張?jiān)? 楊卉 何軒輝 吳廣均 李軍

摘要?目的：用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討麻杏石甘湯成分、靶點(diǎn)、通路和生物學(xué)功能，闡明其治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）細(xì)胞因子風(fēng)暴的作用機(jī)制。方法：通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)報(bào)道，搜索麻杏石甘湯每味中藥的成分和靶點(diǎn)，用Cytoscape軟件構(gòu)建和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。用STRING搜素靶點(diǎn)的相關(guān)蛋白，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用MECODE和ClusterOne聚類找出二者共同的關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用Metascape和ClueGO對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行通路和生物學(xué)功能富集分析。結(jié)果：麻杏石甘湯中麻黃有效成分6個(gè)、苦杏仁8個(gè)、石膏3個(gè)、生甘草92個(gè)。聚類分析得到67個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中IL-6和TNF是重要的核心靶點(diǎn)。麻杏石甘湯主要參與的分子通路和生物學(xué)功能與病毒感染和細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的是：人T細(xì)胞白血病病毒1型（TLV-1）感染;單純皰疹病毒感染;TNF-R1信號(hào)通路和相關(guān)信號(hào)復(fù)合物;整合素1途徑;白細(xì)胞介素信號(hào);TH17細(xì)胞分化;炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié);PI3K-Akt信號(hào)通路;白細(xì)胞介素-2介導(dǎo)的信號(hào)通路;免疫應(yīng)答中細(xì)胞因子分泌的負(fù)調(diào)控;內(nèi)皮屏障建立的調(diào)控;T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的調(diào)控。結(jié)論：麻杏石甘湯通過多成分、多靶點(diǎn)對(duì)機(jī)體的病毒感染和免疫炎性反應(yīng)起到多方面的調(diào)控，包括促進(jìn)TH細(xì)胞分化和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)抑制病毒復(fù)制，負(fù)調(diào)控白細(xì)胞介素、TNF、整合素等免疫炎性反應(yīng)遞質(zhì)消除細(xì)胞因子風(fēng)暴。麻杏石甘湯針對(duì)COVID-19的病毒復(fù)制和細(xì)胞因子風(fēng)暴具有顯著的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞?麻杏石甘湯;新型冠狀病毒肺炎;細(xì)胞因子風(fēng)暴;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

Abstract?Objective：To discuss the composition， targets， pathways and biological functions of Maxing Shigan decoction and explore its curative mechanism of on COVID-19 cytokine storm by using network pharmacology. Methods：The components and targets of each Chinese herbal medicine of Maxing Shigan Decoction were searched through TCMSP and TCMID database， and literatures. The component target network was constructed by using the Cytoscape software. The PPI network was constructed by searching the protein related to the target in STRING database. MECODE and ClusterOne clustering software were used to find the common key targets. Metascape and ClueGo software were used to analyze the pathway and biological function enrichment of key targets. Results：In Maxing Shigan decoction， ephedra has 6 effective components， bitter apricot seed 8， gypsum 3 and liquorice root 92. Among the 67 key targets obtained by cluster analysis， IL6 and TNF are important core targets. The main molecular pathways and biological functions of Maxing Shigan decoction related to virus infection and cytokine immunoregulation are：HTLV-1 （human T-cell leukemia virus type 1） infection; herpes simplex virus infection; TNF-R1 signal pathway and related signal complexes; integrin 1 pathway; interleukin signal; Th17 cell differentiation; regulation of inflammatory response; PI3K Akt signaling pathway; interleukin-2-mediated signaling pathway; negative regulation of cytokine secretion in immune response; regulation of endothelial barrier establishment; regulation of T cell homeostatic proliferation. Conclusion：Based on network pharmacology， Maxing Shigan decoction can regulate virus infection and immune inflammatory response in many aspects through multi-component and multi-target， including promoting TH cell differentiation and T cell homeostatic proliferation to inhibit virus proliferation， and negatively regulating immune inflammatory factors such as interleukin， TNF， integrin to eliminate cytokine storm. Maxingshigan decoction has a significant regulatory effects on COVID-19 virus replication and cytokine storm. This study clarified the mechanism of the treatment of new coronary pneumonia with Lianhuang Qingwen， Jinhua Qinggan， Qingfei Paidu decoction and other prescriptions based on Maxing Shigan from one aspect， and provided a scientific basis for clinical rational drug use.

