張凱 沈小兵 陶立峰 韋芬 陳保文 仇晶晶 陳偉 盧錦標(biāo) 朱銀猛 程興 鐘再新 趙愛(ài)華 蒲江

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立、研究及評(píng)估是新藥研究的主要內(nèi)容之一。新藥研發(fā)過(guò)程中需要結(jié)合產(chǎn)品特性，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)和深入的研究，并由此制定出合理和可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確保藥品質(zhì)量的穩(wěn)定、安全及有效性。重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)[該制品名稱是國(guó)家藥典委員會(huì)確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)”](簡(jiǎn)稱“EC”)是安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司生產(chǎn)的一種新型皮膚試驗(yàn)體內(nèi)診斷試劑，可以用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染、輔助結(jié)核病臨床診斷、鑒別卡介苗(BCG)接種與結(jié)核分枝桿菌感染。同時(shí)，可與結(jié)核菌素純蛋白衍生物聯(lián)合用于不同免疫與感染背景BCG接種者篩選。本研究建立了重組EC原液及成品的質(zhì)量控制(簡(jiǎn)稱“質(zhì)控”)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)EC原液和成品進(jìn)行了檢定，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料和方法

一、材料及試劑

1.實(shí)驗(yàn)材料：EC原液及成品均由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司研制，其中，EC原液共6批次，批號(hào)分別為M20170902、M20170903、M20171001、M20171101、M20171102、M20171201；EC成品共11批次，0.3 ml/瓶(15 U)規(guī)格的批號(hào)分別為20171102、20171205、20171208、20180102；0.5 ml/瓶(25 U)規(guī)格的批號(hào)分別為20171101、20171204、20171205、20180101；1.0 ml/瓶(50 U)規(guī)格的批號(hào)分別為20171203、20171206、20171209。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：無(wú)特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)白色豚鼠，體質(zhì)量300～400 g，共21只，其中雌性豚鼠18只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)菌株：BCG活菌菌液，濃度為1 mg/ml，由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備。結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra活菌菌液，濃度為2 mg/ml，由復(fù)旦大學(xué)三級(jí)安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

4.主要試劑：TB-PPD購(gòu)自北京祥瑞生物制品有限公司；EC原液效力評(píng)價(jià)用參考品、EC成品效力評(píng)價(jià)用參考品及EC原液理化檢定用參考品均由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供；增強(qiáng)型辣根過(guò)氧化物酶(HRP-DAB)底物顯色試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；濾紙和硝酸纖維素膜為德國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；EC兔多抗由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌宿主殘留蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cygnus公司；卡那霉素殘留量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

二、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

(一)EC原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

EC原液中“殘余抗生素活性”“致敏效應(yīng)試驗(yàn)”“效價(jià)測(cè)定”及“動(dòng)物法鑒別實(shí)驗(yàn)”方法及標(biāo)準(zhǔn)為本研究自建方法，其余檢測(cè)項(xiàng)依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版(三部)建立。

1.殘余抗生素活性檢測(cè)：分別吸取卡那霉素殘留量檢測(cè)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品和EC原液20 μl加至酶標(biāo)板的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)品和EC原液均做2個(gè)平行孔，然后加入酶標(biāo)二抗50 μl/孔，再加入抗體工作液80 μl/孔，振蕩混勻，25 ℃避光反應(yīng)40 min。洗滌液洗板5次。分別以50 μl/孔加入底物液A液、底物液B液，25 ℃避光反應(yīng)15 min。若顯色顏色較淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20 min，但不得超過(guò)25 min，反之則減短反應(yīng)時(shí)間。以50 μl/孔加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450/630 nm處測(cè)定吸光度值(A值)，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的A值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得參數(shù)擬合曲線方程。

