細菌。氨基酸序列分析結(jié)果顯示MCR-1 蛋白與已報道的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族約有60%的相似性，即MCR-1 蛋白可能具有磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶活性[1]。Zhou 等研究了紫檀芪和多粘菌素對mcr-1 陽性大腸桿菌產(chǎn)生了協(xié)同效果，其MIC 值由8 μg/mL 降低到1 μg/mL[11]。Lan 等通過虛擬篩選確定了1-苯基-2-（苯胺基）乙酮屬于MCR-1 抑制劑，并對此設計了1-苯基-2-（苯胺基）乙酮的衍生物。通過分子對接發(fā)現(xiàn)其中兩種衍生物6p和6q 可以通過氫鍵與Glu246和Thr285相互作用，并占據(jù)MCR-1 蛋白的空腔[12]。Zhou 等證實蛇床子素可恢復多粘菌素對mcr-1 陽性腸桿菌的抑菌活性[13]。

本實驗基于對mcr-1 基因的基礎研究上篩選和鑒定了MCR-1 蛋白的小分子抑制劑-綿馬酚，通過聯(lián)合藥敏實驗驗證了綿馬酚與多粘菌素聯(lián)合可顯著增強對mcr-1 陽性大腸桿菌的抑菌效果，其MIC 值由8 μg/mL 或16 μg/mL 降 低 到1 μg/mL 或2 μg/mL，殺菌實驗和透射電鏡觀察均表明單獨使用多粘菌素或綿馬酚均無法完全殺滅細菌，但聯(lián)合使用時具有顯著的殺菌效果。進一步證明綿馬酚能夠增加多粘菌素的殺菌效果，而多粘菌素是作用在類脂A 上發(fā)揮作用，MCR-1 為磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，同樣作用于類脂A 上，從質(zhì)譜檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過綿馬酚處理的未經(jīng)修飾的類脂A 含量相比經(jīng)過修飾的類脂A 含量多。Biacore 大分子互作結(jié)果也可以看出綿馬酚于MCR-1 蛋白屬于直接結(jié)合，因此綿馬酚很大可能是MCR-1 的小分子抑制劑。推測可能是由于綿馬酚能夠與MCR-1 蛋白的催化區(qū)域中的某個位點發(fā)生結(jié)合，使MCR-1 蛋白失活，無法生成類脂A 復合物，恢復了多粘菌素的功效，破壞革蘭氏陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)，造成細菌死亡。Stojanoski[14]、Hinchliffe[15]、Wei[16]、Xu[17]和Ma[18]等人通過實驗發(fā)現(xiàn)了E246A、T285A、K333A、H395A、H466A、H478A 等突變體恢復了多粘菌素對mcr-1 陽性菌的敏感性，本研究團隊將會針對以上涉及到的幾種重要的突變位點進行中重點研究，以明確多粘菌素耐藥關鍵蛋白MCR-1 的小分子抑制劑的作用機制，為開發(fā)MCR-1 抑制劑提供幫助。