徐苗 王國(guó)治

自1890年科赫發(fā)明用于結(jié)核病免疫治療的結(jié)核菌素(tuberculin)，1907年奧地利人V.Pirquet將結(jié)核菌素作為結(jié)核病診斷試劑以來(lái)[1]，產(chǎn)品也從濾液蛋白粗提物改進(jìn)為結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)，在結(jié)核菌素用于結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST )逾百年后的今天，該類(lèi)產(chǎn)品依然在結(jié)核病輔助診斷、流行病學(xué)調(diào)查，以及卡介苗接種陽(yáng)轉(zhuǎn)考核中發(fā)揮著巨大作用。隨著結(jié)核病疫情的變化，早在2002年我國(guó)研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn) “靠單純DOTS的現(xiàn)代結(jié)核病控制策略，無(wú)法解決已經(jīng)感染結(jié)核分枝桿菌人群發(fā)展為結(jié)核病的潛在威脅，積極發(fā)現(xiàn)和治療結(jié)核病與對(duì)已感染結(jié)核分枝桿菌的高危人群實(shí)施預(yù)防是結(jié)核病控制的根本”[2]。而我國(guó)是結(jié)核高感染率與卡介苗高接種率的國(guó)家，TST對(duì)結(jié)核病患者、結(jié)核感染者及卡介苗接種者均呈陽(yáng)性，難以鑒別卡介苗接種與結(jié)核感染，檢測(cè)結(jié)果特異性欠佳。因此，選擇能有效區(qū)分卡介苗與結(jié)核分枝桿菌的抗原，研制新一代結(jié)核分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原，用于篩查潛伏性結(jié)核感染(latent tuberculosis infection,LTBI)者成為研究熱點(diǎn)。我國(guó)研究者從單一結(jié)核分枝桿菌早期分泌性靶抗原6(ESAT-6)起步研究[3]，經(jīng)過(guò)近20年的努力，成功研制出結(jié)核分枝桿菌重組ESAT-6與培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)融合蛋白變態(tài)反應(yīng)原[4]。該產(chǎn)品2020年由安徽智飛龍科馬生物制藥有限責(zé)任公司上市，并由國(guó)家藥典委員會(huì)確定中文通用名稱(chēng)為“重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)”(簡(jiǎn)稱(chēng)“EC”)，為實(shí)現(xiàn)LTBI人群的篩選與預(yù)防提供了技術(shù)支撐。

EC-皮膚試驗(yàn)(EC-ST)用于LTBI檢測(cè)方法的建立

據(jù)WHO估計(jì)，目前全世界有1/3人口為L(zhǎng)TBI者。通常情況下，90%的LTBI者終身保持健康，但其余10%的LTBI者最終會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核病[5-6]。因此，LTBI的篩選與預(yù)防，是終結(jié)結(jié)核病的重點(diǎn)。WHO對(duì)LTBI定義為：“一種由結(jié)核分枝桿菌抗原刺激導(dǎo)致的持續(xù)免疫狀態(tài)，但沒(méi)有活動(dòng)性結(jié)核病的證據(jù)”，同時(shí)認(rèn)為“檢測(cè)LTBI沒(méi)有金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。鑒于LTBI無(wú)明確的臨床證據(jù)，WHO推薦的兩種檢測(cè)方法中，TST與γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assays，IGRA)檢測(cè)結(jié)果差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；即便是IGRA，不同類(lèi)型試劑、同一類(lèi)型不同廠家的試劑檢測(cè)結(jié)果也不完全一致。因此，對(duì)新型EC的診斷效果如何評(píng)價(jià)，便是一個(gè)實(shí)際困難。研究者充分考慮國(guó)內(nèi)結(jié)核感染情況、卡介苗接種情況及現(xiàn)有的對(duì)照試劑，主要基于對(duì)EC、與其有相同用途的IGRA，以及TST在不同人群中檢測(cè)結(jié)果的比較，并且對(duì)不同方法陽(yáng)性檢出率和結(jié)核分枝桿菌不同感染程度的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，對(duì)EC開(kāi)展臨床評(píng)價(jià)。