采用連續(xù)3批EC原液對(duì)上述建立的方法進(jìn)行專屬性、線性與范圍、準(zhǔn)確性、重復(fù)性、中間精密度和耐用性等驗(yàn)證。(1)專屬性實(shí)驗(yàn)：分別應(yīng)用EC原液的稀釋劑[磷酸鹽緩沖溶液(PBS)]和0.0 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者之間的A值。(2)線性與范圍實(shí)驗(yàn)：取試劑盒中濃度為0.0 ng/ml、0.5 ng/ml、1.5 ng/ml、4.5 ng/ml、13.5 ng/ml、40.5 ng/ml的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析并計(jì)算擬合優(yōu)度的判定系數(shù)R2。(3)準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)(回收率)：取EC原液，首先將本品原液等體積加入13.5 ng/ml卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品，作為加入卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品的樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次A值；將A值的平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得卡那霉素濃度，計(jì)算回收率，回收率=(加入卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(13.5 ng/ml)的EC原液樣品的卡那霉素濃度測(cè)定值×2-EC原液的卡那霉素濃度測(cè)定值)/加入卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度值(13.5 ng/ml)×100%。(4)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取EC原液，按照上述建立的方法對(duì)每批原液重復(fù)測(cè)定6次，根據(jù)每批原液測(cè)得的A值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。(5)中間精密度實(shí)驗(yàn)：同一名實(shí)驗(yàn)員不同時(shí)間，以及不同實(shí)驗(yàn)員分別取EC原液按照上述建立的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到不同條件下EC原液中卡那霉素的濃度，對(duì)此數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。(6)耐用性實(shí)驗(yàn)：取連續(xù)3批EC原液按照上述建立的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；在雙波長(zhǎng)450/630 nm處測(cè)定A值時(shí)，連續(xù)檢測(cè)3次，每次間隔5 min，根據(jù)不同條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合優(yōu)度的判定系數(shù)R2及EC原液中卡那霉素的濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2.致敏效應(yīng)實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別選用體質(zhì)量300～400 g SPF級(jí)白色豚鼠各3只(雌雄不限)，實(shí)驗(yàn)組每只豚鼠皮內(nèi)注射0.1 ml 含5 μg 蛋白的EC原液稀釋溶液，共3次，每次間隔5 d。在第3次注射后15 d，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組每只豚鼠各皮內(nèi)注射0.1 ml含5 μg 蛋白的EC原液稀釋溶液，連續(xù)觀察3 d，比較兩組動(dòng)物全身反應(yīng)及注射部位局部反應(yīng)。

3.效價(jià)測(cè)定：選取2批次EC原液參考品(批號(hào)分別為M20101202和M20160301)，分別稀釋至1 μg/ml(5 U/ml)、2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml(50 U/ml)等4個(gè)稀釋度，根據(jù)劑量效應(yīng)曲線確定合適的稀釋度建立效價(jià)測(cè)定的方法。建立的檢測(cè)方法為：取6只經(jīng)TB-PPD皮膚試驗(yàn)陰性的300～400 g SPF級(jí)雌性豚鼠，于每只豚鼠大腿腹股溝內(nèi)側(cè)皮下注射結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra活菌菌液0.5 ml，致敏5周后備用；將EC原液效力評(píng)價(jià)用參考品稀釋為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)，將EC原液稀釋為2.5 μg/ml、5 μg/ml及10 μg/ml；取上述6只經(jīng)結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra活菌致敏5周后的豚鼠，去毛后每只豚鼠于背部脊柱兩側(cè)以輪圈法分別皮內(nèi)注射上述3種稀釋度EC原液及參考品各0.2 ml，于注射后24 h測(cè)量局部反應(yīng)硬結(jié)或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))。統(tǒng)計(jì)6只豚鼠每個(gè)稀釋度注射后24 h硬結(jié)或紅暈平均直徑總和，并求每個(gè)稀釋度EC原液與相應(yīng)稀釋度參考品的硬結(jié)或紅暈平均直徑總和的比值。

4.動(dòng)物法鑒別實(shí)驗(yàn)：取4只經(jīng)TB-PPD皮膚試驗(yàn)陰性的體質(zhì)量300～400 g SPF級(jí)雌性豚鼠，于每只豚鼠大腿腹股溝內(nèi)側(cè)皮下注射BCG菌液0.2 ml，致敏4周后備用；取上述致敏4周后的豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛，以輪圈法于豚鼠去毛部位皮內(nèi)分別注射0.2 ml 20 μg/ml稀釋后的EC原液與50 IU/ml TB-PPD，于注射后48 h觀察并測(cè)量TB-PPD皮膚試驗(yàn)的硬結(jié)平均直徑和EC原液的硬結(jié)或紅暈平均直徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))，根據(jù)48 h的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定。

5.其他檢測(cè)項(xiàng)目：EC原液外觀、蛋白質(zhì)含量、純度(電泳法)、純度(高效液相色譜法)、分子量、等電點(diǎn)、紫外光譜、肽圖、N-端氨基酸序列、外源性DNA殘留量、宿主菌蛋白質(zhì)殘留量、鑒別實(shí)驗(yàn)(免疫印跡法)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查、無(wú)菌檢查的質(zhì)控方法和標(biāo)準(zhǔn)按照《中國(guó)藥典》2015年版(三部)內(nèi)容建立。

