李 華，漢武嬌，牛 超，潘榮輝，姜艷平，崔 文，李一經(jīng),2,，徐義剛,2,*

（1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2. 黑龍江省動物疾病防控技術(shù)與制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；3. 吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130062）

隨著我國寵物行業(yè)的興起及其規(guī)模不斷擴(kuò)大，寵物貓飼養(yǎng)數(shù)量逐漸增加，貓瘟、貓獲得性免疫缺陷病、貓白血病、貓傳染性腹膜炎等病毒性傳染病也隨之呈現(xiàn)蔓延趨勢，嚴(yán)重危害寵物貓的健康并制約著寵物業(yè)的發(fā)展[1]。疫苗接種是預(yù)防病毒性疾病的主要措施，然而目前市場上缺乏有關(guān)貓病毒性疾病的疫苗產(chǎn)品，以及有效的臨床治療制劑，只能根據(jù)患病貓不同臨床癥狀而采取對應(yīng)的治療方案，不僅治療費(fèi)用昂貴，而且患病貓治愈率低。因此，研制能有效地治療貓病毒性疾病的治療制劑，對保障寵物貓的健康養(yǎng)殖具有重要意義。

白介素18（IL-18）屬于IL-1 家族成員，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有良好的抗病毒感染作用，可誘導(dǎo)IFN-γ合成，調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子的生成[2-3]。同時(shí)，IL-18 能有效刺激T 細(xì)胞增殖，可直接激活CD8+T 細(xì)胞，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性，在病毒的清除中起著重要作用[4-7]。因此，本研究基于IL-18 在抗病毒感染、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等方面具有的生物學(xué)作用及其潛在的應(yīng)用價(jià)值，以貓IL-18 為研究對象，克隆貓IL-18 編碼基因進(jìn)行原核表達(dá)，并對其產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性分析，以期為貓IL-18 制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動物水泡性口炎病毒（VSV）、貓冠狀病毒（FCoV）由本實(shí)驗(yàn)室保存；F81細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；rTaq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、質(zhì)粒pMD19-T simple 購自寶生物工程（大連）有限公司；TRIzol 購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；ReverTra Ace 高效逆轉(zhuǎn)錄酶購自東洋坊（上海）生物科技有限公司；3C蛋白酶、polyI:C 購自NEB 公司；DNA 膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）公司；His 標(biāo)簽蛋白Ni 柱親和純化柱購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；F81 細(xì)胞、可溶性表達(dá)載體pCold-TF、大腸桿菌感受態(tài)TG1 和BL21 由本實(shí)驗(yàn)室保存；商用貓IFN 購自上海融棋貿(mào)易公司；健康貍花貓購自哈爾濱專業(yè)寵物市場；SPF級BALB/c小鼠購自遼寧長生實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 中登錄的貓IL-18 基因序列（NM_001009213），利用Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增貓IL-18 的PCR 引物：5'-GGTACCATGGCTGCTATACCAGTAGAT-3'（上游引物IL-18-F，含BamH I位點(diǎn)）和5'-GGATCCCTAATTCTTGTTTTGAACAGTGA-3'（下游引物IL-18-R，含Kpn I 位點(diǎn)），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定取2 mL 100 TCID50的VSV 病毒液，聯(lián)合500 μL 濃度為1.0 mg/mL 的poly I:C 持續(xù)注射實(shí)驗(yàn)貓3 d，每天一次，于第10 d 迫殺實(shí)驗(yàn)貓，無菌分離實(shí)驗(yàn)貓脾臟。取0.2 g 脾臟組織，剪碎，加入適量DMEM 培養(yǎng)液，采用液氮研磨法將脾臟組織研磨成勻漿液，取300 μL 勻漿液，采用TRIzol 法提取總RNA，經(jīng)ReverTra Ace 高效逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以cDNA 為模板，PCR 擴(kuò)增貓IL-18 基因，PCR 條件為：95 ℃5 min；94 ℃30 s、62 ℃30 s、72 ℃45 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用DNA 膠回收試劑盒回收純化目的基因。將純化的PCR 產(chǎn)物與pMD19-T simple 連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)測序（吉林庫美生物公司）篩選陽性克隆，陽性重組質(zhì)粒命名為pMD-IL-18，并分析貓IL-18基因的同源性。將pMD-IL-18 和表達(dá)載體pCold-TF分別經(jīng)BamH I 和Kpn I 雙酶切，回收目的片段，經(jīng)T4 DNA 連接酶連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 中，經(jīng)培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，采用酶切和PCR方法鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCold-IL-18，陽性重組菌命名為pCold-IL-18/BL21。