一、EC作為L(zhǎng)TBI檢測(cè)試劑的可行性評(píng)估

依據(jù)EC、IGRA與TST檢測(cè)的基本原理，在臨床評(píng)價(jià)中提出以下總體評(píng)價(jià)思路與評(píng)價(jià)指標(biāo)：(1)EC 為結(jié)核特異性抗原，理論上EC-ST對(duì)確診的結(jié)核病患者應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)卡介苗接種者應(yīng)呈陰性反應(yīng)?；谠撛?，臨床研究中如EC-ST在結(jié)核病患者中的陽(yáng)性反應(yīng)率、在卡介苗接種者中的陰性反應(yīng)率符合理論預(yù)期，則提示健康人群中EC-ST皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性者為L(zhǎng)TBI者的概率高。(2)由于EC-ST與IGRA檢測(cè)均利用卡介苗中丟失相關(guān)蛋白的原理，理論上EC-ST和IGRA在結(jié)核病患者或卡介苗接種者的陽(yáng)性檢出率差異應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (3)由于EC-ST與TST所用抗原不同，理論上結(jié)核病患者EC-ST和TST應(yīng)均為陽(yáng)性，二者陽(yáng)性率差異應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而卡介苗接種者中，TST應(yīng)為陽(yáng)性，EC-ST應(yīng)為陰性，二者陽(yáng)性率差異應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

臨床研究結(jié)果表明：EC-ST對(duì)確診結(jié)核病患者皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率為90.64%，對(duì)卡介苗接種者陽(yáng)性檢出率為7.28%，與預(yù)期假設(shè)相符；在結(jié)核病患者與卡介苗接種者中IGRA陽(yáng)性檢出率分別為91.15%與4.75%，與EC-ST檢測(cè)結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示EC-ST臨床使用效果與IGRA一致性較好。考慮到EC-ST價(jià)格低、操作簡(jiǎn)便，較IGRA更適合用于LTBI者的篩查。結(jié)核病患者中TST陽(yáng)性率為90.90%，與EC-ST比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但在卡介苗接種者中皮膚試驗(yàn)的陽(yáng)性率高達(dá)73.42%，與EC-ST比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EC-ST可有效鑒別卡介苗接種與結(jié)核感染[8]。

二、不同人群結(jié)核感染程度與EC陽(yáng)性檢出率的關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證

EC試劑應(yīng)用的適應(yīng)證之一為結(jié)核感染篩查。本產(chǎn)品的Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究中統(tǒng)計(jì)出結(jié)核病患者、非結(jié)核呼吸道疾病患者、健康人群、卡介苗接種人群等不同人群的EC-ST陽(yáng)性率；并根據(jù)免疫學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性檢出率的高低，將受試人群分成高、中、低三種不同等級(jí)[9]；通過(guò)對(duì)不同人群的EC-ST陽(yáng)性檢出率進(jìn)行匯總分析，探討EC-ST陽(yáng)性檢出率與受試者結(jié)核感染程度的關(guān)聯(lián)性，相關(guān)結(jié)果如下。

(一)結(jié)核免疫學(xué)檢測(cè)高陽(yáng)性率人群

此類(lèi)人群包括病原學(xué)檢測(cè)或臨床診斷為結(jié)核病患者，其EC-ST應(yīng)有高陽(yáng)性檢出率；在臨床上與結(jié)核病有類(lèi)似癥狀，不能完全排除結(jié)核病的疑似患者，其EC-ST陽(yáng)性率可能低于結(jié)核病患者，但高于健康人群。

1.菌陽(yáng)肺結(jié)核患者：通過(guò)病理學(xué)檢查或病原體分離培養(yǎng)確診的結(jié)核病患者，此類(lèi)人群結(jié)核感染可能性最大，其結(jié)核免疫學(xué)檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率應(yīng)最高。

2.菌陰肺結(jié)核患者：缺少病理學(xué)和病原學(xué)診斷依據(jù)的肺結(jié)核患者，易與其他疾病混淆，也可能為非結(jié)核分枝桿菌感染；此類(lèi)人群結(jié)核感染可能性較大，其結(jié)核免疫學(xué)陽(yáng)性檢出率較高，但低于菌陽(yáng)肺結(jié)核患者。

3.非結(jié)核呼吸道疾病患者：指臨床上有呼吸道癥狀，診斷為非結(jié)核病，但極易與結(jié)核病患者相混淆；此類(lèi)人群可能包括結(jié)核病未檢出，或非結(jié)核呼吸道疾病患者，其結(jié)核免疫學(xué)陽(yáng)性檢出率應(yīng)低于菌陰肺結(jié)核患者。

