束青華，張楠楠，韓建波，易永祥，張郁峰

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院/南京市第二醫(yī)院 肝膽胰外科，江蘇 南京 210003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院 消化內(nèi)科，江蘇 南京 210024）

原發(fā)性肝癌是目前處于我國常見惡性腫瘤第4位，且是第2位腫瘤相關(guān)致死病因，嚴(yán)重威脅著我國人民的生命和健康[1-2]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，中國約占50%的病例和死亡人數(shù)[2]。目前，肝切除是HCC的主要治療手段之一[3]。不幸的是，肝切除術(shù)后HCC復(fù)發(fā)仍然是治療失敗和癌癥相關(guān)死亡的主要原因。HCC的復(fù)發(fā)可能源于原發(fā)腫瘤的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，也可能源于殘肝的新生腫瘤，分別導(dǎo)致早期和晚期（以24個月為截止時(shí)間）的復(fù)發(fā)[4]。肝切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)的HCC（約占HCC復(fù)發(fā)的70%）較晚期復(fù)發(fā)更具侵襲性，預(yù)后差，是威脅HCC患者生命的主要原因[5]。HCC是一種炎癥驅(qū)動型癌癥，炎癥已被證實(shí)與分化不良、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）和微轉(zhuǎn)移相關(guān)[6-7]。此外，據(jù)報(bào)道[5,8-9]，侵襲性病理特征與HCC有關(guān)。因此，炎癥可能在預(yù)測HCC中發(fā)揮重要作用。

炎癥被認(rèn)為是癌癥的一個標(biāo)志[10]，越來越多的證據(jù)表明，宿主炎癥反應(yīng)與癌癥進(jìn)展和患者生存有關(guān)[11]。伴有重型肝炎和活動性炎癥的HCC患者，肝切除術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)率和肝外轉(zhuǎn)移率較高[12-13]。此外，除了腫瘤特征和肝功能等臨床參數(shù)外，炎癥相關(guān)標(biāo)志物是肝切除術(shù)后預(yù)后的重要預(yù)測因素[13]。最近，有許多基于炎癥的預(yù)后評分是建立在全身炎癥反應(yīng)上的，例如中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR），血小板與淋巴細(xì)胞比（platelet to lymphocyte ratio，PLR），淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比（lymphocyte to monocyte ratio，LMR），這些指標(biāo)顯示了對幾種癌癥的預(yù)后價(jià)值。包括肺癌、腎細(xì)胞癌、生殖細(xì)胞瘤、膀胱癌，胃腸道腫瘤和HCC[14-23]。盡管在各種惡性腫瘤中存在淋巴細(xì)胞浸潤與預(yù)期壽命的顯著增加有關(guān)，但來自循環(huán)單核細(xì)胞的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）與預(yù)后不良有關(guān)[24-27]。這提示LMR可能與癌癥的預(yù)后有關(guān)。值得注意的是，LMR在切除的原發(fā)性結(jié)直腸腺癌中的預(yù)后價(jià)值最近已在一項(xiàng)大型回顧性研究中得到證實(shí)[28]。

本研究旨在其一探討術(shù)前LMR作為HCC患者行肝切除術(shù)的預(yù)后價(jià)值，以及其對無病生存率（disease-free survival，DFS）和總生存率（overall survival，OS）的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集了2012年1月—2016年12月在南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第二醫(yī)院）行根治性肝切除術(shù)的88例HCC患者的資料。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：⑴ 經(jīng)病理證實(shí)的HCC診斷；⑵ 術(shù)前未行放射與化學(xué)治療；⑶ 美國東部腫瘤協(xié)作組評分≤2；⑷ 腫瘤切除邊緣陰性；⑸ 無其他惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：⑴ 肝外轉(zhuǎn)移，原發(fā)性肝癌伴有肝靜脈或下腔靜脈或門靜脈或動脈或膽道系統(tǒng)侵犯；⑵ 肝切除術(shù)后失訪。對每位患者的電子病例記錄進(jìn)行查詢，例如標(biāo)準(zhǔn)的基線統(tǒng)計(jì)資料、原發(fā)結(jié)腫瘤特征、復(fù)發(fā)日期、死亡時(shí)間和最后一次隨訪等。