Keywords?Maxingshigan Decoction; COVID-19; Cytokine storm; Network pharmacology

中圖分類號(hào)：R289.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.13.011

新型冠狀病毒（COVID-19）已經(jīng)造成世界大流行，給人類生命健康帶來巨大挑戰(zhàn)。李蘭娟等提出了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”又稱“炎癥風(fēng)暴”概念。指出細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是COVID-19感染者由輕癥進(jìn)展成重癥的主要病理機(jī)制之一[1]。細(xì)胞因子風(fēng)暴是機(jī)體免疫反應(yīng)過度造成的多器官損傷，如急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克、代謝性酸中毒和出凝血功能障礙及多器官衰竭狀態(tài)。目前西藥治療細(xì)胞因子風(fēng)暴有激素和IL-6受體阻斷劑托珠單抗，均取得了一定的臨床療效[2]。但同時(shí)也存在著很多不確定的不良反應(yīng)。在本次新冠肺炎的救治過程中，中醫(yī)藥發(fā)揮了積極作用，尤其是能阻斷輕癥患者向重癥轉(zhuǎn)化。麻杏石甘湯是中醫(yī)治療肺炎的經(jīng)典名方，具有辛涼宣泄，清肺平喘之功。我國第七版新冠肺炎防治指南重點(diǎn)提到的金花清感顆粒、連花清瘟膠囊、清肺排毒湯、化濕敗毒方都是在麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上化裁而成。對(duì)重慶市萬州區(qū)集中收治的225例新型冠狀病毒肺炎患者的用藥情況分析，發(fā)現(xiàn)中藥干預(yù)參與率達(dá)87%（195例），主要選方是麻杏石甘湯（20.29%）[3]。我們推測(cè)麻杏石甘湯是通過抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴阻斷新冠肺炎患者由輕癥向重癥轉(zhuǎn)化。我們將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)加以分析和闡釋。

1?資料與方法

1.1?資料來源?利用TCMSP數(shù)據(jù)庫[4]檢索并篩選麻黃、苦杏仁、生石膏、生甘草的有效成分，篩選條件為：藥物口服生物利用度（OB）值≥30%、藥物相似度（DL）值≥0.18。生石膏數(shù)據(jù)庫均無成分和靶點(diǎn)記錄，通過查找文獻(xiàn)[5]獲得有效成分和靶點(diǎn)。

1.2?方法

1.2.1?有效成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)?通過Drugbank、Pubchem查找成分的證實(shí)作用靶點(diǎn)，通過SEA、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)。利用Cytoscape構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2?利用UniProt數(shù)據(jù)庫對(duì)麻杏石甘湯的作用靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理?利用String數(shù)據(jù)庫將麻杏石甘湯的所有作用靶點(diǎn)的相關(guān)蛋白進(jìn)行檢索，選取score>0.95的相關(guān)蛋白生成PPI網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用Cytoscape軟件的插件MECODE（選取SCORE>5的聚類）和ClusterOne（選取P<0.01的聚類）對(duì)麻杏石甘湯的作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行聚類分析。將MECODE和ClusterOne選取的基因和蛋白進(jìn)行取交集，作為核心基因和蛋白進(jìn)行通路和功能分析。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用Cytoscape軟件的插件ClueGO和Metascape對(duì)聚類分析得到的核心基因和蛋白進(jìn)行通路和生物學(xué)功能分析，要求P<0.01。

2?結(jié)果

2.1?麻杏石甘湯各組成中藥的有效成分?經(jīng)過ADME篩選，得到麻黃有效成分6個(gè)、苦杏仁有效成分8個(gè)、石膏有效成分通過文獻(xiàn)查找獲得3個(gè)、生甘草有效成分92個(gè)。見表1。

2.2?麻杏石甘湯各中藥有效成分的作用靶點(diǎn)?通過有效成分查找作用靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)麻黃作用靶點(diǎn)142個(gè)、苦杏仁作用靶點(diǎn)65個(gè)、石膏作用靶點(diǎn)2個(gè)、生甘草作用靶點(diǎn)388個(gè)。刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，麻黃和苦杏仁有28個(gè)共同作用靶點(diǎn)，麻黃和生甘草有97個(gè)共同作用靶點(diǎn)，苦杏仁和生甘草有37個(gè)共同作用靶點(diǎn)，說明麻杏草（三拗湯）三藥具有顯著的協(xié)同作用。見圖1A。石膏的研究很少，靶點(diǎn)相對(duì)獨(dú)立。麻杏石甘湯各中藥有效成分及作用靶點(diǎn)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。見圖1B。

2.3?麻杏石甘湯各中藥有效成分作用的67個(gè)核心靶點(diǎn)?麻杏石甘湯各中藥有效成分作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見771 NODES，349 004 shortest PATHs。見圖2A。MECODE聚類分析得到85個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，ClusterONE聚類分析得到486個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，二者交集共有67個(gè)核心靶點(diǎn)。見圖2B以及67個(gè)核心靶點(diǎn)的內(nèi)部相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。見圖2C。從圖中可以看出IL6和TNF是重要的核心靶點(diǎn)。