(二)結(jié)核免疫學(xué)檢測(cè)中陽(yáng)性率人群

此類(lèi)人群包括已感染結(jié)核分枝桿菌但未發(fā)病、已感染結(jié)核分枝桿菌但未檢出、結(jié)核病患者的密切接觸者、結(jié)核病高發(fā)或低發(fā)地區(qū)的健康人群；此類(lèi)人群具有一定程度的結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)，其結(jié)核免疫學(xué)陽(yáng)性檢出率理論上應(yīng)相對(duì)低于結(jié)核病患者或非結(jié)核呼吸道疾病患者。

(三)結(jié)核免疫學(xué)檢測(cè)低陽(yáng)性率人群

本項(xiàng)目中將結(jié)核感染低風(fēng)險(xiǎn)人群定位為：經(jīng)結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB，IGRA中的一種技術(shù)方法)、TST(TB-PPD皮膚試驗(yàn))、EC-ST等3種免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性(簡(jiǎn)稱(chēng)“三陰性人群”)，且接種卡介苗或安慰劑的人群。理論上，三陰性人群接種安慰劑后，3種檢測(cè)方法依然均為陰性；三陰性人群接種卡介苗后，EC-ST和T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性，TST作為卡介苗接種后陽(yáng)轉(zhuǎn)考核方法，檢測(cè)結(jié)果則為陽(yáng)性。

上面3種情況是理論分析的預(yù)期皮膚試驗(yàn)結(jié)果，在實(shí)際臨床試驗(yàn)中，不同人群的3種免疫學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。EC-ST與T-SPOT.TB檢測(cè)陽(yáng)性率隨結(jié)核感染風(fēng)險(xiǎn)提高而增加，TST除卡介苗接種者陽(yáng)性率高于EC-ST和T-SPOT.TB外，其余結(jié)果變化規(guī)律與EC-ST和T-SPOT.TB結(jié)果相似[8]。上述結(jié)果提示EC-ST的陽(yáng)性檢出率的確與結(jié)核感染程度密切相關(guān)，符合臨床研究前對(duì)不同人群皮膚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果的預(yù)期。

圖1 EC-ST、TST和T-SPOT.TB在不同人群中的陽(yáng)性檢出率

EC與PPD誘導(dǎo)的皮膚變態(tài)反應(yīng)異同分析

PPD系由結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中提取的蛋白，可誘導(dǎo)特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)；該蛋白含有致病性分枝桿菌、環(huán)境中分枝桿菌及卡介菌的共有抗原，故TST不能明確區(qū)分卡介苗免疫、外界分枝桿菌感染和結(jié)核分枝桿菌感染,對(duì)卡介苗接種或者曾經(jīng)感染但體內(nèi)未有存活結(jié)核分枝桿菌者依然呈陽(yáng)性反應(yīng)，TST陽(yáng)性只能代表其曾經(jīng)感染分枝桿菌，無(wú)法真正判斷其是否發(fā)病或處于LTBI狀態(tài)。因此，尋找能區(qū)別卡介苗接種還是結(jié)核分枝桿菌感染、結(jié)核分枝桿菌感染者體內(nèi)是否還存在活菌的診斷制品有著非常重要的價(jià)值。結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)域1(region of difference-1，RD-1)的蛋白抗原,可誘發(fā)結(jié)核分枝桿菌致敏的豚鼠發(fā)生DTH，其中最具代表性的是ESAT-6和CFP-10蛋白?？ń榫跍p毒及傳代過(guò)程中丟失了編碼這些蛋白的基因,而且非結(jié)核分枝桿菌中該基因只在少數(shù)分枝桿菌如堪薩斯、海、微黃和蘇加等分枝桿菌中存在。作為皮膚試驗(yàn)變態(tài)反應(yīng)原，重組EC蛋白檢測(cè)的特異性較強(qiáng),且具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性。中國(guó)食品藥品檢定研究院以結(jié)核分枝桿菌死菌、活菌和卡介苗分別致敏豚鼠，用PPD和重組EC蛋白對(duì)致敏豚鼠進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，觀察其局部反應(yīng)。結(jié)果顯示：重組EC蛋白僅與結(jié)核分枝桿菌(活菌)致敏豚鼠呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)卡介苗致敏豚鼠和滅活結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠呈陰性反應(yīng)；而PPD對(duì)上述3種致敏豚鼠均呈陽(yáng)性反應(yīng)。該結(jié)果直觀表明重組EC蛋白與卡介苗感染無(wú)交叉反應(yīng)，有可能用于卡介苗接種與結(jié)核感染的鑒別[4，10]。

