都偉欣 韋芬 盧錦標(biāo) 趙愛華 蒲江 王國治 徐苗

重組結(jié)核桿菌融合蛋白(EC)[該制品名稱是國家藥典委員會確定的藥品中文通用名稱，“EC”為重組融合蛋白“結(jié)核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)”](以下簡稱“EC”)是由ESAT-6和CFP-10的基因經(jīng)融合表達(dá)、系列純化后制備而成的皮膚試驗(yàn)試劑，具有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群抗原特異性，可將其作為變態(tài)反應(yīng)原用于結(jié)核感染篩查[1-5]；或與結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)聯(lián)用，用于鑒別卡介苗接種與結(jié)核感染，區(qū)分卡介苗接種后陰轉(zhuǎn)或無結(jié)核感染、卡介苗接種后維持陽性、結(jié)核感染這三類人群；也可用于結(jié)核病的臨床輔助診斷。因此，該類產(chǎn)品在臨床使用中的效價(jià)非常關(guān)鍵，但目前EC作為新上市的產(chǎn)品，并無相應(yīng)的國家或國際參考品以評估其原液效價(jià)、監(jiān)測其產(chǎn)品質(zhì)量。為此，中國食品藥品檢定研究院開展了凍干EC原液效力評價(jià)用國家參考品的研制工作，以期為規(guī)范此類產(chǎn)品效價(jià)的檢測、促進(jìn)檢定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化提供支持。

材料和方法

一、原材料

1.凍干EC原液：批號M20170901；規(guī)格為508 μg/瓶，1 ml安瓿瓶；委托安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司制備。該凍干品作為本研究的候選國家參考品。

2. EC原液：批號M20101202和M20170901，均為液體劑型，由安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司提供。

3.動(dòng)物致敏用菌株：結(jié)核分枝桿菌CMCC(B) 93020(H37Ra)活菌菌液，濃度2 mg/ml，本室制備。

4. 動(dòng)物：(1)無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級Hartley豚鼠：性別不限，由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0013。在中國食品藥品檢定研究院分枝桿菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的負(fù)壓動(dòng)物房飼養(yǎng)。(2)穩(wěn)定性評價(jià)用SPF級Hartley豚鼠：雌性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011。在上海復(fù)旦大學(xué)三級動(dòng)物生物安全實(shí)驗(yàn)室(ABSL-3C)的負(fù)壓區(qū)飼養(yǎng)。每只豚鼠大腿腹股溝皮下注射0.5 ml H37Ra活菌菌液。

二、主要試劑和儀器

牛血清白蛋白(21.8 mg/支)由本院提供；丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、溴酚藍(lán)、Tween 80、考馬斯亮藍(lán)R250均為VER Life Science Amresco公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉(SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺均為西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)(上海)貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；蛋白Marker為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Na2HPO4·12H2O(色譜級)、NaH2PO4·2H2O(色譜級)、NaCl(色譜級)為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品。卡爾費(fèi)休試劑為上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；無水甲醇為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2450)為島津儀器(蘇州)有限公司產(chǎn)品；電子天平(BSA623S-CW)、(SECURA225D-1CN)為賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；旋渦混合器為上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；電泳儀電源、垂直電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Gel DOCTM EZ)為伯樂(Bio-Rad)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀(LC1260)為安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品；卡爾費(fèi)休滴定儀(DL38)為梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品。

三、候選國家參考品的制備及質(zhì)量控制

按照EC原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對備選凍干EC原液(批號：M20170901)進(jìn)行純度檢定，合格后以0.5 ml/安瓿瓶每支均精確稱量進(jìn)行分裝，同時(shí)也完成了候選國家參考品的均勻性檢測。分裝后凍干成為EC變態(tài)反應(yīng)原原液效力評價(jià)用國家參考品的候選品。按照《中國藥典(2015年版 三部)》[6]對候選國家參考品進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和水分等質(zhì)量檢測。