1.2 檢驗(yàn)方法

炎癥指標(biāo)均在術(shù)前1個月內(nèi)獲得，同時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)在正常范圍內(nèi)（脾功能亢進(jìn)除外）。考慮到急性感染或炎癥過程改變的可能性而非慢性癌癥相關(guān)的結(jié)果，白細(xì)胞減少和白細(xì)胞增多患者的炎癥指標(biāo)被排除在分析之外，但是脾功能亢進(jìn)引起的白細(xì)胞減少在排除上述可能后納入標(biāo)本中。在HCC的診斷檢查中，使用每位患者2 mL靜脈血進(jìn)行全血計(jì)數(shù)。在乙二胺四乙酸抗凝真空管中采集血液，提取后立即與抗凝劑混合，以防止血栓的形成。采用血液分析儀（XN-9000，Sysmex?，Kobe，Japan）進(jìn)行電子細(xì)胞計(jì)數(shù)法。本研究通過中性粒細(xì)胞對淋巴細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)計(jì)算NLR，血小板對淋巴細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)計(jì)算PLR，淋巴細(xì)胞對單核細(xì)胞的絕對計(jì)數(shù)計(jì)算LMR。本研究符合赫爾辛基宣言的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京醫(yī)院倫理委員會研究批準(zhǔn)，并獲得所有患者的知情同意。

1.3 隨訪

術(shù)后隨訪時(shí)間從術(shù)后1個月開始執(zhí)行，術(shù)后2年內(nèi)每3～4個月1次。術(shù)后2年以上每6個月1次，直至死亡或失訪。隨訪包括體格檢查、血清甲胎蛋白（AFP）和至少1次腹部圖像掃描，包括腹部超聲、腹部CT或MRI。同時(shí)每年進(jìn)行1次胸部CT平掃。如經(jīng)腹部超聲檢查懷疑復(fù)發(fā)，則行腹部增強(qiáng)CT或增強(qiáng)MRI或腹部超聲造影檢查以確診，胸部增強(qiáng)CT掃描排除肺轉(zhuǎn)移。骨掃描或正電子發(fā)射CT檢查排除其他部位可以轉(zhuǎn)移病灶。腫瘤復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：⑴ 肝活檢；⑵ CT/MRI的典型表現(xiàn)（動脈期強(qiáng)化，門脈期/靜脈期減弱）[29]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0（SPSS，Chicago，IL，USA）和Prism 5（GraphPad Software La Jolla，CA，USA）。DFS的計(jì)算從肝切除之日起至疾病復(fù)發(fā)之日止，并在與癌癥死亡無關(guān)時(shí)或在患者最后一次隨訪時(shí)（如果患者在此期間仍無腫瘤）進(jìn)行截尾。OS的計(jì)算從肝切除術(shù)之日起至因任何原因死亡之日止，并在最后一次隨訪時(shí)對仍在世的患者進(jìn)行刪失。通過應(yīng)用受試者工作曲線分析（ROC），確定LMR、PLR、NLR的最佳截?cái)嗨健＆?檢驗(yàn)用于計(jì)算臨床病理分類特征與LMR之間的關(guān)系。Kaplan-Meier方法分析LMR對DFS和OS的影響。各組生存結(jié)果采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用前向逐步法Cox回歸模型，將單變量分析中的重要變量納入多變量分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LMR、PLR和NLR的ROC曲線分析結(jié)果

根據(jù)LMR、PLR和NLR與OS的關(guān)系繪制ROC曲線以確定最佳診斷界值，本研究中，當(dāng)LMR為2.87時(shí)，曲線下面積（AUC）為0.757，敏感度為76.5%，特異度為75.7%。當(dāng)PLR為133.61時(shí)，AUC為0.583，敏感度為29.7%，特異度為86.3%。當(dāng)NLR為2.60時(shí)，AUC為0.687敏感度為64.9%，特異度為72.5%（圖1）（表1），同時(shí)通過Spearson相關(guān)分析顯示，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與單核細(xì)胞計(jì)數(shù)存在一定的相關(guān)性（rs=0.652，P＜0.001）（圖2）。

圖1 LMR、PLR、NLR的預(yù)測HCC患者生存的ROC曲線Figure 1 ROC curves of LMR,PLR and NLR for predicting the survival of HCC patients

圖2 淋巴細(xì)胞絕對值與單核細(xì)胞絕對值相關(guān)分析結(jié)果Figure 2 Correlation analysis between the absolute values of lymphocytes and monocytes

表1 LMR、PLR、NLR的ROC曲線分析結(jié)果Table 1 Results of analysis of ROC curves of LMR,PLR and NLR

2.2 LMR與患者臨床病理特征資料的相關(guān)分析

根據(jù)上述ROC分析結(jié)果，將患者分成兩組，LMR＞2.87為高LMR組和LMR≤2.87為低LMR組。結(jié)果顯示，LMR分組與巴塞羅那臨床肝癌分期（barcelona clinic liver cancer，BCLC）和中國肝癌分期（china liver cancer staging，CNLC）及其他臨床病理因素均無明顯關(guān)系（均P＞0.05），僅發(fā)現(xiàn)LMR與患者腫瘤數(shù)目有關(guān)（P=0.048） （表2）。