PPD與重組EC蛋白皮膚試驗(yàn)均可誘導(dǎo)DTH，其作用機(jī)理類(lèi)似，即已致敏個(gè)體的淋巴細(xì)胞與結(jié)核變態(tài)反應(yīng)原(重組EC蛋白)發(fā)生特異性結(jié)合，引發(fā)單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的免疫反應(yīng)，釋放趨化因子，使大量多核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞滲出；滲出的致敏淋巴細(xì)胞合成并釋放游走抑制因子、白細(xì)胞介素(IL)-2、γ-干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子，免疫細(xì)胞由于游走抑制及其他細(xì)胞因子的作用而停止移動(dòng)并聚集，發(fā)育增殖，形成更多的免疫細(xì)胞聚集，使皮膚反應(yīng)呈現(xiàn)出遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)性炎癥，注射局部出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)。盡管PPD與重組EC蛋白兩種變態(tài)反應(yīng)原的作用機(jī)理類(lèi)似，但二者抗原性與免疫原性不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生的局部皮膚變態(tài)反應(yīng)也不盡相同；PPD誘導(dǎo)的DTH其硬結(jié)的厚度相對(duì)較重組EC蛋白誘導(dǎo)的更厚，而重組EC蛋白誘導(dǎo)的DTH其硬結(jié)雖然小且薄，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性紅暈反應(yīng)明顯大于PPD，陽(yáng)性反應(yīng)的高峰時(shí)間也與PPD不完全一樣[10]。

一、EC-ST誘導(dǎo)局部DTH反應(yīng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)

雖然EC-ST誘導(dǎo)的DTH反應(yīng)所產(chǎn)生的紅暈或硬結(jié)均為特異性反應(yīng)，但在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者中以硬結(jié)為判斷標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其陽(yáng)性率低于以紅暈為判斷標(biāo)準(zhǔn)的陽(yáng)性率；在卡介苗或安慰劑接種者中，以紅暈與硬結(jié)兩種判斷標(biāo)準(zhǔn)的陰性率接近。據(jù)此可知，以紅暈為判斷標(biāo)準(zhǔn)可提高敏感度，且不產(chǎn)生非特異性反應(yīng)，故可以紅暈為EC-ST的判斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)考慮到膚色較深的人群中可能紅暈不易鑒別，且臨床研究中發(fā)現(xiàn)部分受試者硬結(jié)反應(yīng)大于紅暈反應(yīng)，因此在EC-ST判斷標(biāo)準(zhǔn)界定為“以紅暈或硬結(jié)大者為準(zhǔn)，其反應(yīng)平均直徑(橫徑與縱徑之和除以2)不低于5 mm 為陽(yáng)性反應(yīng)?！?/p>

二、EC-ST和TST的判讀時(shí)間

傳統(tǒng)TST誘導(dǎo)的DTH是以皮膚試驗(yàn)后48～72 h的硬結(jié)平均直徑作為判定標(biāo)準(zhǔn)，而EC-ST紅暈或硬結(jié)的平均直徑均可作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。臨床研究結(jié)果提示，EC-ST皮膚試驗(yàn)后24～72 h內(nèi)均可進(jìn)行結(jié)果判讀，用作結(jié)核病輔助診斷或LTBI篩查時(shí)，EC-ST的觀察時(shí)間可提前至皮膚試驗(yàn)后24～48 h；如果要進(jìn)行疫苗接種人群篩查，需要與PPD同體雙臂進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，由于目前PPD觀察時(shí)間為注射后48～72 h,可取EC-ST與TST后48 h作為共同觀察時(shí)間。