1.純度測定及質(zhì)量要求：對EC原液采用電泳法和高效液相色譜法(HPLC)兩種方法進(jìn)行純度檢驗(yàn)，確證純度符合要求。電泳法：采用非還原型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法，分離膠濃度為12.5%，加樣量應(yīng)≥10 μg (考馬斯亮藍(lán)R250染色法)，經(jīng)掃描儀掃描，純度≥95.0%為合格。高效液相色譜法：色譜柱為Phenomenex BioSep-SEC-S2000(7.8 mm×300 mm)，流動(dòng)相為pH=7.0的0.1 mol/L磷酸鹽-氯化鈉緩沖液(磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉按比例進(jìn)行配制，磷酸根濃度為0.1 mol/L)；上樣量≥10 μg，于波長280 nm處檢測，認(rèn)為EC原液蛋白主峰計(jì)算的理論板數(shù)應(yīng)不低于1000時(shí)，分離效果未受影響。按面積歸一化法計(jì)算，以EC原液蛋白主峰面積≥95.0%總面積為合格。

2.蛋白質(zhì)含量測定及質(zhì)量要求：采用福林酚檢驗(yàn)方法對候選國家參考品進(jìn)行蛋白含量檢定，結(jié)果應(yīng)不低于450 μg/瓶。

3.水分測定及質(zhì)量要求：以卡爾費(fèi)休滴定法對候選國家參考品進(jìn)行檢定，水分含量應(yīng)不高于3.0%。

四、均勻性檢測

取1 ml EC原液進(jìn)行稱重，根據(jù)質(zhì)量體積比求得密度，再計(jì)算出每支分裝量為0.5 ml候選國家參考品的理論裝量，且每支均在分裝時(shí)進(jìn)行精密稱量，以保證裝量范圍控制在“(1±1%)每支理論裝量(g/支)”之間。

五、候選國家參考品的初步性能評價(jià)

1. 確定候選國家參考品效價(jià)測定用的適宜稀釋度：將候選國家參考品復(fù)溶后，分別稀釋至1.0 μg/ml(5 U/ml)、2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)、10 μg/ml(50 U/ml)和20 μg/ml(100 U/ml)。取6只已經(jīng)被H37Ra活菌致敏的豚鼠，去毛后于背部脊柱兩側(cè)分別于皮內(nèi)注射上述稀釋度樣品各0.1 ml，注射后24 h觀察并測量局部硬結(jié)或紅暈的縱徑和橫徑(取硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者)，計(jì)算硬結(jié)或紅暈反應(yīng)平均直徑(縱徑與橫徑相加除以2)，繪制皮膚試驗(yàn)硬結(jié)或紅暈反應(yīng)平均直徑大小(簡稱“反應(yīng)平均直徑大小”)與不同稀釋濃度所對應(yīng)的劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線。選擇注射后24 h所產(chǎn)生的局部硬結(jié)或紅暈反應(yīng)直徑≥8 mm、具有劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線有良好線性關(guān)系(R2≥0.9為線性良好)的3個(gè)稀釋度作為候選國家參考品進(jìn)行效價(jià)測定用的適宜稀釋度。

2. 候選國家參考品用于EC原液的效價(jià)測定標(biāo)定：將候選國家參考品與企業(yè)申報(bào)臨床用EC原液(批號：M20101202)分別稀釋至確定好的不同稀釋度，以輪圈法皮內(nèi)注射0.2 ml以上樣品于6只去毛的已經(jīng)被H37Ra活菌致敏豚鼠的背部脊柱兩側(cè)，注射后24 h觀察并測量局部硬結(jié)或紅暈的縱徑和橫徑(以硬結(jié)或紅暈反應(yīng)大者為準(zhǔn))，計(jì)算平均硬結(jié)或紅暈反應(yīng)(縱徑與橫徑相加除以2)。不同稀釋度候選國家參考品注射后產(chǎn)生的局部硬結(jié)或紅暈反應(yīng)直徑應(yīng)不小于8 mm，且能使不同稀釋度EC原液的反應(yīng)平均直徑大小均值與相應(yīng)稀釋度國家參考品相應(yīng)均值的比值滿足1.0±0.2，并且兩者的劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線趨勢應(yīng)相似或一致。

