鐘昌開 肖春麗 張賀 蒲金基 吳秋玉 劉燕莉 劉曉妹

摘? 要：本研究運(yùn)用同源克隆技術(shù)克隆了杧果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的Cglac3漆酶基因，并采用實時熒光定量PCR分析了該基因在侵染過程、漆酶基因LAC1突變體、外切葡聚糖酶基因CgCBH1突變體中的差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，杧果炭疽病菌漆酶Cglac3基因大小為1842?bp，含3個內(nèi)含子，大小分別為56、51、58?bp。Cglac3開放讀碼框編碼558個氨基酸，蛋白分子量為61.38?kDa，等電點(diǎn)（PI）為4.50。與未侵染對照0 h的表達(dá)量相比，Cglac3在6?h孢子萌發(fā)形成附著胞時表達(dá)量迅速升高，在12?h侵入寄主后達(dá)到最高，之后在菌絲擴(kuò)展、葉片顯癥過程中出現(xiàn)波動，但均遠(yuǎn)高于0 h的表達(dá)量，顯示Cglac3在侵染的不同階段均發(fā)揮著重要的作用，可能是膠孢炭疽菌的重要致病因子之一。與野生型相比，Cglac3表達(dá)量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1敲除突變體中下降了74%，在外切葡聚糖酶基因CgCBH1敲除突變體中下降了56%;在CgCBH1缺失敲除突變體中，LAC1的表達(dá)下降了68%，與Cglac3的表現(xiàn)趨勢一致，說明Cglac3的表達(dá)受LAC1調(diào)控，外切葡聚糖酶基因CgCBH1也會影響Cglac3和LAC1的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：杧果;漆酶;Cglac3基因;qRT-PCR中圖分類號：S432;Q78 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Sequence Characteristics of Laccase GeneCglac3 and Its Expression in Two Infection-Related Gene Mutants fromColletotrichum

gloeosporioides on Mango

ZHONG Changkai¹， XIAO Chunli¹， ZHANG He²， PU Jinji²， WU Qiuyu¹， LIU Yanli¹， LIU Xiaomei^1*

1. College of Plant Protection， Hainan University / Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： In this experiment， a laccase geneCglac3was cloned ?by homologously fromColletotrichumgloeosporioides， which is the fungal pathogen of mango anthracnose， and its expressions during infection process， in laccase gene Cglac1and exoglucanase gene CgCBH1deletion knockout mutants， were comparatively analyzed using real-time fluorescent quantitative PCR.Cglac3was 1842 bp in size with three introns of 56， 51 and 58 bp respectively. The open reading frame ofCglac3encoded 558 amino acids with a protein molecular weight of 61.38 kDa and an isoelectric point （PI） of 4.50.Cglac3was highly expressed at 6?h after inoculation when the fungal spores were germing and forming appressoria， increased rapidly at 12?h after inoculation when the fugus were invading. Since then， the expresson ofCglac3fluctuated during hyphal expansion and leaf necrosis， but both were much higher than the expression level at 0 h. It suggested that Cglac3played an important role duringC. gloeosporioidesinfection， might be a key virulent factor. Compared with the wild type， the expression ofCglac3decreased by 74% in theC. gloeosporioidesΔLAC1mutant， and decreased by 56% in theΔCgCBH1mutant. Interestingly， the expression ofLAC1was also decreased by 68% in theΔCgCBH1mutant， consistent with the trend ofCglac3expression， indicating thatLAC1 affected the expression ofCglac3， andCgCBH1affected both the expressions ofCglac3 andLAC1.

Keywords： mango; laccase;Cglac3gene; qRT-PCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.019

原產(chǎn)于“一帶一路”沿線南亞、東南亞等國家的杧果（Mangifera indicaL.）有著“熱帶果王”的美譽(yù)，近年來我國杧果產(chǎn)業(yè)得到了長足發(fā)展，已成為熱區(qū)重要的特色農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，面積和產(chǎn)量分別位居世界第3位和第5位，但在品種選育、栽培管理、病蟲害防治、采后保鮮加工等方面與上述原產(chǎn)國仍存在一定差距^[1]。

