邢 鑫，崔鵬飛，崔嘉琦，谷文麗，張?jiān)?，范威峰，仲啟鑫，鄧?guó)華，陳化蘭

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科流感病毒屬，其基因組為8 個(gè)節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。AIV 包含16 種HA 亞型和9 種NA 亞型，且其HA 與NA 亞型組合多樣[1]。按照病毒對(duì)家禽的致病性可以將AIV 分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）[2]。其中，HPAIV 包含部分H5 和H7 亞型AIV，高致病性H5 亞型AIV 通常引起家禽的大規(guī)模死亡，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。常見(jiàn)的高致病性H5 亞型有H5N1、H5N6、H5N8 等組合，而H5N3 HPAIV 引起流感疫情的報(bào)道較少，僅在1961 年南非發(fā)生數(shù)千只燕鷗因感染H5N3 死亡[4]和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)家禽感染高致病性H5N3 死 亡 的 報(bào) 道[5]。H5N3 亞 型AIV 在 家 禽 中 屬 于 比較罕見(jiàn)的H5 亞型病毒組合之一，加上低致病力H5N3 亞型AIV 感染宿主后臨床癥狀不明顯，以至于人們對(duì)該類型病毒關(guān)注度較低。為了解我國(guó)H5N3亞型AIV 的部分生物學(xué)特性，本研究對(duì)2019 年我國(guó)廣西省分離到的一株H5N3 亞型LPAIV 進(jìn)行了全基因組序列分析、抗原性分析，及其對(duì)小鼠的感染性分析和受體結(jié)合特性分析。通過(guò)對(duì)該病毒株的生物學(xué)特性進(jìn)行探究，有利于獲得我國(guó)H5N3 亞型AIV的遺傳演化、抗原性與致病性的變化規(guī)律，能夠?yàn)橐咔榈念A(yù)警預(yù)報(bào)、防控措施的調(diào)整提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物低致病力H5N3 亞型AIV由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離并保存，其分離自2019 年春季廣西省禽流感監(jiān)測(cè)樣品，病毒命名為DK/GX/S11453/2019（H5N3）（簡(jiǎn)稱為DK/GX/S1453/19）；10 日齡SPF 雞胚購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；6 周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑病毒RNA 提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶及RNA 酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；EasyTaqDNA 聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；Big Dye Terminator 測(cè)序試劑盒3.1version 購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；受體試驗(yàn)所用α-2,3 和α-2,6 糖鏈由日本東京大學(xué)的Yasou Suzuki 博士惠贈(zèng)；雞H5 抗血清由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室制備；山羊抗雞IgG-HRP 購(gòu)自Southernbiotech 公司。

1.3 病毒的全基因組序列測(cè)定及遺傳演化分析

1.3.1 核酸的提取及RT-PCR 擴(kuò)增利用病毒RNA提取試劑盒提取病毒RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank 中H5 亞型AIV 同源性最高的序列區(qū)域設(shè)計(jì)所需擴(kuò)增片段的引物，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[6]，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小無(wú)誤后，利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

1.3.2 序列測(cè)定及遺傳演化分析以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，使用測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terminator處理后于ABI 測(cè)序儀中進(jìn)行基因序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果使用DNAStar 軟件中的Seqman 程序拼接全基因組序列，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，選擇與所測(cè)定基因序列核苷酸同源性相近的病毒株作為參考株基因序列。使用Megalign 同源性比對(duì)后應(yīng)用MEGA7.0 軟件繪制該病毒株表面基因的進(jìn)化樹(shù)，并分析其進(jìn)化關(guān)系。

1.4 抗原性差異分析將該H5N3 亞型AIV 測(cè)定血凝價(jià)后配制成標(biāo)準(zhǔn)的四單位抗原，四單位抗原驗(yàn)證準(zhǔn)確后按照標(biāo)準(zhǔn)的OIE HA-HI 方法進(jìn)行交叉HA-HI試驗(yàn)[7]，測(cè)定該病毒對(duì)不同分支H5 亞型AIV 血清的交叉血凝抑制效價(jià)。

