蘇杰 郭榮起 高陽 于秀敏 李國婧 王瑞剛

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，包頭 014109；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點實驗室，呼和浩特010018；3. 呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，呼倫貝爾 162650；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，呼和浩特 010010）

液泡H+-ATPase（Vacuolar-type H+-ATPase，VATPase）是存在于真核生物（包括酵母、植物和動物）中的保守質(zhì)子泵［1］。它在亞細胞的酸化、pH和離子穩(wěn)態(tài)、內(nèi)吞和分泌轉(zhuǎn)運等過程中起重要作用［2］。V-ATPase由13個亞基組成，這種寡聚酶包含V1和V0結(jié)構(gòu)域。V1域位于膜內(nèi)的細胞質(zhì)中，由A-H亞基構(gòu)成，對ATP的水解起催化作用。V0域鑲嵌于膜上，由a、c、c''、d、e亞基構(gòu)成，是物質(zhì)進出膜內(nèi)通道的“開關(guān)”［3］。V-ATPase的c亞基（VHA-c）是V-ATPase組裝的關(guān)鍵，直接負責(zé)質(zhì)子的結(jié)合和跨膜運輸。在植物的V-ATPase中，只有c亞基由多基因編碼。例如，模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）c亞基有5個同源基因，即VHA-c1、VHA-c2、VHA-c3、VHA-c4和VHA-c5，GenBank登 錄 號 依 次 為At4g34720、At1g19910、At4g38920、At1g75630 和 At2g16510［4］。

關(guān)于擬南芥VHA-c基因已有大量研究。研究報道顯示，擬南芥VHA-c基因表達受外源激素和鹽脅迫等的調(diào)節(jié)。如Perera等［4］、徐萍等［5］研究表明ABA和鹽脅迫參與了擬南芥VHA-c亞基同源基因的表達調(diào)節(jié)。王瑞剛［6］證實擬南芥VHA-c基因的調(diào)控序列指導(dǎo)的GUS在轉(zhuǎn)基因煙草的表達受NaCl和植物激素等的調(diào)控。蘇杰等［7-8］前期研究發(fā)現(xiàn)，VHA-c1和VHA-c3可能參與ABA和糖介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Padmanaban等［9］通過RNA干擾技術(shù)（RNAi）研究發(fā)現(xiàn)vha-c1和vha-c3突變體對鹽脅迫敏感，同時VHA-c1和VHA-c3沉默降低了V-ATPase活性并抑制根的生長，表明VHA-c基因?qū)毎麛U增起重要作用。郭榮起［10］、韓曉東等［11］利用RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)VHA-c1可能通過影響H+-ATPase在鹽脅迫信號通路和ABA信號通路中起著不同的調(diào)控功能。

前人研究證實了擬南芥VHA-c亞基在植物響應(yīng)脅迫過程中可能具有重要的作用。但VHA-c亞基的特定功能以及在植物的生長發(fā)育過程中各亞基之間如何相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用目前尚不明確。

本研究通過構(gòu)建VHA-c2與VHA-c4雙沉默載體，獲得轉(zhuǎn)基因純合體，并對其進行鹽脅迫和ABA處理，進行了非損傷微測技術(shù)（Non-invasive micro-test technique，NMT）試驗，旨為探明VHA-c基因在植物生長發(fā)育及非生物脅迫應(yīng)答方面的機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型Columbia擬南芥種子由內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點實驗室保存，將植株于22℃，相對濕度60%，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)。菌株（根癌農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH5α）和質(zhì)粒載體（pHANNIBAL、pART27）均由內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點實驗室保藏。

1.2 方法

1.2.1VHA-c2&c4沉默載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 采用CTAB法［12］提取整株擬南芥基因組DNA。并以此為模板，以c2&c4-s-5/c2&c4-as-5和c2&c4-s-3/c2&c4-as-3為引物（表1）進行擴增。將PCR產(chǎn)物純化回收，利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切正義鏈片段和pHANNIBAL載體（圖1-A），連接后命名為pHAN-c2&c4-s，并進行測序鑒定。再利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切反義鏈片段和載體pHAN-c2&c4-s，連接后命名為pHAN-c2&c4-s-as，并進行測序鑒定。最后，用NotⅠ分別酶切pHAN-c2&c4-s-as質(zhì)粒和pART27載體（圖1-B），將獲得的2個目的片段c2&c4-s和c2&c4-as與載體pART27連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得目標(biāo)重組表達載體pART-c2&c4。

