Bcl-2轉(zhuǎn)錄抑制因子1在肝癌組織中的表達(dá)及意義

劉佳玲，黃林生，張朔，祁莎莎，鮑陽，李飛

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院 藥理學(xué)系，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市太和醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 十堰 442000；3.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000）

原發(fā)性肝癌是指肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤，包括肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型（HCC-ICC） 3種不同病理類型，其中HCC占85%～90%以上[1]?！杜R床腫瘤雜志》[1]最新全球癌癥數(shù)據(jù)顯示：肝癌發(fā)病率位居世界第6位，病死率位居第4位，其5年生存率位居第4位，大約在5%～30%左右[2]。流行病學(xué)研究指出，慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、大量飲酒、食用被黃曲霉污染的食物、肥胖、吸煙和2型糖尿病是導(dǎo)致HCC的主要危險(xiǎn)因素[3]。HCC早期治療方法包括手術(shù)切除、射頻消融或肝移植，經(jīng)導(dǎo)管化療栓塞是中晚期的治療方法[4-7]。盡管化療介入、分子靶向治療等為肝癌治療帶來顯著改善，但由于大部分患者就診時(shí)已是晚期且肝內(nèi)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率高發(fā)，導(dǎo)致患者預(yù)后情況不容樂觀[8-9]。因此，進(jìn)一步探究HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)分子機(jī)制，以尋求新的HCC腫瘤標(biāo)志物，早診早治改善患者預(yù)后[10]。

Bcl-2 轉(zhuǎn)錄抑制因子1（Bcl-2 inhibitor of transcription 1，Bit1）是2004年發(fā)現(xiàn)的一種與失巢凋亡相關(guān)的新蛋白[11]。Bit1基因PTRH2，位于17q23.2，mRNA長約1 kb，編碼179個(gè)氨基酸，Bit1蛋白定位于線粒體外膜[12]，分子量約為27 kD。Bit1是一種失巢凋亡效應(yīng)分子，其可能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。近年，只在部分腫瘤中對(duì)Bit1進(jìn)行了相關(guān)研究，且表達(dá)情況呈腫瘤特異性，目前尚無學(xué)者研究Bit1與HCC的關(guān)系。本課題采用qRT-PCR、Western blot、IHC法檢測HCC患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織Bit1 mRNA及蛋白水平，首次探究Bit1在HCC組織中的表達(dá)情況及臨床意義，為Bit1可望成為HCC患者診斷預(yù)后標(biāo)志物或個(gè)體化治療作用靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2016年6月—2018年6月十堰市太和醫(yī)院34例HCC患者術(shù)后腫瘤組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織（距病灶邊緣5 cm）?；颊呤中g(shù)前均未接受放化療治療，年齡36～73歲。本研究通過湖北醫(yī)藥學(xué)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。該樣品用于Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，初步探究Bit1在HCC組織中的表達(dá)水平。

180點(diǎn)HCC組織芯片（購自上海芯超生物科技有限公司，芯片號(hào)：HLivH180Su07）收錄了2006年 2月—2007年5月期間接受正規(guī)手術(shù)治療的90例患者資料，術(shù)后隨訪至2012年2月，隨訪5～6年。所有患者術(shù)前均未接受過任何治療，具有完整的隨訪資料。該樣品用于免疫組化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究Bit1表達(dá)與HCC患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后生存情況的關(guān)系。

1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit、iTaq Universal SYBR Green Supermix購自Bio-rad；TRIzol購自Invitrogen；RIPA Buffer（CST，#9806）；Cocktail （CST，#5871）；BCA試劑盒（Thermo Scientific，PL212739）；Anti-PTRH2 antibody（Abcam，ab36990）；β-actin（13E5）Rabbit mAb（CST，#4970）；細(xì)胞色素C氧化酶IV（COX IV）antibody（CST，#4850S）；Goat anti-Rabbit IgG H&L（HRP）（Abcam，ab97051）；免疫組化試劑盒EnVision? FLEX+，Mouse，High pH，（Link）購自Dako；蘇木素（Sigma aldrich，SLBT4555）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測Bit1 mRNA表達(dá)水平引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，PTRH2上游：5'-TGA CTT AAA GAT GGG AAA AGG G-3'，下游：5'-CCA ATA ATG CAA TCA GGG TT-3'；GAPDH上 游：5'-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3'，下游：5'-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3'?？俁NA的提?。喝?0 mg組織，加入 1 mL TRIzol試劑，冰上剪碎勻漿，按常規(guī)TRIzol法提取總RNA。NanoDrop2000c分光光度計(jì)（Thermo Scientific）測定A260/A280的比值及總RNA濃度。qRT-PCR：使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit合 成cDNA。以cDNA樣品為模板、GAPDH為內(nèi)參基因，按照iTaq universal SYBR Green Supermix說明書配置10 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 3 min；再進(jìn)行95 ℃、3 s變性，PTRH2 52.5 ℃、1 min退火延伸，GAPDH 59.2 ℃、1 min退火延伸，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，熒光定量PCR儀進(jìn)行qRTPCR，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用Bio-Rad CFX manager軟件分析，按照2-ΔΔCt法計(jì)算PTRH2的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 Western blot檢測Bit1蛋白表達(dá)水平總蛋白提取：取30 mg組織，加入300 μL1×RIPA裂解液（含cocktail）。冰上剪碎、勻漿超聲后，裂解30 min。12 000 r/min，4 ℃離心20 min，獲取組織總蛋白。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，ddH2O將樣品稀釋至同一濃度，加入2×loading buffer混勻，沸水煮10 min后，冰浴5 min，于 -80 ℃儲(chǔ)存。SDS-PAGE：每孔加入約30 μg蛋白樣品，進(jìn)行10%/12.5%SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印到0.22或0.45 μm PVDF上，冰浴中300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min，將PVDF膜移至5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，轉(zhuǎn)移至相應(yīng)一抗（β-actin 1:2 000，Bit1 1:500，COX IV 1:10 000）孵育2 h，Goat Anti-Rabbit IgG H&L二抗（1:10 000）室溫孵育1.5 h后，ImageQuant LAS4000凝膠成像儀拍照并進(jìn)行光密度值分析。