注 在波長為280 nm時(shí)檢測。保留時(shí)間為組分出峰達(dá)到最大值的時(shí)間。相對吸光強(qiáng)度值：1 mAU值=0.001 A值。峰高=相對吸光強(qiáng)度值(mAU)/(5.69×10-5)。USP為美國藥典委員會標(biāo)準(zhǔn)。理論塔板數(shù)是定量表示色譜柱的分離效率指標(biāo)，數(shù)值越大色譜柱效率越高，在USP標(biāo)準(zhǔn)下應(yīng)不低于1000；分離度表示相鄰兩峰的分離程度，數(shù)值越大表明相鄰兩組分分離越好，在USP標(biāo)準(zhǔn)下，當(dāng)數(shù)值為1.5時(shí)，稱為6σ分離，分離度(裸露峰面積)可達(dá)99.7%，以≥1.5為完全分離。不對稱性又稱拖尾因子，可檢驗(yàn)色譜峰是否對稱，預(yù)設(shè)<2.0為結(jié)果可靠，可以采用；S/N(6 σ)為6σ質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)下的檢驗(yàn)微量物質(zhì)的能力，不應(yīng)該低于10

3.效價(jià)測定的方法驗(yàn)證：本研究對候選國家參考品用于EC原液效價(jià)測定進(jìn)行了方法驗(yàn)證，該試驗(yàn)所用EC原液批號為M20170901。

4.初步穩(wěn)定性觀察：將-20 ℃放置24個(gè)月的候選國家參考品用于EC原液(批號M20170901)的效價(jià)測定。并在后期的使用過程中，將定期對該候選國家參考品進(jìn)行期間核查及長期穩(wěn)定性研究。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用配對t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、EC原液及候選國家參考品的檢驗(yàn)結(jié)果

EC原液采用非還原型SDS-PAGE法測定的蛋白純度為100.00%(圖1，僅有一條色帶，無其他雜帶)。高效液相色譜法結(jié)果顯示，目的蛋白出峰時(shí)間為10.823 min，主峰面積占總面積的95.33%，蛋白純度為95.33%(圖2)；水分含量4次測定結(jié)果分別為1.30%、1.71%、1.63%、1.64%，平均為1.57%；福林酚法測得侯選參考品蛋白質(zhì)含量為508 μg/瓶。

1為蛋白Marker[從上至下：97.2 kDa、66.4 kDa、44.3 kDa、29.0 kDa、20.1 kDa、14.3 kDa(1 kDa的相對分子質(zhì)量為1000)]；2為通過SDS-PAGE 檢測的EC原液蛋白純度圖1 SDS-PAGE電泳法備選EC原液蛋白純度檢測結(jié)果

二、均勻性檢測結(jié)果

取1 ml EC原液稱重，根據(jù)質(zhì)量體積比求得EC原液密度為1.037 g/ml，根據(jù)密度求出每支0.5 ml的理論裝量應(yīng)為0.519 g。分裝階段均進(jìn)行精密稱量，每支候選國家參考品分裝量范圍在0.514～0.524 g之間，因此，分裝精度控制在±1%以內(nèi)，均勻性檢測符合國家參考品制備要求。

三、確定候選國家參考品原液效價(jià)測定用適宜稀釋度

將進(jìn)行豚鼠皮膚試驗(yàn)的候選國家參考品不同稀釋度的劑量對數(shù)值與相應(yīng)的反應(yīng)平均直徑大小繪制劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線(圖3)，經(jīng)四參數(shù)擬合曲線方程為Y=9.922+(20.43-9.922)/[1+10(0.7786-X)×3.257](Y為反應(yīng)平均直徑大小，X為劑量對數(shù))，得出R2=0.8140。其中，1.0 μg/ml和2.5 μg/ml所對應(yīng)的反應(yīng)平均直徑大小(均值分別為10.3 mm和10.1 mm)，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.124，P=0.906)，處于平臺反應(yīng)期，劑量所對應(yīng)的反應(yīng)平均直徑大小無差異；10 μg/ml和20 μg/ml所對應(yīng)的反應(yīng)平均直徑大小(均值分別為18.6 mm和20.3 mm)，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.236，P=0.076)，處于平臺反應(yīng)期；而在2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml稀釋度時(shí)線性關(guān)系最好(R2=0.9944)，可將這3個(gè)候選國家參考品的稀釋度確定為效價(jià)測定用適宜稀釋度。