1.5 小鼠感染性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]測(cè)定該分離株雞胚半數(shù)感染量（EID50）。利用干冰輕微麻醉小鼠后，使用106EID50/50 μL 的該病毒鼻腔感染8 只6 周齡的雌性BALB/c 小鼠，50 μL/只。另設(shè)5 只小鼠鼻腔接種50 μL PBS 作為空白對(duì)照。感染后第3 d 隨機(jī)安樂(lè)死3 只感染組小鼠，分別無(wú)菌采集每只小鼠的腦、鼻甲、脾臟、腎臟和肺臟，置于1 mL 含有雙抗的PBS離心管中，組織勻漿并離心后取上清液，接種10 日齡雞胚進(jìn)行組織病毒含量的滴定。剩余的小鼠連續(xù)觀察14 d 并記錄小鼠的體質(zhì)量變化及死亡情況。

1.6 病毒的受體結(jié)合特性分析采用糖鏈固相結(jié)合ELISA 的方法分析DK/GX/S1453/19 病毒株的受體結(jié)合特性：將α-2, 3 和α-2, 6 糖鏈分別以初始濃度為100 ng/μL 二倍倍比稀釋后以100 μL/孔的劑量包被ELISA 板，放入交聯(lián)儀中使用紫外照射10 min，使用預(yù)冷的PBS 洗滌4 遍。將病毒配制為64 單位抗原，以100 μL/孔包被ELISA 板。4 ℃孵育過(guò)夜后使用 預(yù) 冷 的0.1%PBST 洗 滌4 遍，預(yù) 冷 的PBS 洗 滌 一遍。加入100 μL 10%的福爾馬林室溫作用30 min，以去除NA 的活性。使用相同的方法洗滌后加入100 μL 1∶400 稀釋的雞H5 抗血清，37 ℃作用1 h。洗滌后加入100 μL 1∶1 500 稀釋的山羊抗雞IgG-HRP，37 ℃作用1 h。洗滌后在避光條件下加入100 μL OPD顯色液，顯色5 min～10 min，根據(jù)其顏色變化及時(shí)加入50 μL 0.5 mol/L H2SO4。在 酶 標(biāo) 儀 上 讀 取OD490nm值。使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制圖。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的遺傳演化分析結(jié)果將DK/GX/S1453/19病毒株各基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的片段，膠回收后進(jìn)行基因序列的測(cè)定，測(cè)定的基因序列使用Seqman 程序拼接全基因組序列。將病毒株的全基因組序列分別經(jīng)NCBI BLAST 比對(duì)，繪制表面基因進(jìn)化樹(shù)并進(jìn)行遺傳演化分析。全基因組序列比對(duì)結(jié)果顯示，DK/GX/S1453/19 病毒株HA、NA 兩個(gè)表面基因片段均與我國(guó)2017 年于重慶分離到的一株鴨源A/duck/Chongqing/S4362/2017（H5N3）（登錄號(hào)為MN171428.1）親緣關(guān)系最近（圖1、圖2）。兩株病毒的HA 與NA 基因的核苷酸序列同源性分別為98.41%和99.50%，表明兩株病毒的表面基因可能來(lái)源相同。DK/GX/S1453/19 各基因節(jié)段與核苷酸同源性最高病毒株的同源性如表1 所示，除了與HA 與NA 基因的同源性最高病毒為同一病毒株，與其余基因片段PB2、PB1、PA、NP、M 與NS基因的核苷酸同源性最高病毒株均不相同，內(nèi)部基因表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。該病毒株和當(dāng)前優(yōu)勢(shì)流行株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其基因來(lái)源具有野鳥(niǎo)源性，且進(jìn)化來(lái)源較為原始。

表1 與各基因節(jié)段核苷酸同源性最高的病毒株Table 1 The virus strains with the highest homology with each segment nucleotide