1.3.3 免疫組化檢測Bit1蛋白表達(dá)水平將組織芯片放入烘箱，63 ℃，烘蠟1 h。二甲苯脫蠟、梯度酒精水化和ddH2O洗滌后，置于檸檬酸修復(fù)液，加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，使用商品化的即用阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗滌 3次，山羊血清封閉后，滴加Bit1一抗（1:200），4 ℃孵育過夜。第二天PBS洗滌3次后，加反應(yīng)增強(qiáng)劑，37 ℃孵育30 min，滴加二抗，室溫孵育30 min。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、0.25%的鹽酸酒精中浸沒后，用自來水洗滌，室溫晾干后封片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)染色陽性率評(píng)分，0分（陰性）、1分（1%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分，0分（陰性）、1分（1+）、2分（2+）、3分（3+），以“染色陽性率評(píng)分”和“染色強(qiáng)度評(píng)分”的乘積為總評(píng)分進(jìn)行分組，0～5分為低表達(dá)，6～12分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有資料采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織蛋白灰度掃描值與mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，分析Bit1的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線分析Bit1不同表達(dá)的HCC患者術(shù)后5年生存率。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 34例HCC組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中Bit1 mRNA表達(dá)水平

PTRH2、GAPDH溶解曲線均為特異性單峰，表明引物特異性較好（圖1A-B）。qRT-PCR結(jié)果顯示：Bit1 mRNA在HCC組織中的相對(duì)表達(dá)水平為2.24±0.28，對(duì)應(yīng)癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)水平為1.00±0.09，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）（圖1C）。

圖1 qRT-PCR法檢測Bit1 mRNA表達(dá)Figure 1 Expressions of Bit1 mRNA detected by qRT-PCR

2.2 34例HCC患者癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中Bit1蛋白表達(dá)水平

COX IV是線粒體內(nèi)膜上的跨膜蛋白復(fù)合體，在線粒體蛋白的檢測中，COX IV可用作線粒體蛋白上樣內(nèi)參。Western blot結(jié)果顯示，HCC組織中Bit1蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（圖2A）：8例樣品為代表圖。其灰度掃描值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：以β-actin為內(nèi)參，Bit1在HCC組織中的灰度值為3.46±0.40，癌旁組織為1.00±0.20（圖2B）；以COX Ⅳ為內(nèi)參，Bit1在HCC組織中的灰度值為3.75±0.45，癌旁組織為1.00±0.22（圖2C），其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

2.3 免疫組化檢測組織芯片中Bit1蛋白表達(dá)水平

2.3.1 Bit1在HCC及癌旁組織中的表達(dá)Bit1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，鏡下陽性細(xì)胞呈棕黃色，與癌旁組織比較，Bit1在癌組織中的染色陽性率、染色強(qiáng)度明顯高于癌旁組織（圖3）；且在90例HCC組織中，74例（82.2%）Bit1蛋白高表達(dá)，在 90例癌旁組織中50例（55.6%）Bit1蛋白高表達(dá)，Bit1蛋白在HCC組織中的高表達(dá)率明顯高于癌旁組織（P＜0.001）（表1）。

圖2 Western blot檢測Bit1蛋白表達(dá)Figure 2 Expressions of Bit1 protein detected by Western blot

圖3 免疫組化法檢測組織芯片中Bit1蛋白表達(dá)（左：×20，右：×200）Figure 3 Expressions of Bit1 protein in tissue chip detected by immunohistochemical staining (left:×20,right:×200)

表1 在HCC組織及癌旁組織中Bit1蛋白表達(dá)率比較[n（%）]Table 1 Comparison of expression rates of Bit1 protein in HCC tissues and adjacent tissues [n (%)]

2.3.2 Bit1在HCC組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)果顯示Bit1蛋白表達(dá)與腫瘤復(fù)發(fā)，病理分級(jí)均有關(guān)（均P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤大小、數(shù)量、是否患乙肝、是否肝硬化、肝硬化結(jié)節(jié)大小、AFP水平、腫瘤是否有包膜、TNM分期均無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表2）。