(二)EC成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

EC成品中“鑒別實(shí)驗(yàn)”及“效價(jià)測(cè)定”方法及標(biāo)準(zhǔn)為本研究自建方法，其余檢測(cè)項(xiàng)依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版(三部)建立。

1.鑒別實(shí)驗(yàn)：取4只經(jīng)TB-PPD皮膚試驗(yàn)陰性的體質(zhì)量300～400 g SPF級(jí)雌性豚鼠，于每只豚鼠大腿腹股溝內(nèi)側(cè)皮下注射BCG菌液0.2 ml，致敏4周后備用；取上述致敏4周后的豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛，以輪圈法于豚鼠去毛部位皮內(nèi)分別注射0.2 ml EC成品與50 IU/ml TB-PPD，于注射后48 h 觀察并測(cè)量TB-PPD皮膚試驗(yàn)的硬結(jié)平均直徑和EC成品的硬結(jié)或紅暈平均直徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))，根據(jù)48 h的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定。

2.效價(jià)測(cè)定：參照EC原液效價(jià)測(cè)定方法。

3.其他檢測(cè)項(xiàng)目：EC成品外觀、可見(jiàn)異物、裝量、滲透壓摩爾濃度、不溶性微粒檢查、pH值、苯酚含量、無(wú)菌、異常毒性檢查的質(zhì)控方法和標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)藥典》2015年版(三部)建立。

(三)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證

應(yīng)用建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)連續(xù)6批次EC原液和11批次EC成品進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其適用性和可行性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、EC原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和驗(yàn)證

(一)殘余抗生素活性檢測(cè)

1.專屬性實(shí)驗(yàn)：PBS溶液的A值為1.736，卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品(0.0 ng/ml)的A值為2.178。

2.線性與范圍實(shí)驗(yàn)：卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品在0.5～40.5 ng/ml范圍內(nèi)，連續(xù)3次實(shí)驗(yàn)回歸方程擬合優(yōu)度的判定系數(shù)R2均大于0.99。

3.準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)：連續(xù)3批EC原液的卡那霉素殘留量回收率分別為112.163%、117.285%、103.527%，回收率均在80%～120%之間。

4．重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：連續(xù)3批EC原液分別測(cè)定6次，A值分別為1.754±0.098、1.783±0.164、1.781±0.144，重復(fù)性試驗(yàn)A值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為5.59%、9.18%、8.07%，RSD均小于20%。

5.中間精密度實(shí)驗(yàn)：同一實(shí)驗(yàn)員不同時(shí)間及不同實(shí)驗(yàn)員檢測(cè)連續(xù)3批EC原液，卡那霉素殘留量均小于定量限0.5 ng/ml，為限量測(cè)定。

6.耐用性實(shí)驗(yàn)：改變讀板時(shí)間(0、5、10 min)對(duì)EC原液卡那霉素殘留量檢測(cè)無(wú)影響，3批原液各個(gè)讀板時(shí)間檢測(cè)的卡那霉素殘留量均小于定量限0.5 ng/ml。

7.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證：連續(xù)6批次EC原液卡那霉素殘留量的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，檢測(cè)結(jié)果均低于定量限0.5 ng/ml，為限量測(cè)定，表明該方法適合用于EC原液卡那霉素殘留量的測(cè)定。

表1 連續(xù)6批次EC原液殘余抗生素檢測(cè)結(jié)果

(二)致敏效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)已建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)連續(xù)6批次EC原液進(jìn)行致敏效應(yīng)試驗(yàn)，皮膚試驗(yàn)后連續(xù)3 d實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組動(dòng)物注射部位局部反應(yīng)無(wú)明顯區(qū)別，兩組動(dòng)物也無(wú)全身反應(yīng)。

(三)效價(jià)測(cè)定

1.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立：2批次EC原液參考品的每個(gè)稀釋度皮膚試驗(yàn)的硬結(jié)或紅暈平均直徑均≥8 mm，當(dāng)稀釋度為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml(50 U/ml)時(shí)，批次間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；2個(gè)批次EC原液參考品每個(gè)稀釋度皮膚試驗(yàn)的硬結(jié)或紅暈平均直徑總和比值均在1.0±0.2范圍之內(nèi)，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度各批次EC原液效價(jià)測(cè)定結(jié)果的比較