表2 LMR與HCC患者臨床病理特征關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of LMR with the clinicopathologic features of HCC patients [n (%)]

2.3 LMR與患者預(yù)后的相關(guān)生存分析

為了進(jìn)一步分析LMR與HCC患者預(yù)后的關(guān)系，根據(jù)LMR截?cái)嘀祵?8例患者分成高LMR組和低LMR組。然后，繪制Kaplan-Meier生存曲線，使用log-rank檢驗(yàn)比較生存率，進(jìn)一步研究OS和DFS的關(guān)系。結(jié)果顯示，高LMR組患者的DFS（P=0.001）與OS（P=0.000）均明顯優(yōu)于低LMR組 （圖3）。結(jié)合腫瘤BCLC分期與CNLC分期，將早期腫瘤包括CNLC I/II期和BCLC A/B期，晚期腫瘤包括CNLC III/IV期和BCLC期C/D[31]分別比較。結(jié)果顯示，無論是BCLC A/B期患者還是BCLC C/D期患者中，高LMR組患者的DFS與OS均明顯優(yōu)于低LMR組（均P＜0.05）。在CNLC I/II期患者中，高LMR組與低LMR組的DFS無明顯差異（P=0.132），但高LMR組的OS優(yōu)于低LMR組（P=0.005）；在CNLC III/IV期患者中，高LMR組患者的DFS（P=0.001）與OS（P=0.000）均明顯優(yōu)于低LMR組（均P＜0.05）（圖4-5）。

圖3 高LMR組與低LMR組HCC患者的生存曲線Figure 3 Survival curves of HCC patients in high LMR group and low LMR group

圖4 BCLC分期分層后高LMR組與低LMR組HCC患者的生存曲線Figure 4 Survival curves of HCC patients in high LMR group and low LMR group after BCLC stage stratification

圖5 CNLC分期分層后高LMR組與低LMR組HCC患者的生存曲線Figure 5 Survival curves of HCC patients in high LMR group and low LMR group after CNLC stage stratification

2.4 HCC患者生存的影響因素分析

2.4.1 DFS的影響因素分析單因素分析提示腫瘤大小（P=0.028）、血管侵犯（P=0.039）、CNLC分期（P=0.018）、BCLC分期（P=0.011）及LMR（P=0.002）有預(yù)后價(jià)值；通過采用前向逐步法Cox回歸模型，將單因素分析中的重要變量納入多因素分析提示LMR（P=0.001）為HCC患者DFS的獨(dú)立影響因素（表3）。

2.4.2 OS的影響因素分析單因素分析提示腫瘤大?。≒=0.011）、CNLC分期（P=0.043）、BCLC分期（P=0.021）及LMR（P=0.000）有預(yù)后價(jià)值。通過采用前向逐步法Cox回歸模型，將單因素分析中的重要變量納入多因素分析提示只有BCLC分期（P=0.000）和LMR（P=0.000）為HCC患者OS的獨(dú)立影響因素（表4）。為進(jìn)一步了解LMR在HCC患者中的預(yù)后價(jià)值，將LMR、PLR以及NLR三者作為連續(xù)變量（試圖校正因?yàn)榻財(cái)嘀祵ψ兞康挠绊懺斐山Y(jié)果的偏差）進(jìn)行Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析[32]，僅LMR具有預(yù)后價(jià)值（HR=0.571，95% CI=0.416～0.786，P=0.001）（表5）。

表3 HCC患者DFS的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Table 3 Univariate and multivariate Cox proportional hazards regression analysis of factors for DFS of HCC patients

表4 HCC患者OS的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Table 4 Univariate and multivariate Cox proportional hazards regression analysis of factors for OS of HCC patients

表5 HCC患者OS的LMR、PLR、NLR單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析比較Table 5 Univariate and multivariate Cox proportional hazards regression analysis of LMR,PLR and NLR for OS of HCC patients

3 討 論

本研究結(jié)果表明，術(shù)前LMR是HCC根治性切除患者OS和DFS不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。此外，在CNLC分期或BCLC分期患者的亞組中發(fā)現(xiàn)，LMR也與OS和DFS顯著相關(guān)。且近期有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)LMR、PLR、NLR與TNM分期及BCLC分期密切相關(guān)，這從另一面證實(shí)了本研究的結(jié)果的價(jià)值[33]。同時(shí)本研究將LMR與CNLC分期和BCLC分期相結(jié)合有助于進(jìn)一步量化預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)，并提供更多的預(yù)后信息。雖然LMR的預(yù)后價(jià)值已經(jīng)在血液病惡性腫瘤和最近的實(shí)體腫瘤中得到證實(shí)[28,34-36]，但LMR在HCC分期亞組中的預(yù)后價(jià)值報(bào)道較少。然而，它的價(jià)值需要獨(dú)立的和更多的數(shù)據(jù)來驗(yàn)證。

