黃金金 孫夢雪 王一洲 趙慶伊 張馨 張愷倪

摘要?Kar2p是分子伴侶蛋白，可與新生肽結(jié)合，促進(jìn)新生肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。為研究其對米黑根毛霉脂肪酶 （RML） 在畢赤酵母中表達(dá)的影響，通過PCR方法從畢赤酵母菌株中克隆到?KAR2?基因，并用畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒?KAR2?-pPIC3.5K。用電轉(zhuǎn)化的方法，將?KAR2?-pPIC3.5K二次轉(zhuǎn)化到含4-拷?貝rml基?因的畢赤酵母重組菌株4pRML-X33中，獲得能同時過表達(dá)RML和KAR2p的二次轉(zhuǎn)化子4pRML-X33-?KAR2?。搖瓶發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)?KAR2?基因?qū)晟L無明顯影響，但RML胞外酶活降低。采用RT-qPCR方法分析菌?中rml?及UPR相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)?KAR2?基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)了3.7倍，雖然僅引起與UPR相關(guān)的?HAC1?基因轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，但卻?使rml的?表達(dá)下調(diào)43%。說明?KAR2?過表達(dá)導(dǎo)致RML產(chǎn)量降低是降低了?rml?的mRNA量，而不是增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白折疊的壓力。

關(guān)鍵詞?米黑根毛霉脂肪酶;?KAR2?;過表達(dá);畢赤酵母;UPR

中圖分類號?Q78?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）14-0103-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.028

Abstract?Kar2p is a molecular chaperone that binds to new peptides and facilitates their entry into the endoplasmic reticulum （ER）.In order to study its effect on the expression of?Rhizomucor miehei?lipase （RML） in?Pichia pastoris，KAR2?gene was cloned from?Pichia pastoris?gDNA by PCR method.And it was ligated to vector pPIC3.5K to obtained the intracellular overexpression plasmid?KAR2?-pPIC3.5K.?KAR2?-pPIC3.5K was then transformed into?Pichia pastoris?recombinant strain 4pRML-X33 which containing 4 copies of?rml?gene used electroporation transformation method.The twice transformant 4pRML-X33- KAR2?that could overexpress both RML and KAR2p was obtained.Shaking flask fermentation found that overexpression of?KAR2?gene had no significant effect on strain growth，but the extracellular enzyme activity of RML decreased.Then?rml?mRNA level and transcription level of UPR-related genes were analyzed used RT-qPCR method.Results found that the transcription level of?KAR2?increased 3.7 times，and only caused downregulation of the transcription level of the?HAC1?gene associated with UPR，while?rml?mRNA decreased 43%.Those results suggested that the decrease in RML production after overexpression of?KAR2?was due to the reduction of?rml?mRNA，rather than increased the protein folding pressure in ER.

Key words?Rhizomucor miehei?lipase;?KAR2?;Overexpression;?Pichia pastoris;?UPR

巴斯德畢赤酵母?（Pichia pastoris）?作為異源基因的表達(dá)體系已有近30年的歷史，該表達(dá)體系成功表達(dá)了多種飼料酶、食品酶等，目前已發(fā)展成生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)最重要的工業(yè)宿主之一[1]。巴斯德畢赤酵母具有其他蛋白表達(dá)宿主不可替代的優(yōu)勢：嚴(yán)格的醇氧化酶啟動子調(diào)控機(jī)制;基因操作方法簡單;工業(yè)發(fā)酵過程成熟;內(nèi)源蛋白分泌少;可對異源蛋白進(jìn)行翻譯后修飾等[2]。2009年，巴斯德畢赤酵母完整的基因組序列被公布[3]。據(jù)統(tǒng)計，有超過5 000種異源蛋白在巴斯德畢赤酵母表達(dá)體系中成功表達(dá)[4]。目前在該表達(dá)體系中報道的異源蛋白產(chǎn)量最高的是里氏木霉纖維素酶，產(chǎn)量高達(dá)18 g/L[5]。

