李洋洋，宗 揚(yáng)，程 健，王亞杰，張鑫宇，夏曉莉，孫懷昌,2*

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省重要?jiǎng)游镆卟∨c人獸共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300）

豬 圓 環(huán) 病 毒2 型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。≒orcine circovirus-associated disease，PCVAD）的主要病原，目前在世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)豬業(yè)國家造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病主要靠疫苗接種進(jìn)行控制，可用疫苗包括滅活苗、重組亞單位疫苗和病毒樣顆粒（Virus-like particle，VLP）疫苗，但均需與免疫佐劑配合使用。盡管油乳劑等傳統(tǒng)免疫佐劑相對(duì)安全，但不能有效誘導(dǎo)抗病毒感染重要的細(xì)胞免疫應(yīng)答。新型水包油包水佐劑的免疫佐劑活性較全面，但使用成本較高[2]。因此，新型免疫佐劑研制是預(yù)防獸醫(yī)學(xué)的重要研究課題。

Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）是一類重要的模式識(shí)別受體，通過與病原相關(guān)分子模式結(jié)合能刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生和促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞活化，在先天性和獲得性免疫中發(fā)揮重要的橋梁作用，因此TLR 配體是很有開發(fā)前景的新型免疫佐劑[3]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中以類彈性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）為融合標(biāo)簽，在重組大腸桿菌中表達(dá)了PCV2 Cap 蛋白，純化的ELP-Cap 融合蛋白能形成典型的VLP，具有較強(qiáng)的免疫原性，有望作為PCV2新型亞單位疫苗被進(jìn)一步開發(fā)。細(xì)菌脂蛋白、鞭毛蛋白和熱應(yīng)激蛋白分別是TLR2、TLR5和TLR2/4的配體，也是很有應(yīng)用前景的新型分子佐劑[4]。為了研制PCV2 VLP 候選疫苗的新型佐劑，本研究利用重組大腸桿菌分別表達(dá)了腦膜炎奈瑟菌Ag473 脂蛋白、創(chuàng)傷弧菌FlaB 鞭毛蛋白和結(jié)核分枝桿菌熱應(yīng)激蛋白70（Hsp70），并將這些重組蛋白分別與PCV2 VLP 候選疫苗混合進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)，旨在篩選獲得合適的分子佐劑。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料重組菌pET-Hsp70/E. coli、pET-FlaB/E. coli 和pELK-Ag473/E. coli 由 本 研 究 室 構(gòu)建，其中pET-Hsp70/E.coli 和pET-FlaB/E.coli 表達(dá)產(chǎn)物分別為His-Hsp70 和His-FlaB 融合蛋白，pELK-Ag473/E.coli 表達(dá)產(chǎn)物為ELK16 自聚肽融合蛋白（ELK-Ag473）；ELP-Cap 融合蛋白形成的PCV2 VLP 候選疫苗以及Cap-His 融合蛋白由本實(shí)驗(yàn)室制備；小鼠IFN-γ、TNF-α和IL-4 ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）購自生工生物工程（上海）有限公司；病毒RNA/DNA 快速純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；鎳瓊脂糖凝膠購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；6 周齡SPF 級(jí)BALB/c 小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 重組蛋白的表達(dá)與純化將本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的重組菌pET-Hsp70/E. coli、pET-FlaB/E. coli、pELK-Ag473/E.coli 分別培養(yǎng)至OD600nm約0.6 時(shí)加入終濃度0.2 mmol/L 的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h，設(shè)不加IPTG 誘導(dǎo)對(duì)照；離心菌體，沉淀菌體用PBS 洗滌后，經(jīng) 細(xì) 菌 裂 解 液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.5% Triton X-100，5%甘油）懸浮，超聲波充分破碎、離心后收集離心上清（可溶性表達(dá)）和沉淀（包涵體表達(dá)），按照鎳瓊脂糖凝膠說明書純化各重組蛋白，可溶性蛋白直接在非變性條件下純化，包涵體經(jīng)8 mol/L 尿素溶解后在變性條件下純化，純化后的各重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)。

1.3 小鼠免疫及樣品采集將36 只6 周齡雌性BALB/c 小鼠隨機(jī)分為6 組（N=6），免疫方案見表1，初免后14 d 加強(qiáng)免疫1 次，方法相同。初免后每周眼眶靜脈叢采血分離血清，-80 ℃凍存。