之前發(fā)表的關(guān)于實(shí)體瘤中LMR的數(shù)據(jù)，一項(xiàng)研究調(diào)查了LMR對已切除的原發(fā)性結(jié)腸直腸癌患者的影響，另一項(xiàng)研究調(diào)查了診斷為軟組織肉瘤的患者[28,34]。在前一項(xiàng)研究中，Stotz等[28]在372例結(jié)直腸癌患者中使用LMR截?cái)嘀担―FS為2.83，OS為2.14）證明了LMR與DFS和OS之間的聯(lián)系。在第二項(xiàng)研究中，Szkandera等[34]通過分析340例軟組織肉瘤患者，確定了低于2.85的LMR與較差的DFS和OS之間存在相關(guān)性。這些截?cái)嘀蹬c本文當(dāng)前研究中確定的截?cái)嘀岛芙咏Ｇ冶疚臑榱诉M(jìn)一步了解LMR在HCC中的預(yù)后價(jià)值，根據(jù)CNLC分期及BCLC分期特點(diǎn)進(jìn)一步分析，得到在腫瘤早期（CNLC I～I(xiàn)I，BCLC A～B）及腫瘤晚期（CNLC III～I(xiàn)V，BCLC C～D）DFS和OS的差異。且通過DFS及OS的Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析得到LMR可作為HCC獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。

通過ROC曲線分析中Youden指數(shù)為LMR、NLR和PLR定義了最佳切割點(diǎn)，分別為2.87、2.60和133.61。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LMR（AUC：0.757）預(yù)測患者生存的效能大于NLR（AUC=0.687）和PLR（AUC=0.583）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與眾所周知的OS和DFS的獨(dú)立指標(biāo)NLR和PLR相比，LMR是一個更好的長期生存指標(biāo)[37-40]。在此研究之前，相關(guān)研究通常報(bào)道NLR優(yōu)于PLR[41-44]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)NLR和PLR都不是OS的獨(dú)立指標(biāo)。在本研究中，在單因素和多因素分析中發(fā)現(xiàn)，LMR高于2.87與HCC患者的OS和DFS增加之間存在明顯聯(lián)系。

LMR降低與患者不良預(yù)后相關(guān)的機(jī)制尚不清楚，但一些研究已經(jīng)給出了一些解釋。早在20世紀(jì)70年代，在對晚期腫瘤患者淋巴細(xì)胞減少的研究中，這些淋巴細(xì)胞成分的標(biāo)記物已經(jīng)得到了充分的證實(shí)[45]。這是其他已建立的炎癥標(biāo)志物的基礎(chǔ)之一，如PLR和NLR。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的支柱，是在乙肝或者丙肝病毒、酒精等毒性物質(zhì)或代謝綜合征等慢性炎癥背景下發(fā)生肝細(xì)胞癌的微環(huán)境的關(guān)鍵防御機(jī)制[46-47]。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的預(yù)后意義已被公認(rèn)[48]。雖然單核細(xì)胞與預(yù)后的相關(guān)性最近已被評估，但只有初步的假設(shè)可以解釋為什么單核細(xì)胞可能提示預(yù)后信息。在此，筆者提出了幾種可能的機(jī)制。首先，已有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細(xì)胞可能促進(jìn)腫瘤生長，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[49-50]。其次，據(jù)報(bào)道[51-53]，來源于循環(huán)單核細(xì)胞的TAM能夠滲透到HCC基質(zhì)中，發(fā)揮包括促進(jìn)增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和免疫抑制在內(nèi)的活性。

本文雖然提供了一些新的發(fā)現(xiàn)，但是這項(xiàng)研究有幾個局限性需要解決。一方面，由于LMR的值在隨訪時(shí)是動態(tài)的，本研究僅使用基線值來預(yù)測未來的結(jié)果，因此可能會遺漏很多信息，且樣本量較小，但近期Yu等[33]發(fā)表文獻(xiàn)報(bào)告6 619例數(shù)據(jù)，研究結(jié)果與本文類似，可為本研究提供一定的研究基礎(chǔ)。另一方面，由于回顧性研究的性質(zhì)，存在潛在的選擇偏差。

綜上所述，本研究表明LMR優(yōu)于NLR和PLR作為OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，具有一定的臨床價(jià)值，外科醫(yī)生可以利用LMR結(jié)合HCC分期對患者進(jìn)行危險(xiǎn)分級，判斷患者是否為高危人群。本研究結(jié)果尚需要一個更大的前瞻性研究來進(jìn)一步證實(shí)。