梁育汝 王彩冰 羅紅葉 唐 敏 陳由陽 屠興榮

(右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,廣西百色市 533000,電子郵箱：1278106161@qq.com)

杭白菊為菊科植物菊的干燥頭狀花序,是常用的中草藥及生活飲品,具有清熱解毒、平肝明目、散風(fēng)清熱的功效[1]。有文獻(xiàn)報(bào)告,杭白菊具有護(hù)心保肝、抑菌抗炎、抗氧化、防衰老等作用[2-6],但鮮見有關(guān)杭白菊對腎損傷改善作用的研究報(bào)告。故本研究通過腹腔注射四氯化碳建立小鼠腎損傷模型[7],探討杭白菊對腎損傷小鼠的干預(yù)效果及其作用機(jī)制,為杭白菊的開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體級健康KM小鼠50只,約5周齡,體重(25±2)g,雌雄各半,由右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供(使用許可證號：SYXK桂2017-0004；生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2017-0003)。分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水,室溫 25℃左右。

1.2 藥品、試劑及器械 杭白菊(康美藥業(yè)股份有限公司,批號：170550751)；四氯化碳(成都市科龍化工試劑廠,批號：20130329)；0.9%氯化鈉注射液(廣西裕源藥業(yè)有限公司,批號：L16062904)；甲醛(煙臺市雙雙化工有限公司,批號：20170701)。白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、血清尿素氮測試盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測試盒、丙二醛測試盒均購自南京建成生物工程研究所(批號：20180106、20180105、20180103、20180104)。電子天平(諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司,型號：JM-B1003)；多功能酶標(biāo)儀(上壹橋國際貿(mào)易有限公司,型號：Tristar Lb941)；可見分光光度計(jì)(上海精科實(shí)業(yè)有限公司,型號：722型)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠,型號：TGL-16G)；手持、臺式兩用均質(zhì)器(美國PRO Scientific公司,型號：PR0200)；三用恒溫水箱(金壇市醫(yī)療儀器廠,型號：HH-W600)；數(shù)碼顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,型號：BA210Digital)。

1.3 杭白菊提取液的制備 取杭白菊干品300 g,用2 000 mL 的30℃蒸餾水浸泡30 min,文火煮沸2 h,過濾后將濾液用文火隔水濃縮至500 mL(相當(dāng)于生藥600 mg/mL),冷卻后放入4℃冰箱保存?zhèn)溆?用時(shí)以雙蒸水配成所需濃度的杭白菊提取液。

1.4 動物分組與給藥方法 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,按體重隨機(jī)分為對照組、模型組以及杭白菊低、中、高濃度組,每組10只。除對照組外,其余4組按10 mL/kg腹腔注射0.1%四氯化碳建立小鼠腎損傷模型,對照組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液,連續(xù)5周,實(shí)驗(yàn)第1周時(shí),1次/d,第2周至第5周隔天注射1次。同時(shí)，杭白菊低、中、高濃度組按10 mL/kg給予小鼠灌胃杭白菊提取液，給藥濃度分別為150、300、600 mg/mL,對照組和模型組給予灌胃等量0.9%氯化鈉注射液,實(shí)驗(yàn)第1周時(shí),1次/d(注射四氯化碳后灌胃),第2周至第5周隔天灌胃1次,給藥時(shí)間與四氯化碳注射日隔開,實(shí)驗(yàn)第6周時(shí)改為1次/d,實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周。在末次用藥灌胃后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.5 血清IL-6、尿素氮水平、SOD活性、丙二醛水平的檢測 末次灌胃前禁食12 h、禁水2 h,末次灌胃30 min后采用摘除眼球法采血1 mL放入試管中,血標(biāo)本靜置5 h后以3 500 r/min離心10 min分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒檢測IL-6水平，采用尿素氮測試盒檢測血清尿素氮水平,采用SOD測試盒、丙二醛測試盒分別檢測血清SOD活性、丙二醛水平。所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 腎組織SOD活性、丙二醛水平的檢測 采血后迅速剖腹取腎臟,取左腎組織加冰凍0.9%氯化鈉注射液攪拌制成10%腎組織懸液,以3 000 r/min離心10 min分離上清液,分別采用SOD測試盒、丙二醛測試盒檢測腎組織SOD活性、丙二醛水平。所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.7 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 將小鼠右腎浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，依次行脫水、石蠟包埋、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,通過數(shù)碼顯微鏡觀察各組小鼠腎臟的組織結(jié)構(gòu)并攝像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 5組小鼠血清尿素氮、IL-6水平比較 5組小鼠血清IL-6、尿素氮水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。除杭白菊高濃度組外,其余3組血清IL-6水平均高于對照組,杭白菊高濃度組血清IL-6水平低于模型組(均P<0.05)。模型組血清尿素氮水平高于其余4組(均P<0.05),但各濃度杭白菊組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 5組小鼠血清尿素氮和IL-6水平比較(x±s)

2.2 5組小鼠腎組織和血清SOD活性、丙二醛水平比較 模型組腎組織和血清SOD活性均低于其余4組(P<0.05),杭白菊高濃度組血清SOD活性均高于對照組和杭白菊中濃度組(P<0.05)；4組血清丙二醛水平均高于對照組,但各濃度杭白菊組血清丙二醛水平低于模型組,高濃度組低于低濃度組(P<0.05)。見表2。

表2 5組小鼠腎組織和血清SOD活性、丙二醛水平比較(x±s)