三、EC-ST與TST對(duì)感染早期的應(yīng)答

不同免疫學(xué)診斷方法對(duì)感染后免疫反應(yīng)的應(yīng)答時(shí)間不同， EC-ST與TST由于其抗原不同，引起的免疫學(xué)陽(yáng)性時(shí)間也有所不同。無(wú)論是流行病學(xué)研究還是臨床輔助診斷，能越早檢測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)的試劑則性能越優(yōu)。研究者以活的結(jié)核分枝桿菌致敏豚鼠模型，評(píng)價(jià)了EC-ST與TST對(duì)感染動(dòng)物的早期免疫應(yīng)答[11-12]。研究結(jié)果表明，動(dòng)物采用活菌感染后第10天EC-ST有1/3動(dòng)物陽(yáng)轉(zhuǎn)，第12天陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)100%；而動(dòng)物感染后第14天TST僅有1/8動(dòng)物陽(yáng)轉(zhuǎn)，第28天則所有動(dòng)物都陽(yáng)轉(zhuǎn)。該結(jié)果提示EC-ST早期應(yīng)答能力優(yōu)于傳統(tǒng)TST，但該結(jié)果還需做進(jìn)一步人體流行病學(xué)研究予以證實(shí)。

四、EC-ST與TST引起的復(fù)強(qiáng)反應(yīng)

結(jié)核菌素類(lèi)皮膚試驗(yàn)制品蛋白相對(duì)的免疫原性較低，PPD與重組EC蛋白豚鼠致敏效應(yīng)研究結(jié)果都表明，即使以高濃度樣品3次以上致敏動(dòng)物后，以同品種變態(tài)反應(yīng)原進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，也無(wú)法誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生DTH。但在臨床實(shí)踐中，皮膚試驗(yàn)陰性人群在3個(gè)月后再次做皮膚試驗(yàn)，部分人群可能表現(xiàn)為陽(yáng)性。這在結(jié)核病聚集性暴發(fā)疫情需進(jìn)行二次皮膚試驗(yàn)時(shí)，可能影響結(jié)果的可靠性。中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)在《學(xué)校結(jié)核病防控工作規(guī)范(2017版)》[13]中明確規(guī)定：“對(duì)密切接觸者中初次篩查T(mén)ST非強(qiáng)陽(yáng)性者，應(yīng)當(dāng)在2～3個(gè)月后再進(jìn)行TST篩查，以便早期發(fā)現(xiàn)初次篩查時(shí)仍處于窗口期的新近感染者”。在重組EC蛋白的臨床評(píng)價(jià)研究中，健康受試者經(jīng)EC-ST、T-SPOT.TB、TST等3種方法篩選均為陰性反應(yīng)者作為結(jié)核分枝桿菌未感染者，對(duì)其接種卡介苗或安慰劑，12周后再進(jìn)行上述3種方法檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)161例安慰劑接種者接種后12周再次進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，EC-ST、T-SPOT.TB、TST在該人群的診斷特異度(陰性符合率)分別為88.20%、93.17%、60.87%[8]。傳統(tǒng)TST的復(fù)強(qiáng)反應(yīng)嚴(yán)重程度明顯高于重組EC蛋白，該結(jié)果提示在結(jié)核病聚集性暴發(fā)疫情發(fā)生需進(jìn)行流行病學(xué)篩查時(shí)，EC-ST優(yōu)于傳統(tǒng)TST。

EC的使用

EC皮膚試驗(yàn)可單獨(dú)用于結(jié)核病輔助診斷或LTBI的篩查；也可與PPD聯(lián)合使用，用于結(jié)核疫苗免疫接種人群的篩選與疫苗接種效果的評(píng)價(jià)，使用方式見(jiàn)表1。

表1 EC單獨(dú)或聯(lián)合PPD進(jìn)行皮膚試驗(yàn)的用途

一、EC單獨(dú)使用

(一)用于菌陰肺結(jié)核輔助診斷與LTBI高危人群的篩查

在結(jié)核病診斷技術(shù)研究中，多數(shù)研究者更關(guān)注菌陽(yáng)結(jié)核病患者，更偏重于與病原體相關(guān)的核酸檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)，忽略了絕大多數(shù)菌陰結(jié)核病患者核酸檢測(cè)依然陰性，核酸檢測(cè)技術(shù)無(wú)法明顯提高菌陰結(jié)核病患者的檢出率。根據(jù)中國(guó)2000年和2010年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果，2010年全國(guó)活動(dòng)性、涂陽(yáng)和菌陽(yáng)肺結(jié)核患病率與2000年相比均呈下降趨勢(shì)，其中涂陽(yáng)肺結(jié)核患病率年遞降率為9.0%，菌陽(yáng)肺結(jié)核患病率年遞降率為5.8%，但活動(dòng)性肺結(jié)核患病率下降率僅為0.2%，年遞降率緩慢；活動(dòng)性肺結(jié)核患者中菌陰肺結(jié)核患者的比率則由2000年的53.64%上升到74.07%。由此可知，中國(guó)結(jié)核病患者主要為菌陰患者。對(duì)菌陰患者而言， EC為臨床輔助診斷提供了新的選擇。