四、候選國家參考品用于EC原液的效價(jià)測定及驗(yàn)證結(jié)果

將候選國家參考品用于EC原液的效價(jià)測定，其豚鼠皮試反應(yīng)結(jié)果顯示，不同稀釋度(2.5 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml)的EC原液和相應(yīng)稀釋度候選國家參考品皮膚試驗(yàn)反應(yīng)平均直徑大小均>8 mm，每個(gè)稀釋度EC原液和相應(yīng)稀釋度候選國家參考品反應(yīng)平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內(nèi)，且兩者劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線趨勢基本一致，線性方程分別為Y=4.152X+17.38(R2=0.9643)和Y=7.198X+17.16(R2=0.9878)(Y為反應(yīng)平均直徑大小，X為劑量對數(shù))(圖4)。

劑量對數(shù)值為不同稀釋濃度的對數(shù)值圖3 候選國家參考品梯度稀釋后不同劑量所對應(yīng)的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果

劑量對數(shù)值為不同稀釋濃度的對數(shù)值圖4 候選國家參考品用于EC原液效價(jià)測定的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果

效價(jià)測定的方法驗(yàn)證結(jié)果顯示，候選國家參考品劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線有良好的線性關(guān)系(Y=5.813X+13.05，R2=0.9999；Y為反應(yīng)平均直徑大小，X為劑量對數(shù))，與EC原液劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線趨勢一致(Y=6.782X+12.73，R2=0.9815；Y為反應(yīng)平均直徑大小，X為劑量對數(shù))。且兩者相應(yīng)稀釋度對應(yīng)的反應(yīng)平均直徑大小均值的比值也在1.0±0.2范圍內(nèi)(圖5)。

劑量對數(shù)值為不同稀釋濃度的對數(shù)值圖5 候選國家參考品效價(jià)測定的驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果

劑量對數(shù)值為不同稀釋濃度的對數(shù)值圖6 候選國家參考品效價(jià)測定的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果(穩(wěn)定性研究)

五、初步穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

-20 ℃放置24個(gè)月的候選國家參考品用于EC原液的效價(jià)測定，結(jié)果顯示候選國家參考品劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線仍有良好的線性關(guān)系(Y=3.599X+16.35，R2=0.9694；Y為反應(yīng)平均直徑大小，X為劑量對數(shù))，同時(shí)與EC原液劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線趨勢一致(Y=3.045X+16.26，R2=0.9973；Y為反應(yīng)平均直徑大小，X為劑量對數(shù))。每個(gè)稀釋度EC原液與相應(yīng)稀釋度候選國家參考品反應(yīng)平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內(nèi)(圖6)。

討 論

EC作為結(jié)核感染篩查的體內(nèi)診斷試劑，其效價(jià)測定是該類產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定和有效的重要指標(biāo)。此類產(chǎn)品效價(jià)測定要求是應(yīng)不低于參考品的效價(jià)，因此參考品對產(chǎn)品的質(zhì)量控制至關(guān)重要。為便于產(chǎn)品的質(zhì)量檢查，企業(yè)會建立相應(yīng)的企業(yè)參考品，但隨著不同企業(yè)對此類產(chǎn)品的相續(xù)研發(fā)，將來應(yīng)不斷會有同類產(chǎn)品上市[10-15]。這時(shí)國家參考品的研制變得極為重要，研制成功可對目前和將來此類產(chǎn)品的研發(fā)和上市生產(chǎn)所制備產(chǎn)品中的效價(jià)測定提供可控可評的參考指標(biāo)。尤其是新研發(fā)產(chǎn)品可應(yīng)用國家參考品來測定產(chǎn)品的效價(jià)，評價(jià)產(chǎn)品性能。