采用電擊法［13］將重組質(zhì)粒pART-c2&c4轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在LB固體培養(yǎng)基（25 μg/mL慶大霉素和100 μg/mL壯觀霉素）上篩選陽性克隆，進行菌落PCR鑒定，鑒定為陽性的重組菌GV3101/pART-c2&c4用于植物轉(zhuǎn)化。

1.2.2VHA-c2&c4沉默植株的篩選及純合體株系的獲得 將重組菌GV3101/ pART-c2&c4于LB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃培養(yǎng) 48 h。挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基（抗生素含量同上），28℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日，按照1∶100（體積比），將培養(yǎng)過夜的菌液重新接種于LB液體培養(yǎng)基（同上），28℃震蕩培養(yǎng)至A600nm1.2-1.6。離心后收集菌體，并用新鮮LB液體培養(yǎng)基重新懸浮菌體，使其A600nm約為 0.8，即制成重組菌GV3101/pART-c2&c4懸液。

圖1 RNAi表達載體

采用浸花法［14］將重組菌GV3101/pART-c2&c4轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株繼續(xù)在正常環(huán)境中培養(yǎng)約1個月，收取種子。在1/2 MS選擇培養(yǎng)基（含卡那霉素30 μg/mL）中，22℃培養(yǎng)種子10-12 d后，將陽性植株移至蛭石上培養(yǎng)，成熟后按單株收取種子（T1代）；T1代種子繼續(xù)按單株播種于含卡那霉素的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10-12 d后挑選發(fā)生1/3性狀分離的株系并移至蛭石上培養(yǎng)，成熟后按單株收取種子（T2代）；在含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選T2代種子，純合體株系將不再發(fā)生性狀分離，用于后續(xù)分析。

1.2.3VHA-c2&c4沉默植株中VHA-c2和VHA-c4沉默效果鑒定 （1）分別提取野生型擬南芥和VHA-c2&c4沉默植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，分別對內(nèi)參基因actin（GenBank登錄號:At3g12110，引物為actin-RT-F和actin-RT-R）和VHA-c2&c4（引物為c2-RT-PCR-F/R和c4-RT-PCR-F/R）進行PCR擴增（表1）。凝膠成像分析（Syngene公司凝膠成像儀）以上PCR產(chǎn)物。（2）對雙基因沉默較強的植株的沉默片段特異性進行測定:根據(jù)（1）的結(jié)果，挑取雙基因沉默較強的植株，以其反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，分別對VHA-c1-VHA-c5進行擴增，將其產(chǎn)物進行凝膠成像分析以檢測該株系的VHA-c1-VHA-c5的表達情況，進而檢測沉默片段的特異性。

表1 特異性引物與引入的酶切位點

1.2.4 NaCl處 理VHA-c2&c4沉 默 株 系 （1） 將VHA-c2&c4沉默株系和擬南芥野生型種子同時播種于1/2MS培養(yǎng)基，4℃春化3 d，于22℃、16 h光照/8 h黑暗條件培養(yǎng)5 d。然后同時移至含不同濃度NaCl（0、25、50、75、100、125 和 150 mmol/L）的1/8MS培養(yǎng)基上，16 h光照/8 h黑暗條件豎直培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計主根的長度。（2）將VHA-c2&c4沉默株系和擬南芥野生型種子同時播種于含125 mmol/L NaCl的1/2MS培養(yǎng)基。4℃春化3 d后置于22℃，16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)并開始計時，于24、48、72和96 h統(tǒng)計萌發(fā)率。

1.2.5 ABA處理VHA-c2&c4沉默株系 將VHA-c2&c4沉默株系和擬南芥野生型種子同時播種于1/2MS培養(yǎng)基，4℃春化3 d，22℃，16 h光照/8 h黑暗條件培養(yǎng) 5 d。然后分別移至含不同濃度ABA（0、4、8和12 μmol/L）的1/8MS培養(yǎng)基，16 h光照/8 h黑暗條件豎直培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計主根的長度。