1.4 貓rIL-18 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化將過夜活化的重組菌pCold-IL-18/BL21 按1∶100 的比例接種于10 mL含Amp+抗性的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm約 為0.5 時(shí)，加 入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)6 h，離心收集菌體，超聲破碎，以IPTG 誘導(dǎo)的空載體菌和未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌為對照，利用12%SDS-PAGE 檢測目的蛋白的表達(dá)。通過His 標(biāo)簽蛋白Ni柱親和純化重組蛋白（rIL-18），經(jīng)3C蛋白酶處理后再次通過Ni 柱親和純化rIL-18，經(jīng)SDS-PAGE 分析純化效果，將目的蛋白分裝后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 貓rIL-18 促脾淋巴細(xì)胞增殖活性的檢測取BALB/c 小鼠和貓脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL，分 別 加 入 濃 度 為5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 和100 μg/mL 的貓rIL-18 共培養(yǎng)60 h，同時(shí)設(shè)RPMI1640 培養(yǎng)液對照組和ConA 陽性對照組，采用MTT 法檢測淋巴細(xì)胞的增殖情況。

1.6 貓rIL-18 聯(lián)合臨床用干擾素（IFN）的抗病毒效果評價(jià)采用微量細(xì)胞病變抑制法檢測貓rIL-18 協(xié)同商用貓IFN 的抗病毒效果。將F81 細(xì)胞接種于96孔板于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至長滿單層后，每孔加入100 μL 經(jīng)DMEM（含終濃度為25 μg/mL 的貓rIL-18）10 倍倍比稀釋的商用貓IFN，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。然后，分別接入MOI 1 的VSV、FCoV 病毒液，同時(shí)設(shè)立IFN 對照組、病毒對照組以及F81 細(xì)胞對照組。當(dāng)病毒對照組出現(xiàn)約80%的細(xì)胞病變時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入染色液（20%乙醇+0.05%結(jié)晶紫水溶液）室溫作用30 min，然后加入脫色液（50%乙醇+0.1%乙酸溶液）室溫作用5 min 后，測OD540nm值。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定結(jié)果采用VSV 結(jié)合poly I:C 方法刺激實(shí)驗(yàn)貓，分離貓脾臟，采用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，以其為模板，PCR 擴(kuò)增貓IL-18 基因，結(jié)果顯示，獲得大小為579 bp的目的基因（圖1），測序后與GenBank中登錄的貓IL-18序列進(jìn)行比較，同源性最高為99.3%。將目的基因克隆至原核可溶性表達(dá)載體pCold-TF并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，重組菌經(jīng)培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I 和Kpn I 雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，獲得與預(yù)期大小相符的目的條帶（圖2），表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCold-IL-18，將重組菌命名為pCold-IL-18/BL21。

圖1 貓IL-18 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of gene encoding feline IL-18 by RT-PCR

圖2 重組質(zhì)粒pCold-IL-18 的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Digestion analysis of pCold-IL-18

2.2 貓rIL-18 的誘導(dǎo)表達(dá)及純化結(jié)果重組菌pCold-IL-18/BL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)，超聲裂解菌體后經(jīng)SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示，在約70 ku 處表達(dá)出目的蛋白（圖3A）。采用His 標(biāo)簽蛋白Ni 柱親和純化重組蛋白，將純化的重組蛋白進(jìn)一步經(jīng)3C 蛋白酶處理后，再次利用His 標(biāo)簽蛋白Ni 柱親和純化，獲得目的蛋白貓rIL-18（圖3B）。

圖3 rIL-18 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE 結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of rIL-18 protein induction and purification

2.3 貓rIL-18 促脾淋巴細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果分離BALB/c 鼠和貓脾淋巴細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別經(jīng)不同濃度的rIL-18 刺激，采用MTT 法檢測淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，貓rIL-18 能夠促進(jìn)BALB/c 小鼠和貓脾淋巴細(xì)胞增殖，當(dāng)濃度為50 μg/mL 時(shí)促淋巴細(xì)胞增殖活性最強(qiáng)（圖4），表明可溶性表達(dá)的貓rIL-18 具有促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖活性。

圖4 貓rIL-18 促脾淋巴細(xì)胞增殖活性的檢測結(jié)果Fig.4 The effect of feline rIL-18 on spleen lymphocyte proliferation

2.4 貓rIL-18 協(xié)同貓IFN 抗病毒效果檢測結(jié)果以VSV 和FCoV 為模式病毒，采用微量細(xì)胞病變抑制方法評價(jià)貓rIL-18 協(xié)同貓IFN 的抗病毒效果。結(jié)果顯示，貓rIL-18 聯(lián)合IFN 時(shí)對VSV、FCoV 的抗病毒效果明顯優(yōu)于IFN 單用組（p＜0.01）（表1）。表明貓rIL-18 聯(lián)合IFN 可顯著增強(qiáng)抗病毒效果。