特殊位點(diǎn)的氨基酸序列分析顯示，DK/GX/S1453/19 病毒株的HA 蛋白裂解位點(diǎn)處的序列為PQRETR/GLF，僅含有一個(gè)堿性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征。HA 蛋白糖基化位點(diǎn)的變化與病毒的抗原性與致病性密切相關(guān)，本研究中的病毒株含有7 個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)（以H3 亞型為標(biāo)準(zhǔn)），分別為20NNS22、21NST23、33NNT35、169NNT171、289NSS291、483NGT485、541NGS543。HA 蛋白的受體結(jié)合特性決定了流感病毒的宿主特異性，以H3 亞型HA 為模板分析影響HA受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸序列，結(jié)果顯示該病毒株的aa138、aa226 和aa228 位為典型的禽型受體氨基酸特征，即為138A、226Q、228G。此外還存在160A 的人型受體氨基酸特征，至于133S 位點(diǎn)能否影響病毒的受體結(jié)合特性，還有待進(jìn)一步研究。M1 蛋白存在N30D 和T215A可以增強(qiáng)H5N1 AIV對(duì)小鼠的致病力[9]，該病毒的M1蛋白具有30D 和215A 的分子特征。同時(shí)NS1 蛋白未見(jiàn)80～84 位的頸部缺失現(xiàn)象，其aa42 位為S，已有文獻(xiàn)報(bào)道NS1 蛋白P42S 可以增強(qiáng)H5 亞型AIV 對(duì)小鼠的致病力[10]。上述結(jié)果表明，DK/GX/S1453/19 病毒株為一株低致病力AIV，但其存在可能感染哺乳動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 抗原性差異分析結(jié)果將DK/GX/S1453/19 病毒株與實(shí)驗(yàn)室保存的H5 亞型的各分支參考病毒株的標(biāo)準(zhǔn)血清進(jìn)行HA-HI 試驗(yàn)?？乖苑治鼋Y(jié)果具體見(jiàn)表2，表明該病毒株與近幾年使用的各個(gè)H5 疫苗株的抗原差異性較大。

2.3 小鼠的感染性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)Reed-Muench[6]法計(jì) 算，DK/GX/S1453/19 病 毒 株 為106.68EID50/100 μL。將該病毒株以106EID50/50 μL 的劑量鼻腔感染小鼠，3 d 后取樣進(jìn)行臟器滴定，結(jié)果顯示，DK/GX/S1453/19 病毒株可在小鼠肺臟和鼻甲內(nèi)有效復(fù)制，病毒滴度 分 別 為3.12 log10EID50/mL 和1.33 log10EID50/mL，但病毒不能在小鼠的腦、脾臟和腎臟內(nèi)復(fù)制（圖3）。其余小鼠連續(xù)觀察14 d，結(jié)果顯示，小鼠無(wú)明顯的臨床癥狀和體質(zhì)量下降情況（圖4）。以上結(jié)果表明DK/GX/S1453/19 病毒株對(duì)小鼠呈現(xiàn)低致病力。

圖1 DK/GX/S11453/2019(H5N3)病毒株的HA 基因進(jìn)化樹(shù)Fig.1 The phylogenetic tree of the HA gene of DK/GX/S11453/2019(H5N3)

圖2 DK/GX/S11453/2019(H5N3)病毒株的NA 基因進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The phylogenetic tree of the NA gene of DK/GX/S11453/2019(H5N3)

2.4 H5N3 亞型AIV 的受體結(jié)合特性分析結(jié)果采用糖鏈固相結(jié)合ELISA 的方法分析DK/GX/S1453/19病毒株的受體結(jié)合特性，分析結(jié)果顯示，該病毒株對(duì)α-2, 3 和α-2, 6 受體的結(jié)合能力均較弱，其中結(jié)合α-2,3 受體的能力要略強(qiáng)于α-2,6 受體（圖5）。表明，DK/GX/S1453/19 病毒株同時(shí)具有結(jié)合人源受體和禽源受體的能力。

表2 DK/GX/S11453/2019(H5N3)病毒株的抗原差異分析結(jié)果Table 2 The results of antigenicity analysis of DK/GX/S11453/2019(H5N3)

圖3 感染3 d 后小鼠臟器滴定結(jié)果Fig.3 Viral titers in the organs of mice at 3 d post-inoculation

圖4 小鼠感染后體質(zhì)量變化Fig.4 Weight change of mice post-inoculation

圖5 DK/GX/S11453/2019(H5N3)病毒株的受體結(jié)合特異性分析Fig.5 Characterization of the receptor binding properties of DK/GX/S11453/2019(H5N3)