由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeos?porioi?desPenz. & Sacc.）引起的杧果炭疽病是影響該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一，該菌在細(xì)胞壁水解酶的協(xié)助下，主要借助芽管頂端產(chǎn)生的黑色素化的附著胞直接穿透寄主表皮侵入為害^[2]。

漆酶是多銅氧化酶，在黑色素合成途徑中起著重要作用。常以基因家族的形式廣泛存在于植物病原菌，成員幾個至十余個不等^[3-4]。來自同一病原菌漆酶家族中不同成員的蛋白序列并不具有較強(qiáng)的保守性，功能差異較大。目前得到較為系統(tǒng)研究的是玉米大斑病菌（Setosphaeria tur?cica）漆酶基因家族，發(fā)現(xiàn)了9個漆酶成員StLAC1～StLAC9，其中StLAC1、StLAC4、StLAC6屬于漆酶亞家族1，StLAC2屬于漆酶亞家族3^[5-6]。StLAC1和StLAC2基因在黑色素合成、附著胞穿透力和分生孢子形成等方面具有重要作用^[7]。StLAC1突變后黑色素合成受阻，菌落呈灰白色，生長速率減慢，不產(chǎn)生分生孢子，菌絲透明呈不規(guī)則狀，菌絲末端能形成附著胞，但因膨壓下降、侵染能力顯著降低、滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，漆酶、纖維素酶和果膠酶活性顯著下降^[8];與StLAC1不同之處，StLAC2突變后菌絲在玻璃紙上不能發(fā)育產(chǎn)生附著胞，長出的新菌絲只能在玻璃紙膜表面蔓延，不能穿透玻璃紙膜，無法侵入完整的玉米葉片，但能侵染刺傷的玉米葉片^[9];在突變體ΔStLAC1中，StLAC1完全不表達(dá)，其他黑色素合成酶基因表達(dá)量與野生型無明顯差異，而StLAC2表達(dá)量有所上調(diào)，起到了互補(bǔ)StLAC1的作用^[5]。相反，番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.Lyco?persici）的3個漆酶成員（lcc1、lcc3和lcc5）的缺失突變體對致病力均無影響，lcc1僅與氧化脅迫能力及漆酶酶活相關(guān)，lcc3僅與菌落生長速率、碳源利用、氧化脅迫以及對酚化合物的敏感性相關(guān)^[10-11]。更有甚者，大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）的漆酶基因VdLac對菌株的營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢、致病力以及黑色素合成均不影響^[12]。

前期研究從杧果炭疽病菌中搜索到了12個漆酶基因。漆酶基因LAC1調(diào)控分生孢子的產(chǎn)生、菌絲生長、發(fā)育、黑色素沉著、環(huán)境的適應(yīng)性;也調(diào)控漆酶和細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生，突變后不能侵入完整的杧果組織，只能侵染受傷的組織，但致病力顯著下降^[13-14]。本研究同源克隆、分析了漆酶基因Cglac3的序列特征，qRT-PCR分析了其在杧果炭疽病菌侵染寄主過程中、在漆酶缺失突變體ΔLAC1和外切葡聚糖酶基因缺失突變體ΔCg?CBH1中的表達(dá)變化，以期為后續(xù)揭示漆酶基因家族在C. gloeo?sporides的分子致病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1材料

供試菌株：膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹病害研究組提供。

1.2方法

1.2.1Cglac3基因序列特征? 用Fungal gDNA Kit（BioMiga）和Fungal RNA Kit（Tiangen）提取總DNA和RNA，并用TIANScript cDNA First- Stand Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考橡膠樹膠孢炭疽菌HBCg01基因組中ID號為A08557的漆酶基因設(shè)計擴(kuò)增Cglac3的引物（表1）。