1.2.6 NMT檢測VHA-c2&c4沉默株系H+的內(nèi)流 擬南芥VHA-c2&c4沉默株系和對照種子同時種于1/2MS培養(yǎng)基，4℃春化3 d，22℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng) 6 d。取其分生區(qū)200-300 μm的區(qū)域，在測試液中平衡15 min，檢測5 min，待吸收穩(wěn)定后加入 ABA（終濃度 100 μmol/L）［15］，再檢測20 min。

2 結(jié)果

2.1 VHA-c2&c4沉默株系的篩選與鑒定

將構(gòu)建好的基因沉默質(zhì)粒pART-c2&c4經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，利用卡那霉素篩選，最終獲得了7個T2代轉(zhuǎn)基因純合株系，分別命名為c2&c4-1、c2&c4-2、c2&c4-3、c2&c4-4、c2&c4-5、c2&c4-6和c2&c4-7。利用半定量PCR技術(shù)，在actin轉(zhuǎn)錄水平相同的情況下，比較7個基因沉默株系與野生型對照的VHA-c2和VHA-c4表達量。結(jié)果顯示，設(shè)定對照表達量為100%，7個沉默株系的VHA-c2表達量分別為4%、3%、10%、89%、78%、20%和18%，VHA-c4表達量分別為8%、2%、40%、29%、28%、46% 和 11%（ 圖 2）。 由 于 c2&c4-1、c2&c4-2和c2&c4-7這3個株系的雙基因沉默效率較高，因此將其用于后續(xù)分析。

由于VHA-c1-VHA-c5序列的同源性很高，通過對雙基因沉默較強的植株c2&c4-2的沉默片段特異性進行測定。結(jié)果顯示，設(shè)計的c2&c4-RNAi沉默片段特異性很好，只使VHA-c2和VHA-c4沉默，而VHA-c1、VHA-c3和VHA-c5的表達不受影響（圖3）。

圖2 沉默株系中VHA-c2&c4的表達水平

圖3 基因沉默株系c2&c4-2的VHA-c2&c4沉默特異性檢測

2.2 NaCl處理下VHA-c2&c4沉默株系的變化

2.2.1VHA-c2&c4沉默株系主根伸長變化 為進一步探明VHA-c參與響應(yīng)鹽脅迫的機理，將3個VHA-c2&c4強沉默株系在不同濃度NaCl培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測量主根長度，并計算主根相對伸長量。結(jié)果顯示，當(dāng)NaCl濃度≥100 mmol/L時，3個沉默株系的主根生長受到抑制，且主根相對伸長量比野生型對照減少。在100 mmol/LNaCl濃度下，3個株系主根的相對伸長量平均比對照分別減少11%、13%和16%；在125 mmol/L NaCl濃度下，分別減少6%、8%和4%（圖4）；但當(dāng)NaCl濃度達150 mmol/L時，轉(zhuǎn)基因純合體和野生型植株根的生長幾乎都被抑制（結(jié)果中未顯示）。這說明基因沉默株系抵抗鹽脅迫的能力較對照弱。

2.2.2VHA-c2&c4沉默株系種子萌發(fā)的變化 通過探究125 mmol/L NaCl對基因沉默株的種子萌發(fā)率的影響。結(jié)果顯示，125 mmol/L NaCl處理下，3個VHA-c2&c4沉默株系的種子萌發(fā)率比對照減少。24 h后，對照和基因沉默株系的種子開始萌發(fā)，但萌發(fā)均受抑制；在48 h時，3個株系的種子萌發(fā)率平均分別比野生型減少12%、15%和13%；72 h 時，平均分別比野生型減少15%、17%和12%；96 h時，平均分別比野生型減少14%、10%和12%（圖5）。說明VHA-c2&c4的沉默使種子對鹽脅迫的敏感度增大。

圖4 NaCl處理VHA-c2&c4沉默株系主根相對伸長量的變化

圖5 NaCl處理VHA-c2&c4沉默株系種子萌發(fā)率的變化

2.3 ABA處理VHA-c2&c4沉默株系主根伸長的變化

用ABA處理后，發(fā)現(xiàn)VHA-c2&c4沉默株系以及對照擬南芥的主根相對伸長量和子葉展開程度都受到不同程度的抑制，其中3個株系的表型較為明顯。ABA濃度越大，它們的主根生長被抑制的程度和子葉的黃化程度越大，且VHA-c2&c4沉默株系子葉的展開程度和主根長度比對照高（圖6-A，以c2&c4-7為例）。在4 μmol/L ABA濃度下，3個株系主根的相對伸長量比對照分別增長11%、17%和17%；在8 μmol/L ABA濃度下，分別增長2%、20%和21%；在12 μmol/L ABA濃度下，分別增長3%、23%和7%（圖6-B），表現(xiàn)出基因劑量依賴的效應(yīng)。