3 討 論

本研究中DK/GX/S1453/19 病毒株是從我國(guó)廣西壯族自治區(qū)分離得到，遺傳演化分析表明HA 與NA片段均與2017 年來(lái)源于重慶的一株鴨源H5N3 核苷酸同源性最高，兩株病毒的表面基因可能來(lái)源于同一祖先。分析與該病毒株表面基因同源性相近的幾株國(guó)內(nèi)H5N3 發(fā)現(xiàn)，這些H5N3 的HA 片段和蒙古國(guó)分離的一株H5N7 病毒株相近，而NA 片段也與蒙古國(guó)的一株H10N3 親緣關(guān)系較近，說(shuō)明國(guó)內(nèi)近幾年的H5N3 亞型AIV 有可能由野鳥(niǎo)傳入。并且，這些病毒株內(nèi)部基因均具有明顯的遺傳多樣性，分別與不同來(lái)源的H5N3、H6N2、H4N6 等病毒親緣關(guān)系密切。早期國(guó)外有學(xué)者在野鳥(niǎo)體內(nèi)分離到H5N3 病毒株，其基因來(lái)源也呈現(xiàn)明顯的遺傳多樣性[11-12]。另外有研究報(bào)道，2002 年以來(lái)，我國(guó)華南地區(qū)分離的H5N3 病毒株是由不同AIV 形成的重配病毒株[13]。以上研究均說(shuō)明H5N3 病毒株的產(chǎn)生可能是由于不同病毒株在野鳥(niǎo)體內(nèi)攜帶和傳播過(guò)程中發(fā)生了基因重排現(xiàn)象。抗原性分析結(jié)果表明，該病毒株和各疫苗株之間的抗原差異性較大，與最早使用的Re-5 疫苗株抗原性類似，這樣從病毒抗原性上來(lái)分析，新分離的H5N3 亞型病毒與我國(guó)早期出現(xiàn)的病毒抗原性相似，而與近幾年家禽體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)病毒株差異明顯。

HA 蛋白糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和分布與其功能密切相關(guān)[14]，已有研究報(bào)道，當(dāng)在2009 年甲型H1N1流感病毒HA 蛋白上添加額外的糖基化位點(diǎn)后，突變病毒對(duì)小鼠和雪貂的致病性降低[15]。此外，H5N1亞型AIV 的HA 蛋白在158 位氨基酸殘基發(fā)生糖基化修飾可以降低病毒對(duì)小鼠和雪貂的致病性[16-17]。本研究使用的病毒株HA 蛋白含有7 個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，并不包含已報(bào)道的158 位氨基酸殘基糖基化位點(diǎn)，關(guān)于這些糖基化位點(diǎn)是否會(huì)影響病毒的抗原性與致病性還有待深入研究。受體結(jié)合位點(diǎn)分析表明本病毒株HA 蛋白在138A、226Q、228G 位點(diǎn)表現(xiàn)為典型禽型受體類型的特征，但160A 表現(xiàn)為人型受體分子特征，這一分子特征與受體結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果一致，即為DK/GX/S1453/19 病毒株具有同時(shí)結(jié)合α-2, 3 和α-2,6 受體的能力。有研究報(bào)道H5 病毒株受體結(jié)合位點(diǎn)S133A 可增強(qiáng)病毒與α-2, 6 受體結(jié)合的能力[18]，至于本研究中發(fā)現(xiàn)的133S 是否會(huì)影響受體結(jié)合能力，還有待于進(jìn)一步探究。已有研究表明，M1 蛋白的N30D 和T215A 突變，以及NS1 蛋白的P42S 突變均會(huì)增強(qiáng)H5 亞型AIV 對(duì)小鼠致病力[9-10]，本研究中的病毒株存在M1 蛋白的30D 和215A，NS1 蛋白的42S 這些分子特征，但該病毒株對(duì)小鼠并未表現(xiàn)出高致病力，說(shuō)明該病毒株可能還存在其他會(huì)影響致病力的因素。雖然該病毒株對(duì)小鼠低致病力，但病毒可以在小鼠肺臟和鼻甲內(nèi)有效復(fù)制，存在一定的感染哺乳動(dòng)物及人類的風(fēng)險(xiǎn)。該H5N3 病毒株的出現(xiàn)也充分表明當(dāng)前我國(guó)家禽面臨的AIV 感染風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)加大監(jiān)測(cè)力度，密切關(guān)注這些新亞型病毒株在家禽中出現(xiàn)的頻率和波及面，以及病毒抗原性差異，為我國(guó)禽流感的綜合防控提供數(shù)據(jù)支持。