此外，依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，活動(dòng)性肺結(jié)核患者中，未被發(fā)現(xiàn)的患者占89.5%，明顯高于2000年時(shí)新發(fā)現(xiàn)患者所占的比率(68.8% )；在未被發(fā)現(xiàn)的患者中無(wú)癥狀者2000年為12.1%，2010年則為43.1%，如果不對(duì)這些無(wú)癥狀結(jié)核病患者或LTBI者實(shí)施主動(dòng)篩查，并采取相應(yīng)的治療或預(yù)防措施，終結(jié)結(jié)核病則難以實(shí)現(xiàn)。考慮到全民篩查不太現(xiàn)實(shí)，應(yīng)采用合理的篩查方式對(duì)結(jié)核感染高危人群實(shí)施篩查，可包括：(1)與結(jié)核病患者關(guān)聯(lián)的高風(fēng)險(xiǎn)者，如結(jié)核病患者密切接觸者、醫(yī)護(hù)人員、聚集性結(jié)核病暴發(fā)相關(guān)人群。(2)與其他疾病關(guān)聯(lián)的高風(fēng)險(xiǎn)者，如HIV感染者、糖尿病患者、風(fēng)濕病，以及接受免疫抑制劑治療者、透析患者、矽肺患者等。(3)特殊人群、特殊環(huán)境中的高風(fēng)險(xiǎn)者，如羈押人員、社區(qū)中老年人群、結(jié)核病高發(fā)區(qū)人群、流浪者、藥物濫用者、外來(lái)務(wù)工群居人員。(4)國(guó)家規(guī)定須進(jìn)行LTBI篩查和預(yù)防性治療的人群，如《學(xué)校結(jié)核病防控工作規(guī)范(2017版)》規(guī)定，需加強(qiáng)學(xué)校LTBI者的篩查和預(yù)防性治療；中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)印發(fā)的《中國(guó)結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范(2020版)》提出，推行LTBI者中高危人群開(kāi)展預(yù)防性治療，特別是HIV感染者及艾滋病患者、病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核患者5歲及以下兒童密切接觸者，以及其他LTBI高危人群。

(二)EC-ST與其他診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較

目前，結(jié)核病其他免疫學(xué)診斷方法主要有IGRA、血清學(xué)檢測(cè)與TST；IGRA在結(jié)核病輔助診斷與LTBI者篩查中具有較高的特異度，但實(shí)驗(yàn)步驟多，操作相對(duì)復(fù)雜、難以標(biāo)準(zhǔn)化，不適合作為大規(guī)模人群篩查的工具；且價(jià)格昂貴，難以在貧困地區(qū)推廣應(yīng)用。結(jié)核血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)由于可能產(chǎn)生假陽(yáng)性與假陰性，WHO在其政策建議中指出，使用目前市面上商業(yè)性血液(血清學(xué))檢測(cè)手段診斷活動(dòng)性結(jié)核病，常常導(dǎo)致誤診和不當(dāng)治療，進(jìn)而損害公眾健康。WHO敦促各國(guó)采用WHO推薦的準(zhǔn)確的微生物或分子檢測(cè)方法，禁止使用不準(zhǔn)確的和未經(jīng)批準(zhǔn)的血液檢測(cè)方法。TST是使用歷史最悠久的結(jié)核病輔助診斷方法，雖然方法簡(jiǎn)便，但所用試劑(PPD)無(wú)法區(qū)分卡介苗接種與結(jié)核分枝桿菌感染，在中國(guó)15歲以上人口中TST的陽(yáng)性率高達(dá)44.5%，以TST作為結(jié)核病輔助診斷方法的假陽(yáng)性率偏高、特異度欠佳。

EC-ST采用傳統(tǒng)TST的簡(jiǎn)便技術(shù)，同時(shí)兼具IGRA檢測(cè)的特異度，主要優(yōu)點(diǎn)見(jiàn)表2。