表1 貓rIL-18 聯(lián)合IFN 抗病毒效果檢測結(jié)果Table 1 Antiviral effect of feline rIL-18 combined with interferon

3 討 論

IL-18 由活化的巨噬細(xì)胞和多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)活性，主要表現(xiàn)在：刺激IFN-γ產(chǎn)生，增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)宿主的防御功能；激活NK 細(xì)胞，對感染細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力[8]；與IL-12 聯(lián)合刺激T 細(xì)胞的增殖分化，誘導(dǎo)Th1/Th2 型細(xì)胞反應(yīng)[9]；激活B 細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[10]。因此，IL-18 在抗感染、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等方面具有潛在的應(yīng)用前景和研發(fā)價(jià)值[11-14]。本研究根據(jù)目前寵物貓飼養(yǎng)數(shù)量日益增多而貓病毒性疾病治療制劑不足的現(xiàn)狀，開展貓IL-18 的基因克隆、表達(dá)及其生物活性研究。采用病毒聯(lián)合polyI:C 方法刺激實(shí)驗(yàn)貓，克隆了貓IL-18編碼基因，經(jīng)序列比對與已知貓IL-18 基因的同源性最高為99.3%。

已有研究顯示，利用原核表達(dá)系統(tǒng)以包涵體形式表達(dá)的貓IL-18 表達(dá)量低且沒有生物學(xué)活性[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了原核可溶性表達(dá)系統(tǒng)pCold-TF進(jìn)行貓rIL-18 的制備。pCold-TF 載體表達(dá)宿主菌廣，提供冷休克誘導(dǎo)的方法可高水平表達(dá)目的蛋白，而其它雜蛋白的產(chǎn)量相對較少，同時(shí)對表達(dá)的目的蛋白可進(jìn)行修飾和折疊進(jìn)而分泌到細(xì)胞質(zhì)中，而不以包涵體形式存在，超聲裂解菌體即可獲得目的蛋白，為蛋白的獲取以及純化提供了極大方便。更為重要的是，pCold-TF 載體中帶有的可溶性標(biāo)簽“觸發(fā)因子（Trigger factor，TF）”可以有效地提高蛋白質(zhì)的正確折疊效率，使被表達(dá)的目的蛋白具有更高的生物活性。本研究構(gòu)建的重組大腸桿菌pCold-IL-18/BL21 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)能夠高效可溶性表達(dá)rIL-18，經(jīng)His 標(biāo)簽蛋白Ni 柱純化后的蛋白濃度達(dá)220 mg/L，蛋白產(chǎn)量可觀，為進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定了良好基礎(chǔ)。更有意義的是，制備的貓rIL-18 具有促淋巴細(xì)胞增殖生物活性，在體外能夠有效地刺激脾淋巴細(xì)胞增殖，且當(dāng)濃度為50 μg/mL 時(shí)促脾淋巴細(xì)胞的增殖活性最高。以上研究結(jié)果表明，與以包涵體形式表達(dá)目的蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核可溶性表達(dá)系統(tǒng)pCold-TF 優(yōu)勢較為明顯，利用原核可溶性表達(dá)系統(tǒng)制備貓rIL-18 不僅蛋白產(chǎn)量高，而且表達(dá)的rIL-18 具有良好的生物活性。

IL-18 是誘導(dǎo)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞反應(yīng)的強(qiáng)有力佐劑，而且IL-18 無免疫原性，不會引起自身免疫疾病。此外，IFN 具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，是一種非特異性廣譜抗病毒生物制劑，利用IFN 治療病毒性疾病可顯著提高患病動物的治愈率，在臨床上被視為抗病毒感染的首選治療性藥物，也是目前治療貓病毒性疾病主要的生物制劑。本研究初步評價(jià)了貓rIL-18聯(lián)合臨床用貓IFN的抗病毒效果，兩者聯(lián)合后可顯著提高抗病毒效果，其中抗VSV 活性提高了約8 倍，抗FCoV 活性提高了約12倍，本研究結(jié)果為貓rIL-18 和貓IFN 在臨床上聯(lián)合用于治療貓病毒性疾病提供了依據(jù)。

綜上，本研究克隆了貓IL-18 基因，構(gòu)建了原核可溶性表達(dá)貓IL-18 的重組大腸桿菌pCold-IL-18/BL21，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)高效表達(dá)了rIL-18，研究結(jié)果顯示貓rIL-18 具有良好的促脾淋巴細(xì)胞增殖活性和抗病毒活性，為進(jìn)一步對其開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。