表1 本研究的小鼠免疫方案Table 1 Mouse immunization protocol in this study

1.4 免疫小鼠Cap蛋白特異性抗體的ELISA檢測(cè)以Cap-His 融 合 蛋 白（5 μg/mL，100 μL/孔）為 包 被 抗原，待測(cè)血清用抗體稀釋液按1∶100 稀釋，每孔加入100 μL，以羊抗鼠IgG-HRP（1∶10 000）為二抗，利用ELISA 方法檢測(cè)1.3 中收集的各組血清，P/N≥2.1 時(shí)判定為陽性。

1.5 免疫小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞因子檢測(cè)初免后28 d每組隨機(jī)斷頸迫殺3只小鼠，無菌操作摘取小鼠脾臟，按常規(guī)方法收集培養(yǎng)各組小鼠脾細(xì)胞，各組分別加Con A（10 μg/mL）和Cap-His 融合蛋白（10 μg/mL），37 ℃刺激72 h 后4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用TNF-α、IFN-γ和IL-4 ELISA試劑盒分別檢測(cè)各組小鼠的各細(xì)胞因子水平。

1.6 攻毒小鼠的病毒血癥檢測(cè)初免后28 d 后對(duì)各組小鼠腹腔注射200 μL/只（104TCID50/mL）PCV2 進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，分別于攻毒后7 d 和14 d 眼眶靜脈叢采血分離血清，采用病毒RNA/DNA 快速純化試劑盒提取DNA，參照文獻(xiàn)[5]中熒光定量PCR 檢測(cè)各組小鼠血液中PCV2 DNA 拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 重組蛋白的表達(dá)與純化各重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，SDS-PAGE 分析顯示，pET-Hsp70/E.coli 重組菌表達(dá)了31 ku His-Hsp70 融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物為包涵體；pET-FlaB/E. coli 重組菌表達(dá)了32 ku His-FlaB 融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白；pELKAg473/E. coli 重組菌表達(dá)了41 ku ELK-Ag473 融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物為包涵體。經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠純化后，SDS-PAGE 凝 膠 經(jīng)Bio-Rad Image Lab software 條 帶分析，結(jié)果顯示純化的His-Hsp70、His-FlaB 和ELK-Ag473 融合蛋白條帶比例分別為94%、91.3%和91%（圖1）。表明正確表達(dá)并純化得到3 種與預(yù)期相符的重組蛋白。

圖1 3 種純化融合蛋白的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of three purified fusion proteins

2.2 免疫小鼠抗體測(cè)定結(jié)果采集小鼠首免后第7 d、14 d、21 d、28 d 血清，ELISA 檢測(cè)Cap 蛋白特異抗體水平，結(jié)果顯示從首免后7 d 起，各免疫組小鼠均為PCV2 Cap 蛋白特異抗體檢測(cè)陽性（P/N≥2.1），抗體水平隨免疫時(shí)間延長呈明顯的上升趨勢(shì)，28 d各組小鼠抗體水平達(dá)到最高值；其中Ag473 佐劑組小鼠的特異性抗體水平最高（OD450nm=1.627），HSP70佐 劑 組 次 之（OD450nm=1.513）， FlaB 佐 劑 組 較 低（OD450nm=1.435）；與未免疫組相比，各佐劑組小鼠抗體水平差異顯著（p＜0.05）；與商品化佐劑組相比，3個(gè)分子佐劑組小鼠的抗體水平均低于ISA206 佐劑組但高于不完全弗氏佐劑（FIA）組，Ag473 佐劑組與ISA206、FIA 組相比差異不顯著（p＞0.05）（圖2）。結(jié)果表明，Ag473 佐劑組小鼠能夠產(chǎn)生較高的PCV2 Cap 特異性抗體，免疫佐劑活性最強(qiáng)。

圖2 免疫小鼠的Cap 蛋白特異抗體檢測(cè)Fig.2 Detection of PCV2 Cap-specific antibodies in immunized mice