2.4?麻杏石甘湯參與的主要通路和生物學(xué)功能分析結(jié)果?MetaScape分析結(jié)果表明，麻杏石甘湯主要參與和介導(dǎo)的分子通路是：胰島素樣生長因子轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取的調(diào)節(jié);人T細(xì)胞白血病病毒1型感染;TNF-R1相關(guān)信號(hào)復(fù)合物;整合素1途徑;細(xì)胞周期;白細(xì)胞介素信號(hào);單純皰疹病毒感染;TH17細(xì)胞分化;細(xì)胞周期檢查點(diǎn);炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié);PI3K-Akt信號(hào)通路;TNR-R1信號(hào)通路;配體刺激CBP-RARA-RARX-DNA通路;白細(xì)胞介素-2介導(dǎo)的信號(hào)通路;水解酶活性的負(fù)調(diào)控。見圖3。ClueGo分析發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯主要參與的生物學(xué)功能是：免疫應(yīng)答中細(xì)胞因子分泌的負(fù)調(diào)控;端粒酶催化核心復(fù)合物組裝的正調(diào)控;內(nèi)皮屏障建立的調(diào)控;內(nèi)胚層細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控;足體組裝的正調(diào)控;T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的調(diào)控。見圖4。

3?討論

細(xì)胞因子風(fēng)暴在新型冠狀病毒疾病發(fā)展過程中常導(dǎo)致急性呼吸窘迫、多器官功能衰竭等加重病情。細(xì)胞因子風(fēng)暴是指多種炎性反應(yīng)遞質(zhì)如白細(xì)胞介素家族、腫瘤壞死因子、選擇素、黏附素等的過高表達(dá)。尤其是IL-6、TNF-α的迅速大量產(chǎn)生打破了免疫平衡[5]。目前西醫(yī)除了采用糖皮質(zhì)激素和托珠單抗以外，恢復(fù)期血漿[6]、間充質(zhì)干細(xì)胞[7]、血液凈化、體外膜肺氧合等技術(shù)在一定程度上減輕了細(xì)胞因子風(fēng)暴，但難以普及。新冠肺炎屬中醫(yī)的“疫病”，基本病機(jī)為疫毒外侵，早期表現(xiàn)為寒、濕、毒侵肺，中晚期可能涉及濕、熱、毒、瘀、虛。病情發(fā)展至細(xì)胞因子風(fēng)暴階段常出現(xiàn)熱毒閉肺、毒瘀互結(jié)[8]和濕熱化毒、郁遏氣機(jī)[9]。麻杏石甘湯是辛涼宣肺、清肺平喘的經(jīng)典名方，恰中病機(jī)。我們利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯對(duì)新冠病毒及其細(xì)胞因子風(fēng)暴具有多靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)作用。

我們發(fā)現(xiàn)麻杏石甘湯重點(diǎn)調(diào)節(jié)的67個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中IL-6和TNF是重要的核心靶點(diǎn)。麻杏石甘湯主要參與的分子通路和生物學(xué)功能主要與病毒感染和細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)相關(guān)。如人T細(xì)胞白血病病毒1型感染;單純皰疹病毒感染;TNF-R1信號(hào)通路和相關(guān)信號(hào)復(fù)合物;整合素1途徑;白細(xì)胞介素信號(hào);TH17細(xì)胞分化;炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié);PI3K-Akt信號(hào)通路;白細(xì)胞介素-2介導(dǎo)的信號(hào)通路;免疫應(yīng)答中細(xì)胞因子分泌的負(fù)調(diào)控;內(nèi)皮屏障建立的調(diào)控;T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖的調(diào)控。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度看，麻杏石甘湯通過促進(jìn)Th細(xì)胞分化和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)抑制病毒復(fù)制，通過對(duì)白細(xì)胞介素、TNF、整合素等免疫炎性反應(yīng)遞質(zhì)的負(fù)調(diào)控消除細(xì)胞因子風(fēng)暴。病毒感染和細(xì)胞因子風(fēng)暴常常并存[10]。麻杏石甘湯對(duì)多種病毒感染和細(xì)胞因子風(fēng)暴具有抑制作用。我國全面推廣的治療新冠肺炎的三藥三方中有4種（清肺排毒方、化濕敗毒方、金花清感顆粒、連花清瘟膠囊）都是在麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上化裁而成。最新研究表明連花清瘟可以在體外抑制新型冠狀病毒活性并顯著改善新冠肺炎患者臨床癥狀[11]。因此，我們認(rèn)為麻杏石甘湯針對(duì)COVID-19的病毒復(fù)制和細(xì)胞因子風(fēng)暴具有顯著調(diào)節(jié)作用。同時(shí)我們也主張針對(duì)不同地域、體質(zhì)、年齡的患者要根據(jù)辨證論治的原則可以在麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行加減化裁治療，以取得個(gè)體化最優(yōu)診療方案。

本研究還存在不足之處。麻杏石甘湯中麻黃和石膏配伍能辛涼宣肺，麻黃、石膏和杏仁配伍能清肺平喘。麻杏石甘湯中石膏的作用不容忽視，但由于目前針對(duì)石膏的有效成分和作用靶點(diǎn)的研究都非常少。隨著對(duì)石膏研究的深入，麻杏石甘湯治療病毒性肺炎的更多機(jī)制將得到闡釋。

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（2020-04-20收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）