2.3 腎組織病理檢查結(jié)果 對照組小鼠腎小體和腎小管的結(jié)構(gòu)和形態(tài)完整、清晰,腎小球占腎小體體積的1/3～1/2,腎小囊和腎小管組織透明且無沉積物。模型組小鼠腎小體、腎小管組織大面積變性壞死，結(jié)構(gòu)模糊、損壞嚴(yán)重,腎小球疏松、血管破壞、體積增大,約占腎小體體積的1/2～2/3,腎小囊和腎小管上皮細(xì)胞變性壞死、管腔變小、腔內(nèi)普遍有嗜復(fù)紅物和細(xì)胞碎片,腎組織內(nèi)有大量白細(xì)胞浸潤。杭白菊低、中、高濃度組小鼠腎小體、腎小管組織可見不同程度的損壞，結(jié)構(gòu)模糊,腎小球疏松、血管破壞、體積增大,腎小囊和腎小管上皮細(xì)胞可見變性壞死，腔內(nèi)有嗜復(fù)紅物和細(xì)胞碎片,腎組織內(nèi)有白細(xì)胞浸潤,但這些病變均輕于模型組,并隨杭白菊濃度的增加而改善。見圖1。

對照組 模型組 杭白菊低濃度組 杭白菊中濃度組 杭白菊高濃度組

3 討 論

腎臟是人體主要的排泄器官,其排泄總類最多、排泄量大,可以排出機(jī)體的代謝終產(chǎn)物以及進(jìn)入機(jī)體的過剩物質(zhì)、異物、毒素、藥物等,并可調(diào)節(jié)機(jī)體的水、電解質(zhì)和酸堿平衡,對機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用[8]。四氯化碳經(jīng)血液吸收促使機(jī)體生成自由基CCl3·和CCl3O2·,這些自由基攻擊細(xì)胞膜,致使細(xì)胞膜磷脂過氧化而生成脂質(zhì)過氧化物,從而破壞組織細(xì)胞,因此其常被用于誘導(dǎo)動物腎損傷,建立腎損傷動物模型[7,9-10]。SOD是抗氧化酶,它通過清除機(jī)體超氧自由基避免細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而維持細(xì)胞膜的完整性,而機(jī)體自由基生成過多或清除能力降低可引起細(xì)胞損壞。丙二醛是脂質(zhì)過氧化物的中間代謝產(chǎn)物,其含量可反映脂質(zhì)過氧化物濃度[11]。尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的終末產(chǎn)物,其經(jīng)腎小球?yàn)V過隨尿排出,當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受損害時(shí),腎小球?yàn)V過率降低,致使血尿素氮濃度增加,目前臨床上常通過測定尿素氮水平,判斷腎小球的濾過功能[12]。IL-6是一種炎癥因子,腎系膜細(xì)胞異常增殖可引起大量的IL-6釋放，從而刺激腎臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，并造成腎功能損害[13-15]。本研究采用四氯化碳誘導(dǎo)小鼠腎損傷,結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組的血清尿素氮及IL-6升高,說明腎小球?yàn)V過功能下降,腎實(shí)質(zhì)受損,炎癥因子可能參與腎損傷的過程；同時(shí),模型組腎組織和血清SOD活性均降低,血清丙二醛升高(P<0.05),即腎組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),且SOD消耗過多,提示自由基參與四氯化碳誘導(dǎo)腎損傷過程。腎組織病理學(xué)檢查也顯示,模型組腎小管的結(jié)構(gòu)和形態(tài)普遍變性壞死,腎組織內(nèi)有大量白細(xì)胞浸潤。以上結(jié)果均表明本研究成功建造小鼠腎損傷模型。

杭白菊有清熱解毒之功效[1],還具有護(hù)心保肝、抑菌抗炎、抗氧化、防衰老等作用[2-6],是我國民間日常生活飲用品。本研究結(jié)果顯示,杭白菊低、中、高濃度組小鼠的腎小體、腎小管的結(jié)構(gòu)和形態(tài)可見不同程度的損壞,腎組織內(nèi)有白細(xì)胞浸潤,但這些病變均輕于模型組,提示杭白菊可減輕四氯化碳造成的腎組織結(jié)構(gòu)破壞。杭白菊各濃度組血清尿素氮低于模型組(P<0.05),且與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明杭白菊可改善四氯化碳導(dǎo)致的小鼠腎小球?yàn)V過功能下降,從而發(fā)揮腎功能保護(hù)作用。模型組及杭白菊低、中濃度組血清IL-6水平高于對照組,但杭白菊高濃度組血清IL-6水平低于模型組(均P<0.05),說明高濃度杭白菊能降低IL-6水平,減輕四氯化碳誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。模型組腎組織和血清SOD活性低于對照組，而血清丙二醛水平均高于對照組(P<0.05)；而各濃度杭白菊組腎組織和血清SOD活性均高于模型組，且血清丙二醛水平均低于模型組(均P<0.05)；杭白菊高濃度組血清SOD活性高于杭白菊中濃度組，血清丙二醇水平低于杭白菊低濃度組(均P<0.05)。說明一定劑量的杭白菊(尤其是高濃度)可提高腎損傷小鼠腎組織SOD活性,提高機(jī)體清除自由基能力，并可降低腎損傷小鼠腎組織細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化，對腎細(xì)胞膜有一定保護(hù)作用。

綜上所述,杭白菊對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠腎損傷具有改善作用,且高濃度(600 mg/mL)時(shí)效果更佳，其機(jī)制可能與杭白菊可減少炎癥因子生成、提高機(jī)體清除自由基能力有關(guān)。