2.3 免疫小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果免疫小鼠脾細(xì)胞經(jīng)ConA 或ELP-VLP 刺激后72 h，利用ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中各細(xì)胞因子濃度。結(jié)果顯示，與未免疫對(duì)照組相比，5 個(gè)免疫組的TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平顯著升高（p＜0.05），且ELP-VLP 刺激組高于ConA刺激組。在3 種分子佐劑中，Ag473 佐劑組的TNF-α、IFN-γ濃度高于HSP70、FlaB 兩組，差異顯著（p＜0.05）；與商品化佐劑相比，Ag473 佐劑組的TNF-α、IFN-γ濃度低于ISA206 佐劑組但高于FIA 佐劑組，差異顯著（p＜0.05）（圖3、圖4）。細(xì)胞因子IL-4 檢測(cè)結(jié)果顯示，ConA 刺激后各免疫組的IL-4水平很低，與未免疫組相比差異不顯著；ELP-VLP刺激Ag473 佐劑組產(chǎn)生的IL-4 濃度最高，HSP70 和FlaB佐劑組次之，與未免疫組相比差異顯著（p＜0.05），ISA206、FIA 佐劑組不產(chǎn)生高水平的IL-4（圖5）。結(jié)果表明Ag473 佐劑組能夠刺激產(chǎn)生較強(qiáng)的抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答，能夠誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2 免疫應(yīng)答，而商品化佐劑不能誘導(dǎo)免疫小鼠產(chǎn)生Th2 免疫應(yīng)答。

圖3 免疫小鼠脾細(xì)胞的TNF-α表達(dá)檢測(cè)Fig.3 Detection of TNF-α expression in splenocytes of immunized mice

圖4 免疫小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)檢測(cè)Fig.4 Detection of IFN-γ expression in splenocytes of immunized mice

圖5 免疫小鼠脾細(xì)胞的IL-4 表達(dá)檢測(cè)Fig.5 Detection of IL-4 expression in splenocytes of immunized mice

2.4 攻毒小鼠的病毒血癥檢測(cè)在攻毒后7 d 和14 d 采血分離血清，利用熒光定量PCR 檢測(cè)血清中PCV2 基因組DNA 拷貝數(shù)。結(jié)果顯示在攻毒后7 d，5 個(gè)免疫組的病毒DNA 拷貝數(shù)均較未免疫對(duì)照組顯著降低（p＜0.05）；攻毒后14 d，未免疫對(duì)照組的病毒滴度為5.4±0.18 log10/mL，5 個(gè)免疫組小鼠的病毒DNA 拷貝數(shù)均顯著下降，其中Ag473 佐劑組下降最明 顯，為2.9±0.08 log10/mL（圖6）。結(jié) 果 表 明，Ag473 作為佐劑能顯著提高VLP 疫苗的抗病毒能力，并且強(qiáng)于商品化佐劑ISA206 和FIA。

圖6 免疫攻毒小鼠的病毒血癥檢測(cè)Fig.6 Viremic detection of immunized mice after PCV2 challenge

3 討 論

VLP 具有天然病毒粒子的空間構(gòu)象和與相似的免疫原性，容易被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，從而誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答，是很有應(yīng)用前景的新型重組亞單位疫苗[6]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中以ELP 為純化標(biāo)簽，利用重組大腸桿菌表達(dá)了ELP-Cap 融合蛋白。該重組蛋白經(jīng)VLP 裝配緩沖液溶解后，不僅能組裝成典型的VLP，而且經(jīng)小鼠免疫試驗(yàn)證明具有良好的免疫原性。為了獲得PCV2 VLP 候選疫苗的分子佐劑，本研究選擇佐劑活性較強(qiáng)的膜炎奈瑟菌Ag473 脂蛋白、結(jié)核分枝桿菌Hsp70 和創(chuàng)傷弧菌FlaB 鞭毛蛋白進(jìn)行重組大腸桿菌表達(dá)研究。為了減少純化標(biāo)簽對(duì)重組蛋白折疊和佐劑活性的影響，本研究先將3 個(gè)細(xì)菌蛋白與組氨酸標(biāo)簽（6×His）進(jìn)行融合表達(dá)，SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示His-Hsp70 和His-FlaB 融合蛋白不僅表達(dá)水平較高，而且鎳層析柱純化的蛋白純度大于90%。然而，His-Ag473 融合蛋白卻未獲表達(dá)，通過反復(fù)摸索誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度等條件也未獲成功，因此本研究改用ELK16 標(biāo)簽進(jìn)行融合表達(dá)。ELK16 是由16 個(gè)谷氨酸、亮氨酸或賴氨酸組成（LELELKLKLELELKLK）的自聚肽，在水溶液或大腸桿菌中可自動(dòng)裝配成蛋白凝聚物即活性包涵體，因此其融合蛋白可用離心洗滌法純化[7]。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示，盡管重組菌的ELKAg473 融合蛋白表達(dá)水平較高，但離心洗滌獲得的蛋白純度很低，可能與Ag473 脂蛋白影響自聚肽裝配有關(guān)。不過，ELK-Ag473 融合蛋白C 端保留了組氨酸標(biāo)簽，最終用鎳柱層析法獲得了純度很高的ELK-Ag473 融合蛋白。