盡管畢赤酵母成功表達(dá)多種異源蛋白，但異源蛋白的產(chǎn)量受諸多因素影響。提高異源蛋白產(chǎn)量的研究主要集中在優(yōu)化培養(yǎng)條件[6]、啟動子類型[7]、外源基因密碼子[8]、外源基因拷貝數(shù)[9]以及蛋白折疊過程和分泌途徑的改造[10]。特別是在多拷貝重組菌株中共表達(dá)蛋白合成分泌途徑中的伴侶蛋白，以緩解因異源蛋白過表達(dá)引起的宿主蛋白折疊壓力和分泌阻力，從而達(dá)到增加異源蛋白產(chǎn)量的目的[10]。其中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白反應(yīng) （unfolded protein response，UPR） 相關(guān)的?HAC1、KAR2、PDI和ERO1等?基因的共表達(dá)可分別增加內(nèi)聚葡萄糖1[11]、生物表面活性劑HFPI[12]、人類免疫缺陷病毒Ⅰ型的抗體片段（2F5mAb）[13]和α-半乳糖苷酶[14]的產(chǎn)量。但不是共表達(dá)伴侶蛋白都可以提高蛋白產(chǎn)量，研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)?PDI?降低了豬胰島素前體在畢赤酵母中的表達(dá)水平[15]。

在4個UPR相關(guān)基因中，Kar2p可與新生肽結(jié)合，促進(jìn)其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[9]。研究表明在畢赤酵母中過表達(dá)?KAR2?基因雖然抑制了假黑盤菌素表達(dá)[16]，但提高了解脂耶氏酵母脂肪酶的表達(dá)[14]。但上述研究均未闡明異源蛋白產(chǎn)量變化的原因。可見針對不同的異源蛋白，在畢赤酵母中過表達(dá)?KAR2?基因?qū)ν庠吹鞍桩a(chǎn)量影響及機(jī)理不清楚。

米黑根毛霉脂肪酶?（Rhizomucor miehei?lipase，RML） 是一種重要的工業(yè)用酶，因其能夠催化水解、酯化、轉(zhuǎn)酯化和氨解等多種反應(yīng)，廣泛用于飼料、油脂加工、食品風(fēng)味改良、醫(yī)藥和能源等行業(yè)中 [9，17]。研究前期，獲得了一株胞外產(chǎn)RML的4-拷貝畢赤酵母重組菌株（4pRML-X33）[9]。目前沒有?KAR2?基因在多拷貝?rml畢赤?酵母重組菌中過表達(dá)對RML產(chǎn)量影響及機(jī)制的研究。該研究通過在4-拷貝的RML生產(chǎn)菌株（4pRML-X33）中過表達(dá)?KAR2?基因，探討其對RML胞外酶活的影響及機(jī)制，為研究異源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)提供新的參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?菌株及質(zhì)粒

巴斯德畢赤酵母野生型菌株X-33?（Pichia pastoris?X-33） 和含有4-拷貝?rml?基因的重組菌株 （4pRML-X33） 及胞內(nèi)蛋白表達(dá)載體pPIC3.5K系中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李穎教授實(shí)驗(yàn)室贈與。大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞 （CD501-02） 購買于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2?KAR2?基因克隆及過表達(dá)菌株構(gòu)建

1.2.1?D-2 buffer提取畢赤酵母基因組DNA （gDNA）。

在超凈臺中，用滅菌的牙簽挑取火柴頭大小的畢赤酵母單菌落于100 μL D-2 buffer[4 mol/L異硫氰酸胍，50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），5 mmol/L EDTA，0.1 mol/L β-巰基乙醇]中，輕輕混勻?；旌弦涸诜兴兄? min后置于冰上冷卻，12 000 r/min 離心2 min，棄上清。沉淀用200 μL無菌水洗滌，12 000 r/min離心2 min，棄上清。重復(fù)洗滌沉淀3次后，用20 μL無菌水懸浮。懸浮液在沸水中煮5 min后放冰上冷卻。12 000 r/min離心2 min，保存上清，獲得畢赤酵母的gDNA。吸取上清5～10 μL 用作PCR模板。