制備國家參考品時(shí)，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測指標(biāo)一般會高于企業(yè)參考品。此類產(chǎn)品一般為大腸埃希菌表達(dá)的重組蛋白，因此純度指標(biāo)較為關(guān)鍵。備選EC原液經(jīng)檢測，其電泳法和高效液相色譜法的純度均在95%以上，尤其是電泳法的純度高達(dá)100.00%。企業(yè)參考品一般為液體劑型，考慮到國家參考品長期保存和使用的穩(wěn)定性，本研究在候選國家參考品制備時(shí)加入凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥，制成凍干劑型。凍干制劑的水分含量會是參考品的重要質(zhì)量控制指標(biāo)。經(jīng)測定，候選國家參考品的水分含量為1.57%，遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)要求的不高于3.0%；其蛋白質(zhì)含量檢測結(jié)果為508 μg/瓶。為了滿足國家參考品的均一性要求，該候選品在分裝階段即對每支進(jìn)行精確稱重，保證了分裝精度。最終分裝精度控制在±1%范圍內(nèi)，均一性評價(jià)完全符合國家參考品的要求。

EC原液效價(jià)測定采用的是豚鼠皮膚試驗(yàn)。一般隨著皮膚試驗(yàn)試劑劑量的增加，所對應(yīng)的皮膚試驗(yàn)反應(yīng)平均直徑大小也相應(yīng)增加。但應(yīng)該會有一個(gè)合適的劑量區(qū)間，皮膚試驗(yàn)反應(yīng)是呈正相關(guān)的，低于或者高于一個(gè)劑量范圍，皮膚試驗(yàn)反應(yīng)平均直徑大小會處于一個(gè)平臺期。本研究發(fā)現(xiàn)凍干國家參考品在2.5 μg/ml(12.5 U/ml)以下和10 μg/ml(50 U/ml)以上劑量時(shí)皮膚試驗(yàn)反應(yīng)會呈平臺期反應(yīng)，而在2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)和10 μg/ml(50 U/ml)3個(gè)不同稀釋度時(shí)劑量效應(yīng)反應(yīng)平均直徑大小曲線的線性關(guān)系最好，故認(rèn)為2.5 μg/ml(12.5 U/ml)、5 μg/ml(25 U/ml)和10 μg/ml(50 U/ml)3個(gè)不同稀釋度是候選國家參考品進(jìn)行EC原液效價(jià)測定時(shí)的適宜稀釋度。

該次研究選用的EC原液是企業(yè)申報(bào)臨床時(shí)所用的原液，結(jié)果顯示，不同稀釋度EC原液和相應(yīng)稀釋度候選國家參考品的反應(yīng)平均直徑大小均>8 mm，相應(yīng)稀釋度反應(yīng)平均直徑大小均值的比值在1.0±0.2范圍內(nèi)，且兩者劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線趨勢基本一致。說明候選國家參考品適用于EC原液的效價(jià)測定。同時(shí)，對候選國家參考品用于EC原液的效價(jià)測定進(jìn)行了方法驗(yàn)證，結(jié)果顯示候選國家參考品的劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線有良好的線性關(guān)系(Y=5.813X+13.05，R2=0.9999)，與EC原液的劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線趨勢一致(Y=6.782X+12.73，R2=0.9815)。每個(gè)稀釋度EC原液與相應(yīng)稀釋度候選國家參考品反應(yīng)平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內(nèi)，說明候選國家參考品用于EC原液效價(jià)測定方法可行，檢測結(jié)果可靠。穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示：-20 ℃放置24個(gè)月的候選國家參考品用于EC原液效價(jià)測定時(shí)，其劑量對數(shù)反應(yīng)平均直徑大小曲線與EC原液的曲線趨勢一致，各稀釋度EC原液與相應(yīng)稀釋度候選國家參考品反應(yīng)平均直徑大小均值的比值均在1.0±0.2范圍內(nèi)，說明候選國家參考品性能非常穩(wěn)定。

本研究制備的候選國家參考品目前只完成了初步評價(jià)工作，后續(xù)將進(jìn)一步完成多家協(xié)作標(biāo)定和加速破壞穩(wěn)定性評價(jià)等研究工作。該國家參考品完全研制成功后可用于EC蛋白或者同類產(chǎn)品的質(zhì)量控制，能促進(jìn)此類產(chǎn)品效價(jià)檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。