2.3.3 Bit1蛋白表達(dá)水平與HCC患者生存期的關(guān)系經(jīng)Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)顯示，Bit1蛋白高表達(dá)患者總生存率和無病生存率縮短，可能由于樣本例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.547、0.414）（圖4）。

表2 Bit1在HCC組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table 2 Association of Bit1 levels with clinical parameters of HCC patients [n (%)]

圖4 Kaplan-Meier分析Bit1表達(dá)水平對(duì)HCC患者術(shù)后總生存的影響Figure 4 Influence of Bit1 expression level on postoperative survival of the HCC patients analyzed by Kaplan-Meier method

3 討 論

目前為止，與HCC相關(guān)的主要基因有p53、細(xì)胞色素P450 1A1（CYP1A1）、醌氧化還原酶（NQO1）、環(huán)氧化物水解酶（EPHX1）、乙醛脫氫酶2（ALDH2）基因等，這些基因的異常表達(dá)導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控紊亂進(jìn)而影響HCC的發(fā)生與發(fā)展[13-19]。常見的HCC標(biāo)志物有甲胎蛋白（AFP）、α-L巖藻糖苷酶（AFU）、去飽和-γ-羧基-凝血酶原（DCP）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）[20-24]等，其中AFP是目前推薦在臨床上常規(guī)使用篩查HCC高危人群的標(biāo)志物，但多數(shù)腫瘤標(biāo)志物在疾病早期處于正常值，而到中晚期才出現(xiàn)異常升高，因此探究HCC早期腫瘤標(biāo)志物對(duì)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療及改善患者預(yù)后至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)Bit1是一種失巢凋亡效應(yīng)分子，在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞通過抵抗失巢凋亡得以生存，因而，Bit1可能參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展，有望成為腫瘤患者的診斷、預(yù)后標(biāo)志物或個(gè)體化治療靶點(diǎn)。目前，已有的研究結(jié)果顯示Bit1表達(dá)情況呈腫瘤特異性，與癌旁組織比較，Bit1在食管癌、口腔癌、卵巢癌、胃癌等組織中高表達(dá)[25-28]，而在肺癌、胰腺癌、乳腺癌等組織中低表達(dá)[29-31]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細(xì)胞癌組織（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM III和IV期ESCC組織中Bit1 mRNA及蛋白水平顯著高于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM I和II期ESCC組織Bit1表達(dá)水平，且低分化癌組織中的Bit1 mRNA水平明顯高于高分化和中分化癌組織，因此研究[27,32]認(rèn)為Bit1在ESCC中可能作為一種癌基因，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，加速癌癥進(jìn)展。然而，Bit1在胰腺癌組織中低表達(dá)，且表達(dá)水平與患者血清CEA水平及神經(jīng)浸潤程度相關(guān)，Bit1可能作為一種抑癌基因阻礙胰腺癌進(jìn)一步惡化[33]。Bit1可通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等能力從而在不同腫瘤中發(fā)揮促癌和抑癌兩種截然相反的作用。Bit1可能通過激活FAK-PI3K-Akt-NF-κB或FAK-paxillin等通路發(fā)揮促癌作用[34]，或負(fù)性調(diào)節(jié)Erk通路及抑制EMT發(fā)生發(fā)揮抑癌作用[35]。

至今尚未見Bit1與HCC之間關(guān)系的研究。本研究通過qRT-PCR、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測34例HCC患者手切切除的癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的Bit1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，免疫組化法檢測組織芯片中90例對(duì)應(yīng)匹配的癌組織及癌旁組織中Bit1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果均顯示：與癌旁組織比較，Bit1在HCC組織中的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示Bit1可能在HCC中作為一種癌基因影響腫瘤發(fā)生發(fā)展，根據(jù)患者相關(guān)的臨床病理信息及術(shù)后隨訪資料，統(tǒng)計(jì)分析顯示：Bit1表達(dá)與HCC患者的腫瘤復(fù)發(fā)及病理分級(jí)密切相關(guān)，且Bit1蛋白高表達(dá)患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間均低于低表達(dá)患者，這一結(jié)果提示Bit1高表達(dá)預(yù)示患者術(shù)后預(yù)后不良，故其可能對(duì)HCC患者的診斷、治療、預(yù)后產(chǎn)生重要影響，以上結(jié)果為更進(jìn)一步研究Bit1在HCC中的生物學(xué)功能及具體作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。目前，本課題組其他成員通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默HCC細(xì)胞株內(nèi)源性Bit1表達(dá)水平，利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測其對(duì)癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示：沉默Bit1可明顯抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，而促進(jìn)HCC細(xì)胞凋亡，印證了本文Bit1在HCC中作為一種癌基因影響腫瘤發(fā)展這一觀點(diǎn)。

綜上所述，本課題組首次發(fā)現(xiàn)Bit1在HCC組織中高表達(dá)，其可能作為一種癌基因，成為HCC患者診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物或個(gè)體化治療靶點(diǎn)，但其具體作用機(jī)制、應(yīng)用價(jià)值還有待于進(jìn)一步研究。