1.2.2?KAR2?基因過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。根據(jù)?KAR2?（GenBank： NC_012964.1） 的核苷酸序列設(shè)計擴(kuò)增引物?KAR2?-F： 5′-CGGGATCC （?Bam?H I） ACCATGCTGTCGTTAAAACCATCTTG-3′ 和?KAR2?-R： 5′-ATAAGAATGCGGCCGC （?Not?I） CTACAACTCATCATGATCATAGTCAT-3′。以X-33的gDNA為模板，?KAR2?-F 和?KAR2?-R 為引物，采用Q5 超保真DNA 聚合酶 （M0491，NEB） 克隆獲得?KAR2?基因。瓊脂糖凝膠電泳后回收?KAR2?基因片段。酵母胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5K和?KAR2?基因片段分別用?Bam?H I和?Not?I進(jìn)行雙酶切。雙酶切后的基因片段和載體用T4 DNA Ligase （M0202，NEB） 連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1，涂布到卡那霉素的LB平板上。待其長出單菌落，取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證的引物為5′AOX1 （5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′ ） 和3′AOX1 （5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′ ）。獲得?KAR2?的胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒?KAR2?-pPIC3.5K。

1.2.3?KAR2?基因過表達(dá)菌株的構(gòu)建。用?Bsp?E I線性化胞內(nèi)過表達(dá)質(zhì)粒?KAR2?-pPIC3.5K。將線性化的?KAR2?-pPIC3.5K二次電轉(zhuǎn)化到含有4-拷貝?rml?基因的重組菌株 （4pRML-X33） 中，電轉(zhuǎn)化的條件為1.5 kV、200 Ω和25 μF。轉(zhuǎn)化液涂布于含有G418 （250 μg/mL） 和Zeocin （100 μg/mL） 的YPDS （1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1 mol/L 山梨醇、2%瓊脂粉） 平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，長出過表達(dá)菌株的單菌落。單菌落在YPDS平板上劃線擴(kuò)大培養(yǎng)后，用D-2 buffer快速提取各菌株的gDNA。以gDNA 為模板，5′AOX1和?KAR2?-R為擴(kuò)增引物，擴(kuò)增?KAR2?基因，以篩選獲得正確的?KAR2?過表達(dá)菌株4pRML-X33-?KAR2?。同樣的步驟將pPIC3.5K電轉(zhuǎn)化到4pRML-X33中，篩選獲得只含有pPIC3.5K的重組菌株4pRML-X33-3.5K。

1.3?菌株搖瓶發(fā)酵及RML酶活檢測

1.3.1?搖瓶發(fā)酵。重組菌株4pRML-X33、4pRML-X33-3.5K和4pRML-X33-?KAR2?的搖瓶發(fā)酵方法參照文獻(xiàn)[9]。菌株在YPD平板上長出單菌落，將單菌落接種于BMGY 培養(yǎng)基（1%酵母粉、2%蛋白胨和1%甘油） 的三角瓶中，三角瓶裝液量為1/10。搖床28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600介于4.0～8.0，作為種子液。取種子液轉(zhuǎn)接到含有BMMY 培養(yǎng)基 （1%酵母粉、2%蛋白胨、1.0%甲醇、100 mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.0） 的三角瓶中，裝液量為1/10。三角瓶置于28 ℃搖床發(fā)酵、轉(zhuǎn)速為200 r/min。每24 h 向三角瓶中補(bǔ)加甲醇至其終濃度為1%?（V/V?），以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。當(dāng)酶活不再增加時停止發(fā)酵。每24 h取樣檢測菌株生長和胞外酶活。

1.3.2?NaOH滴定法檢測RML的酶活。

用無CO2的ddH2O 配制成5 mol/L的NaOH儲液，準(zhǔn)確稀釋成0.05 mol/L的工作液。用鄰苯二甲酸氫鉀確定儲液的準(zhǔn)確濃度。稱20 g PVA-1750于1 L蒸餾水中，反復(fù)加熱使之溶解。溶解液冷卻后用四層紗布過濾，并定容至1 L獲得2% PVA-1750。橄欖油與2% PVA-1750按體積比1∶3混合，乳化成PVA-橄欖油乳化液。取5 mL PVA-橄欖油乳化液和4 mL 0.1 mol/L pH 6.0的檸檬酸-磷酸鈉緩沖液于150 mL三角瓶中，置于水浴搖床中35 ℃、150 r/min，預(yù)熱10 min。將1 mL稀釋好的發(fā)酵液加到上述三角瓶中反應(yīng)10 min，用15 mL無水乙醇終止反應(yīng)。空白對照：將1 mL發(fā)酵液加入到15 mL無水乙醇中失活10 min，再加入到底物和緩沖液中。以酚酞作指示劑，0.05 mol/L NaOH進(jìn)行酸堿滴定反應(yīng)，直至溶液剛剛變?yōu)榉奂t色且30 s不褪色，記錄反應(yīng)消耗的NaOH體積。在該測定條件下，1 min釋放1 μmol脂肪酸的酶量定義為一個酶活單位。酶活計算公式：?V?NaOH×發(fā)酵液稀釋倍數(shù)×5。消耗的NaOH體積需處于1.0～2.5 mL，否則要對發(fā)酵液重新稀釋。