1.2.2? qRT-PCR分析Cglac3在侵染過程中及其在突變體DLAC1和DCgCBH1中的表達(dá)變化? 參考吳秋玉等^[15]的方法，用qRT-PCR分析Cglac3在杧果炭疽病菌侵染杧果葉片0、6、12、24、36、48、72?h過程中的表達(dá)，以及在突變體DLAC1和DCgCBH1中的表達(dá)，確定Cglac3在侵染過程中的作用及其與漆酶基因LAC1、細(xì)胞壁水解酶外切葡聚糖酶基因CgCBH1之間的關(guān)系。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用DNAssist 1.0軟件比對分析Cglac3基因DNA和cDNA的序列。采用Primer 5.0 TMHMM、SignalP 4.1 Server等軟件分析Cglac3基因的序列特征。采用軟件包ExPASy中Computer/MW軟件分析蛋白序列。采用BioEdit軟件對Cglac3基因的編碼序列特征進(jìn)行分析。采用SOPMA軟件分析Cglac3基因的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。采用MEGA 7.0構(gòu)建Cglac3基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 ?結(jié)果與分析

2.1Cglac3基因DNA全長片段擴(kuò)增

根據(jù)獲得的Cglac3片段序列，以杧果炭疽病菌gDNA為模板，用引物5lac3-F1/R1、3lac3-F1/R1擴(kuò)增獲得了約1600?bp和1500?bp的片段（圖1A），測序拼接后全長為2797?bp，包括1842?bp編碼區(qū)序列以及5?端和3?端非編碼區(qū)466?bp和489?bp序列。與橡膠樹炭疽病菌HBCg01菌株的參考基因（A08557）有46個差異位點(diǎn)，用DNAssist軟件初步推測含有3個內(nèi)含子，開放讀碼框大小為1731?bp。

2.2Cglac3基因cDNA序列擴(kuò)增獲得

以杧果炭疽病菌gRNA為模板，用引物Rlac3- F1/R1擴(kuò)增獲得了約1700?bp的片段（圖1B），測序后與DNA序列拼接比對，發(fā)現(xiàn)了3個大小分別為56、51、58?bp的內(nèi)含子和1個大小1677 bp開放讀碼框，符合GT-AT法則。其雙鏈核苷酸分子量為1022.14?kDa，（G+C）含量為59.33%，（A+T）含量為40.67%，富含GC堿基。該序列已提交在GenBank，登錄號為MN338057。

2.3Cglac3基因預(yù)測蛋白的同源性以及預(yù)測蛋白的保守域分析

Cglac3開放讀碼框編碼558個氨基酸，SignalP 4.1 Server分析顯示前19個氨基酸是信號肽序列。Cglac3蛋白分子量為61.38 kDa，等電點(diǎn)（PI）為4.50，是一種堿性蛋白質(zhì)，富含極性氨基酸，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占12.72%，延伸鏈占27.78%，β-轉(zhuǎn)角占7.53%，無規(guī)則卷曲占51.97%（圖2）。

系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類顯示（圖3）：Cglac3蛋白與C. fructicolaextracellular dihydrogeodin oxidase gc5蛋白（XP_007273628.1）聚在同一分支上，相似性達(dá)94%，與C. gloeos?porioides multicopper oxidase Cg-14（EQB50152.1）基因編碼同源性也很高，相關(guān)性在90%?以上，與杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1、LAC2的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。該結(jié)果表明Cglac3蛋白可能與茶樹炭疽菌（C. fructicola）的oxidase類聚為一類，且與本課題組前期克隆自杧果炭疽病菌的漆酶基因LAC1和LAC2的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

利用NCBI的Blast進(jìn)行該基因保守結(jié)構(gòu)域分析（圖4），發(fā)現(xiàn)Cglac3蛋白中含有Cu-oxidase-3保守結(jié)構(gòu)域和多個Cu⁺結(jié)合位點(diǎn)，表明Cglac3基因是一種含銅的氧化酶（mul?tico?pper oxidase），本研究獲取Cglac3是漆酶基因。

2.4qRT-PCR分析Cglac3在侵染過程中及其在突變體ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表達(dá)變化

由表2可知，在侵染時間6～72?h范圍內(nèi)Cglac3基因都有表達(dá)，且表達(dá)差異明顯。與未侵染對照0?h的表達(dá)量相比，Cglac3在6?h孢子萌發(fā)形成附著胞時表達(dá)量迅速升高，在12 h侵入寄主后達(dá)到最高，為15.03，之后在菌絲擴(kuò)展、葉片顯癥過程中出現(xiàn)波動，但均遠(yuǎn)高于0 h的表達(dá)量（圖5A），可見Cglac3在侵染杧果葉片的不同階段均發(fā)揮著重要的作用，但在侵入期的作用更大。