本研究選擇的膜炎奈瑟菌Ag473 脂蛋白、結(jié)核分枝桿菌Hsp70 和創(chuàng)傷弧菌FlaB 鞭毛蛋白均為TLR配體[8]，其中Ag473 脂蛋白是TLR2 的配體，并能與TLR1 或TLR6 相互作用，從而發(fā)揮很強(qiáng)的免疫佐劑活性[9]。結(jié)核分枝桿菌Hsp70 是TLR2 和TLR4 的配體，不僅可刺激Th1 和Th2 細(xì)胞因子產(chǎn)生，還能增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞活性和細(xì)胞免疫應(yīng)答[10]。創(chuàng)傷弧菌FlaB 是TLR5 的配體，具有很強(qiáng)的粘膜免疫佐劑活性[11]。盡管此3 種TLR 配體的佐劑活性均有報(bào)道，但其作用機(jī)制不同，對(duì)不同抗原的佐劑活性可能也有所差異。因此，本研究使用相同劑量的PCV2 VLP候選疫苗，利用相同劑量的3 種分子佐劑進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)。結(jié)果顯示在測(cè)試的3 種分子佐劑中，Ag473 脂蛋白的體液和細(xì)胞免疫佐劑活性均較強(qiáng)，不僅能刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生較高水平TNF-α 和IFN-γ等Th1 細(xì)胞因子，還能產(chǎn)生較高水平的IL-4等Th2 細(xì)胞因子。另外，ELK-Ag473 融合蛋白的強(qiáng)佐劑活性還可能與ELK16 標(biāo)簽有關(guān)，因?yàn)樽跃垭哪芾梅枪矁r(jià)鍵的相互凝聚作用，使其融合蛋白形成納米級(jí)顆粒，以便被抗原提呈細(xì)胞攝取[12]。與ELK-Ag473 融合蛋白相比，His-Hsp70 融合蛋白的免疫佐劑活性較弱，可能需要與疫苗抗原融合表達(dá)有關(guān)[9]。在比較測(cè)試的3 種分子佐劑中，His-FlaB 融合蛋白的免疫佐劑活性最低，可能與其粘膜免疫佐劑性質(zhì)有關(guān)，需要通過粘膜途徑才能發(fā)揮較強(qiáng)的免疫佐劑活性[10]。

本研究結(jié)果顯示，盡管ELK-Ag473 融合蛋白刺激產(chǎn)生的Th1 細(xì)胞因子（TNF-α和IFN-γ）表達(dá)水平略低于新型ISA206 佐劑，但明顯優(yōu)于FIA 的細(xì)胞免疫佐劑活性。另外，ELK-Ag473 融合蛋白刺激Th2 細(xì)胞因子（IL-4）產(chǎn)生不僅優(yōu)于FIA，而且優(yōu)于ISA206佐劑。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證明Ag473 融合蛋白能誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2 免疫應(yīng)答。更為重要的是免疫小鼠攻毒保護(hù)檢測(cè)結(jié)果顯示，ELK-Ag473 佐劑組的PCV2 病毒血癥滴度下降與目前最好的ISA206 佐劑組接近或略高。由于ELK-Ag473 融合蛋白可利用重組大腸桿菌自行表達(dá)，與ISA206 佐劑相比可能具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，因此有望作為PCV2 VLP 等重組亞單位疫苗佐劑被進(jìn)一步開發(fā)。