2.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證：對(duì)連續(xù)6批次EC原液效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)每個(gè)稀釋度在注射后24 h所產(chǎn)生的局部反應(yīng)硬結(jié)或紅暈的平均直徑均≥8 mm；每個(gè)稀釋度本品與相應(yīng)稀釋度參考品的局部硬結(jié)或紅暈反應(yīng)平均直徑總和的比值為0.9±0.1，均在1.0±0.2范圍內(nèi)。

(四)動(dòng)物法鑒別實(shí)驗(yàn)

1.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立：連續(xù)3個(gè)批次重組EC原液的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果(硬結(jié)或紅暈平均直徑)為0，TB-PPD 硬結(jié)平均直徑為(15.13±5.06) mm。

2. 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證：連續(xù)6批次EC原液對(duì)BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗(yàn)均呈陰性反應(yīng)(硬結(jié)或紅暈平均直徑<5 mm)，而TB-PPD對(duì)BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng)(硬結(jié)平均直徑≥5 mm)。

(五)其他項(xiàng)目檢測(cè)

對(duì)連續(xù)6批次EC原液進(jìn)行其他檢項(xiàng)的驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 理化、生化、純度、安全等指標(biāo)檢測(cè)EC原液的結(jié)果

二、EC成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和驗(yàn)證

1.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立：連續(xù)3批次EC成品的動(dòng)物皮膚試驗(yàn)結(jié)果(硬結(jié)或紅暈平均直徑)為0，TB-PPD硬結(jié)平均直徑為(16.50±2.65) mm。

2.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證：連續(xù)3種不同規(guī)格11批次EC成品對(duì)BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗(yàn)均呈陰性反應(yīng)(硬結(jié)或紅暈平均直徑<5 mm)，而TB-PPD 對(duì)BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗(yàn)均呈陽(yáng)性反應(yīng)(硬結(jié)平均直徑≥5 mm)。

3.其他項(xiàng)目檢測(cè)：根據(jù)已建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)3種不同規(guī)格連續(xù)11批次EC成品進(jìn)行其他項(xiàng)目的檢定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 成品理化、生化、純度等指標(biāo)檢測(cè)EC的結(jié)果

討 論

藥品的質(zhì)量研究和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定是藥物研發(fā)的主要內(nèi)容之一。科學(xué)、合理、可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)直接關(guān)系到藥品質(zhì)量的安全性、有效性和可控性[1]。確定質(zhì)量研究?jī)?nèi)容時(shí)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的特性，采用多批次生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的樣品進(jìn)行，使得質(zhì)量研究的內(nèi)容能夠充分反映藥品的特性及質(zhì)量變化情況。

EC是一種新型皮膚試驗(yàn)體內(nèi)診斷試劑，屬于國(guó)家一類新藥，目前已獲得藥品注冊(cè)批件。在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定過(guò)程中，由于尚無(wú)相應(yīng)的檢定標(biāo)準(zhǔn)，本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立不僅參考了《中國(guó)藥典》2015年版(三部)、《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)一般原則》等文件；而且，也結(jié)合了本產(chǎn)品的特性，從安全性、有效性等方面自建了部分檢測(cè)項(xiàng)目。由于本品在種子液的制備過(guò)程中加入了卡那霉素，故從安全性角度考慮，在EC原液檢測(cè)項(xiàng)中新建了“殘余抗生素活性測(cè)定”方法。EC為單一重組的相對(duì)分子質(zhì)量為23 000的蛋白產(chǎn)品，并且屬于體內(nèi)注射生物制品。根據(jù)該蛋白性質(zhì)，理論上存在可能的致敏效應(yīng)，可能會(huì)影響到受試者的生命健康。故從安全性角度考慮，在EC原液檢測(cè)項(xiàng)中新建了“致敏效應(yīng)實(shí)驗(yàn)”方法。本品的特性類似于結(jié)核菌素純蛋白衍生物等產(chǎn)品，是通過(guò)皮膚試驗(yàn)的局部反應(yīng)來(lái)進(jìn)行結(jié)果判斷的，故從有效性方面考慮，在EC原液及成品檢測(cè)項(xiàng)中又新建了“效價(jià)測(cè)定”及“鑒別實(shí)驗(yàn)”的方法。