與野生型相比，Cglac3表達(dá)量在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1缺失敲除突變體中下降了74%（0.26），在外切葡聚糖酶基因CgCBH1缺失敲除突變體中下降了56%，均達(dá)到顯著差異， LAC1的表達(dá)與Cglac3表現(xiàn)一致，也顯示出下降（下降了68%）（圖5B），表明LAC1調(diào)控Cglac3的表達(dá)，Cglac3和Cglac1的表達(dá)均受外切葡聚糖酶基因CgCBH1的影響。

3? 討論

漆酶是一種糖蛋白，由肽鏈、糖配基和Cu²⁺三個部分組成，來源不同的漆酶其氨基酸序列相似性不高，但在銅原子結(jié)合區(qū)域的保守性相當(dāng)髙^[14]。玉米大斑病菌漆酶基因家族中的9個成員StLAC1～ StLAC9，編碼550～613個氨基酸，相似性僅為19.79%～48.70%，StLAC1、StLAC4和StLAC6屬于漆酶亞家族1，StLAC2屬于漆酶亞家族3，但互補(bǔ)作用不僅存在于StLAC1、StLAC4和StLAC6之間，也在StLAC1和StLAC2之間存在^{[4， 9]}。杧果炭疽病菌中的漆酶基因LAC1編碼590個氨基酸^[16]，LAC2編碼594個氨基酸^[17]，本研究Cglac3編碼558個氨基酸，進(jìn)化樹顯示3個成員之間同源性很低，分別聚在不同分支上，可能屬于不同亞家族。根據(jù)LAC1和Cglac3在杧果炭疽病菌漆酶基因LAC1缺失敲除突變體和外切葡聚糖酶基因敲除突變體中表達(dá)推測，LAC1和Cglac3之間表達(dá)變化步調(diào)一致，可能存在協(xié)同作用，這與玉米大斑病菌中漆酶基因StLAC1和StLAC2之間的互補(bǔ)作用截然不同。

DHN黑色素合成途徑上有6個酶，漆酶是最后一步將1，8-二羥基萘（DNH）氧化形成黑色素的酶，理論上應(yīng)該只影響黑色素的合成，與其他侵染相關(guān)的細(xì)胞壁降解酶如外切葡聚糖酶無關(guān)，但本研究發(fā)現(xiàn)CgCBH1缺失后，LAC1和Cglac3的表達(dá)顯著下降，反饋性抑制了漆酶的表達(dá)。類似的現(xiàn)象在漆酶基因LAC1和果膠裂解酶基因Cgpel1、Cgpel2和Cgpel3之間也存在^[18]。

本研究分析了Cglac3基因的結(jié)構(gòu)和功能，并通過qRT-PCR分析Cglac3在侵染過程中及其在突變體ΔLAC1和ΔCgCBH1中的表達(dá)變化，本研究結(jié)果顯示，已從杧果炭疽病菌膠孢炭疽菌中克隆出Cglac3漆酶基因，Cglac3基因的全長cDNA的序列為1667 bp，開放讀碼框編碼558個氨基酸，蛋白分子量為61.38 kDa。Cglac3在杧果炭疽病菌侵染寄主的過程中發(fā)揮著重要作用，尤其在侵入后表達(dá)最高，是接觸初期的15倍。前期研究在杧果炭疽病菌中已發(fā)現(xiàn)漆酶家族成員12個，其中LAC1的功能已被敲除鑒定，主要調(diào)控分生孢子的產(chǎn)生、菌絲生長、發(fā)育、黑色素沉著、漆酶和細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生以及致病力。本研究結(jié)果顯示Cglac3與LAC1同源性很低，它與LAC1有何功能異同點(diǎn)或與其他漆酶基因是否有協(xié)同或互補(bǔ)作用有待進(jìn)一步的研究，該研究結(jié)果為后續(xù)鑒定其功能打下了基礎(chǔ)，有助于更加全面地了解漆酶基因家族在C. gloeosporides的分子致病機(jī)制，也能為未來設(shè)計新的殺菌劑提供理論依據(jù)。

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