表2 各類(lèi)優(yōu)點(diǎn)在3種潛伏性結(jié)核感染人群篩查方法中的比較

二、EC與PPD聯(lián)合使用

通常傳染性疾病的免疫預(yù)防主要針對(duì)未感染人群，而結(jié)核病疫苗的接種對(duì)象存在未接種卡介苗或卡介苗接種后陰轉(zhuǎn)人群、卡介苗接種后依然維持陽(yáng)性人群，以及LTBI三類(lèi)人群；這三類(lèi)人群中免疫背景與感染狀態(tài)不同，采用的疫苗也將不同。結(jié)核病免疫預(yù)防對(duì)象的篩查可采用同體雙臂方式以TST和EC-ST檢測(cè)結(jié)果為免疫標(biāo)識(shí)，區(qū)分未接種卡介苗或卡介苗接種后陰轉(zhuǎn)人群、卡介苗接種后依然維持陽(yáng)性人群及LTBI三類(lèi)人群，分別接種不同類(lèi)型疫苗(表3)。

表3 EC-ST與TST聯(lián)合使用結(jié)果判讀與預(yù)防措施

TST與EC-ST檢測(cè)均陰性者鑒別為未接種卡介苗或接種后陰轉(zhuǎn)人群，可接種卡介苗或初免用結(jié)核疫苗；TST陽(yáng)性和EC-ST陰性者鑒定為接種卡介苗后維持陽(yáng)性人群，可接種加強(qiáng)免疫用疫苗；TST陽(yáng)性或陰性和EC-ST陽(yáng)性者鑒定為L(zhǎng)TBI人群，可通過(guò)免疫治療方式預(yù)防感染人群發(fā)展為結(jié)核病。

結(jié) 語(yǔ)

結(jié)核分枝桿菌重組變態(tài)反應(yīng)原的研究已有20余年，但目前國(guó)內(nèi)外在研的品種并不多，除了我國(guó)的EC試劑外，國(guó)外主要有丹麥血清學(xué)研究所(SSI)研發(fā)的混合ESAT-6和CFP-10的C-tb試劑，以及俄羅斯研發(fā)的ESAT-6和CFP-10融合蛋白的 Diaskintest試劑。在WHO[14]《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》中首次介紹了上述2種試劑及重組結(jié)核分枝桿菌變態(tài)反應(yīng)原皮膚試驗(yàn)檢測(cè)方法，WHO認(rèn)為：這種基于皮膚試驗(yàn)對(duì)新感染檢測(cè)方法的出現(xiàn)，可最大限度地實(shí)施檢測(cè)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)，并有提高對(duì)LTBI診治水平的潛力，與傳統(tǒng)的TST相比可提高和改善特異度；該方法與IGRA相比，上述2種檢測(cè)方法具有相似的特異度，可為IGRA測(cè)試提供準(zhǔn)確、可接受和更便宜的替代方案。

由于不同產(chǎn)品的臨床研究方案不同，目前除結(jié)核病患者檢測(cè)數(shù)據(jù)外，尚不能將國(guó)內(nèi)的EC試劑與C-tb與Diaskintest試劑的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行直接比較。根據(jù)C-tb的Ⅲ期臨床研究[15]與Diaskintest研究者在2019年最新發(fā)表的結(jié)核病患者檢測(cè)數(shù)據(jù)[16]， EC試劑檢測(cè)的敏感度大于93%,優(yōu)于C-tb的72% 和Diaskintest的68%；可能的原因是EC在重組蛋白構(gòu)建、人用劑量的選擇方面較國(guó)外產(chǎn)品更為合理。但EC尚缺少大規(guī)模的臨床驗(yàn)證，如缺少EC皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)與結(jié)核病發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)性的研究數(shù)據(jù)；缺少EC皮膚試驗(yàn)對(duì)糖尿病、風(fēng)濕病患者等特殊人群的研究數(shù)據(jù)；缺少3歲以下65歲以上大樣本人群的安全性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)；缺少皮膚試驗(yàn)最佳觀察時(shí)間及不同膚色對(duì)皮膚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果判讀的影響等數(shù)據(jù)。這些都需要廣大醫(yī)護(hù)工作者在今后的臨床研究中做出共同努力，以便得到進(jìn)一步完善。