在對(duì)本品自建的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，EC原液檢測(cè)項(xiàng)中“殘余抗生素活性測(cè)定”和“效價(jià)測(cè)定”則經(jīng)過(guò)了相關(guān)方法學(xué)的驗(yàn)證。其中，“殘余抗生素活性測(cè)定”方法，通過(guò)了專屬性、線性與范圍、準(zhǔn)確性試驗(yàn)、重復(fù)性、中間精密度和耐用性等驗(yàn)證。專屬性驗(yàn)證，結(jié)果表明EC原液的稀釋劑——PBS溶液不會(huì)影響到該方法測(cè)定的結(jié)果。線性與范圍驗(yàn)證結(jié)果表明本法線性較好，EC原液卡那霉素殘留量在0.5～40.5 ng/ml范圍內(nèi)可定量測(cè)定，即定量限為0.5 ng/ml；當(dāng)卡那霉素殘留量低于0.5 ng/ml時(shí)應(yīng)為限量測(cè)定，表示為小于0.5 ng/ml。準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果表明本品對(duì)卡那霉素殘留量的檢測(cè)沒(méi)有影響。重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果表明重復(fù)性良好。中間精密度驗(yàn)證結(jié)果表明同一實(shí)驗(yàn)員不同時(shí)間和不同實(shí)驗(yàn)員檢測(cè)連續(xù)3批次樣品卡那霉素殘留量均低于定量限0.5 ng/ml，實(shí)驗(yàn)的中間精密度良好。耐用性驗(yàn)證結(jié)果表明改變讀板時(shí)間對(duì)重組EC原液卡那霉素殘留量檢測(cè)無(wú)影響，耐用性良好。綜上，通過(guò)卡那霉素殘留量測(cè)定方法的驗(yàn)證，表明該方法適合用于EC原液殘余抗生素活性的測(cè)定。另外，EC皮膚試驗(yàn)可誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌感染者產(chǎn)生局部特異性紅暈或硬結(jié)反應(yīng)，陽(yáng)性者中存在紅暈大于硬結(jié)或硬結(jié)大于紅暈現(xiàn)象，不能單獨(dú)以紅暈或者單獨(dú)以硬結(jié)作為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。因此，EC宜以注射部位的紅暈或硬結(jié)反應(yīng)大者為陽(yáng)性反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，筆者選取2批次EC原液參考品的4個(gè)稀釋度進(jìn)行了效價(jià)測(cè)定方法的建立。結(jié)果表明，每個(gè)稀釋度在皮內(nèi)注射后24 h所產(chǎn)生的局部硬結(jié)或紅暈平均直徑均≥8 mm，且2批次EC原液參考品的每個(gè)稀釋度在注射后24 h所產(chǎn)生的硬結(jié)或紅暈平均直徑總和的比值均在1.0±0.2范圍內(nèi)；但稀釋度為1 μg/ml(5 U/ml)時(shí)，兩批次EC原液參考品在注射后24 h所產(chǎn)生的硬結(jié)或紅暈平均直徑的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的敏感度最終選擇EC原液效價(jià)測(cè)定的稀釋度為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)等3個(gè)稀釋度。

EC是由高效表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT-6與CFP-10基因的大腸埃希菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和純化后獲得的。由于BCG不含有ESAT-6和CFP-10這2個(gè)基因片段，而皮膚試驗(yàn)用試劑TB-PPD又存在于BCG及結(jié)核分枝桿菌中，因此，EC原液及成品的“鑒別實(shí)驗(yàn)”均選取BCG活菌進(jìn)行動(dòng)物的致敏，并最終通過(guò)TB-PPD的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)行鑒別。在此方法的建立過(guò)程中，筆者選取連續(xù)3個(gè)批次EC原液及連續(xù)3個(gè)批次的EC成品進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明EC原液及成品對(duì)BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗(yàn)均呈陰性反應(yīng)，而TB-PPD對(duì)BCG活菌致敏組豚鼠的皮膚試驗(yàn)均呈陽(yáng)性反應(yīng)。EC成品的“效價(jià)測(cè)定”方法是參照EC原液“效價(jià)測(cè)定”方法建立的，由于EC原液“效價(jià)測(cè)定”選取了2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)及10 μg/ml (50 U/ml)3個(gè)稀釋度；而EC成品的濃度為10 μg/ml (50 U/ml)，故該濃度適合成品的“效價(jià)測(cè)定”。

為了驗(yàn)證已建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法科學(xué)、合理及可行性，筆者依據(jù)已建立的方法，又進(jìn)行了連續(xù)6批次EC原液和3種不同規(guī)格連續(xù)11批次成品的檢定，所有檢測(cè)結(jié)果均符合制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，表明建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)適用于該產(chǎn)品的檢定。