1.4?SDS-PAGE檢測目的蛋白

取1 mL 發(fā)酵后的菌液12 000 r/min離心5 min。上清與5× SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液混合。上樣緩沖液的成分為250 mmol/L Tris-HCl （pH 6.8）、5%?（W/V）?β-巰基乙醇、0.5% （?W/V）?BPB、10% （?W/V）?SDS和50%（?V/V）?甘油?；旌弦涸诜兴兄?0 min，室溫冷卻，作為SDS-PAGE樣品。SDS-PAGE 采用5%濃縮膠和12%分離膠，染色采用考馬斯亮藍(lán)R250染色法。具體方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.5?RNA提取及實(shí)時熒光定量PCR （Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）

1.5.1?畢赤酵母總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取搖瓶發(fā)酵96 h的菌體，用TRIzol法提取總酵母RNA[19]。TransScript Green兩步法RT-qPCR SuperMix （Transgen biotech Co.， Beijing，China） 將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5.2?RT-qPCR。RT-qPCR的方法參照文獻(xiàn)[9]，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因?（gap）?為內(nèi)參基因。不同之處是該試驗(yàn)采用ABI StepOnePlus系統(tǒng)，以ABI PowerUp SYBR Green Master Mix （A25742，ABI，USA）作為熒光染料。?gap、rml?和UPR相關(guān)基因?HAC1、KAR2、PDI、ERO1?的qPCR引物列于表1[9]。

2?結(jié)果與分析

2.1?過表達(dá)質(zhì)粒?KAR2?-pPIC3.5K的構(gòu)建

根據(jù)pPIC3.5K多克隆位點(diǎn)和?KAR2?基因的特點(diǎn)，在?KAR2?基因的上游和下游引物上分別引入?Bam?H I和?Not?I酶切位點(diǎn)。以X-33的gDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得?KAR2?基因，基因長度為2 037 bp （圖1 A）。用質(zhì)粒提取試劑盒提取pPIC3.5K載體，載體大小為9 004 bp （圖1B）。用?Bam?H I和?Not?I雙酶切?KAR2?基因片段和pPIC3.5K載體 （圖1C），并通過T4 DNA連接酶將二者連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提取轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒。用?Bam?H I和?Not?I雙酶切篩選重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)2條帶：一條大小約為2 037 bp，另一條約為9 004 bp （圖1D）。將?KAR2?-pPIC3.5K送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測定，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與GenBank： NC_012964.1中序列完全一致，獲得?KAR2?-pPIC3.5K重組質(zhì)粒。

2.2?過表達(dá)菌株4pRML-X33-?KAR2?的構(gòu)建及驗(yàn)證

按照前述方法，用?Bsp?E I線性化重組質(zhì)粒?KAR2?-pPIC3.5K后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的質(zhì)粒二次轉(zhuǎn)化到4pRML-X33中。G418和Zeocin雙抗性平板篩選得到4pRML-X33-?KAR2?轉(zhuǎn)化子 （圖2A）。將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行平板劃線擴(kuò)大培養(yǎng)，取3個轉(zhuǎn)化子用D-2 buffer 提取轉(zhuǎn)化子的gDNA。分別以3個轉(zhuǎn)化子的gDNA為模板，5AOX1和?KAR2?-R引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果見圖2B。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增到目的條帶，說明均為陽性轉(zhuǎn)化子，成功篩選到4pRML-X33-?KAR2?菌株。對照菌株4pRML-X33-3.5K是將pPIC3.5K線性化后電轉(zhuǎn)到4pRML-X33。

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