2.4 VHA-c2&c4沉默株系H+運輸能力的NMT測定

圖6 ABA處理VHA-c2&c4沉默株系主根相對伸長量的變化

NMT試驗可以在相對真實的生理環(huán)境狀態(tài)下，測得進出樣品細胞膜的離子濃度、流速和運動方向等參數(shù)。為進一步研究擬南芥基因沉默株系VHA-c2&c4的V-ATPase對H+的運輸能力，利用NMT技術(shù)對6日齡的基因沉默株系和對照的主根分生區(qū)進行測定。在100 μmol/L ABA處理300 s后，基因沉默株系的H+內(nèi)流現(xiàn)象非常顯著，而對照幾乎沒有H+內(nèi)流現(xiàn)象（圖7）。

圖7 NMT 技術(shù)測定擬南芥根部H+運輸能力

3 討論

Zhou等［16］通過c亞基表達量的變化影響植物根長、鮮重、高度等試驗證實V-ATPase c亞基影響細胞擴展。究其機理，可能是液泡中ATP釋放的能量可被V-ATPase利用，將H+泵到液泡腔使液泡酸化，從而使液泡中溶質(zhì)積聚而產(chǎn)生膨脹壓力，進一步促進細胞的擴展［9］。本研究通過dsRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了VHA-c2和VHA-c4共沉默載體，得到7個雙基因沉默株系。

V-ATPase在耐鹽脅迫方面起重要作用，它為H+偶聯(lián)的Na+逆向運輸?shù)鞍滋峁?qū)動力，例如Nhx1，它將鈉隔離在液泡中，從而有助于適應(yīng)鹽脅迫。例如，在一些植物中，鹽脅迫增強了泵的轉(zhuǎn)錄水平或活性［17］。冰葉日中花A、B、E亞基的轉(zhuǎn)錄水平因鹽脅迫而升高［18-19］，同時鹽脅迫增強了c亞基的轉(zhuǎn)錄水平，鹽處理過的幼苗VHA-c1和VHA-c2轉(zhuǎn)錄水平增加［9］。本研究發(fā)現(xiàn)NaCl處理下，基因沉默株系的主根相對伸長量和種子萌發(fā)率均小于對照，表明dsRNA介導(dǎo)的VHA-c2&c4沉默株系對鹽更敏感而且這兩個基因表達水平的共同減弱不能被其他VHA-c所取代。

ABA是一種參與高等植物生長發(fā)育、抗逆等諸多生理過程的植物激素。研究顯示，ABA可以誘導(dǎo)V-ATPase c亞基［5-8，11］。本研究用 ABA 處理VHA-c2&c4沉默株系后發(fā)現(xiàn):VHA-c2&c4沉默株系以及對照擬南芥的主根相對伸長量和子葉展開程度都受到不同程度的抑制；ABA濃度越大，它們的主根生長被抑制的程度和子葉的黃化程度越大，且c2&c4沉默株系子葉的展開程度和主根長度比對照高。VHA-c2&c4的沉默，使其對ABA的抑制不敏感，VHA-c2和VHA-c4可能參與了ABA介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而其機制還有待于進一步研究論證。

NMT試驗測定ABA處理下主根分生區(qū)的H+運輸能力，發(fā)現(xiàn)VHA-c2&c4沉默株系的H+內(nèi)流現(xiàn)象非常明顯，而野生型植株的H+運輸能力無明顯變化。表明VHA-c2&c4的轉(zhuǎn)錄水平降低，使得由其他VHA-c同源基因表達的c亞基裝配而成的V-ATPase活性增加，而野生型植株V-ATPase的活性卻未改變。

4 結(jié)論

獲得VHA-c2&c4沉默株系，VHA-c2&c4沉默株系對NaCl脅迫作用敏感，對ABA抑制作用不敏感。ABA促進雙沉默基因純合體株系的H+內(nèi)流能力。