肝細(xì)胞癌患者腸道菌群的影響因素分析

周凱妃，王繼龍，滕艷娟，陳似霞，莫新少

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧 530021）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的原發(fā)性肝癌[1]，也是全球第五大常見惡性腫瘤[2-3]。此外，由于各種危險(xiǎn)因素，HCC的發(fā)病率也有所增加[4]，但目前仍缺乏理想的防治方法。人體腸道菌群存在一定的動(dòng)態(tài)平衡，在維持人體健康方面具有重要的作用。若腸道菌群的平衡受到各種不良因素的影響，就會(huì)形成腸道菌群失調(diào)（intestinal dysbacteriosis，ID），導(dǎo)致或促進(jìn)各種疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。因此，腸道菌群在生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[6]。近年來，隨著對(duì)肝-腸軸認(rèn)識(shí)的逐漸深入，腸道菌群與HCC之間的重要聯(lián)系越來越受到重視[7-8]。一方面，研究顯示ID促進(jìn)HCC[9]；另一方面，HCC的發(fā)生影響腸道菌群，導(dǎo)致ID的發(fā)生[8,10]，這是一個(gè)惡性循環(huán)的過程。因此，肝臟與腸道通過肝-腸軸相關(guān)聯(lián)的特征提示，除了治療肝臟原發(fā)病變外，腸道微生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)也應(yīng)作為HCC治療的重要靶點(diǎn)[3,11]。了解HCC患者腸道菌群的影響因素，有助于找到腸道菌群調(diào)節(jié)的潛在靶點(diǎn)。然而，目前大多數(shù)關(guān)于腸道菌群與HCC相關(guān)性的研究都是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。哪些因素是HCC患者腸道菌群的主要影響因素？根據(jù)HCC的特點(diǎn)，綜合考慮各種因素，探討HCC患者腸道菌群的主要影響因素鮮有報(bào)道。因此，本研究的目的是探討HCC患者腸道菌群的主要影響因素。這些因素與腸道菌群之間的相關(guān)性有助于為HCC患者腸道菌群的調(diào)控提供潛在靶點(diǎn)以及腸道菌群干預(yù)治療HCC提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象和數(shù)據(jù)收集

選取2018年11月—2019年7月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科符合條件的121例HCC患者為研究對(duì)象。所有患者均自愿參與本研究，并簽署書面知情同意書。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴年齡為18～65歲；⑵ 術(shù)后病理確診為HCC；⑶ 首次進(jìn)行HCC肝切除術(shù)；⑷ HCC合并乙肝；⑸ 自愿參加本次研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 有復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或合并其他惡性腫瘤；⑵ HCC破裂急診手術(shù)；⑶ 入院前1個(gè)月內(nèi)使用抗生素或益生菌制劑；⑷ 術(shù)前未能收集糞便標(biāo)本。

所有數(shù)據(jù)均由研究人員收集。除腸道菌群的檢測(cè)和焦慮的評(píng)估外，其他數(shù)據(jù)均在醫(yī)院系統(tǒng)收集，包括性別；年齡；肝功能指標(biāo)：總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、白蛋白（albumin，ALB）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、Child-Pugh評(píng)分、ISHAK炎癥評(píng)分、ISHAK纖維化評(píng)分；免疫炎性指標(biāo)：超敏C反應(yīng)蛋白（hypersensitive c-reactive protein，hs-CRP）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell，WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（neutrophil，NEU）、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（lymphocyte，LYM）、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)（monocyte，MONO），空腹血糖（fasting blood glucose，GLU）；血脂、肥胖指標(biāo)：高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol/low-density liporprotein cholesterol，HDL-C/LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol/total cholesterol，HDL-C/T-CHO）、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）；HCC分期：巴塞羅那臨床肝癌（Barcelona Clinical Liver Cancer，BCLC）分期、中國分期（Chinese Stage，CS）。其中，使用術(shù)前的糞便標(biāo)本檢測(cè)腸道菌群；入院第2天的外周血檢測(cè)TBIL、ALB、TBA、AST、ALT、hs-CRP、WBC、NEU、LYM、MONO、GLU、HDL-C/LDL-C、HDL-C/T-CHO；術(shù)后的病理標(biāo)本評(píng)估ISHAK炎癥、纖維化評(píng)分。

1.2 腸道菌群失調(diào)診斷

雙歧桿菌/腸桿菌（Bifidobacterium/Enterobacteriaceae，B/E）值＞1表示腸道菌群的組成正常，B/E值＜1表示ID，而且B/E值越低，提示ID越嚴(yán)重[12]。

1.3 焦慮評(píng)估和糞便標(biāo)本收集

研究人員使用狀態(tài)焦慮評(píng)估量表評(píng)估HCC患者術(shù)前的焦慮水平。并在術(shù)前使用糞便標(biāo)本采集管留取中段糞便作為標(biāo)本，避免尿液污染，留取標(biāo)本后放入裝有冰袋的泡沫盒中。研究人員盡快將糞便樣本送往實(shí)驗(yàn)室，分裝成0.2 g/管后放入-80 ℃的冰箱中保存。

1.4 腸道菌群檢測(cè)

使用糞便基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（北京天根，DP328-02）提取糞便標(biāo)本的總DNA，具體步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。本研究使用的引物[13-14]見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。雙歧桿菌（126 bp）正向：5'-GCG TGC TTA ACA CAT GCA AG TC-3'，反向：5'-CAC CCG TTT CCA GGA GCT ATT-3'；腸桿菌（195 bp）正向：5'-CAT TGA CGT TAC CCG CAG AAG AAG C-3'，反向：5'-CTC TAC GAG ACT CAA GCT TGC-3'。

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（北京TaKaRa，RR820A）在Applied Biosystems 7500（美國）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的菌群包括雙歧桿菌和腸桿菌。在冰上配置PCR反應(yīng)液，每1份PCR反應(yīng)液 （20 μL）包括TB GreenPremix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μmol/L）1 μL、PCR Reverse Primer（10 μmol/L）1 μL、ROX Reference Dye II 0.4 μL、DNA模板2 μL、滅菌水5.6 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性95 ℃（30 s），變性95 ℃（5 s），退火延伸[雙歧桿菌：60 ℃（34 s），腸桿菌：59 ℃（34 s）]，40個(gè)循環(huán)，融解曲線步驟為儀器默認(rèn)。引物的特異性通過擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線來確定。在每1次PCR擴(kuò)增中均構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線并設(shè)置陰、陽性對(duì)照。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建

雙歧桿菌和腸桿菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。先檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，計(jì)算其DNA拷貝數(shù)，然后將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品5倍比8個(gè)梯度稀釋后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，PCR擴(kuò)增的結(jié)果CT值為縱坐標(biāo)來構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，糞便樣本中雙歧桿菌和腸桿菌的拷貝數(shù)通過其標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用配對(duì)t檢驗(yàn)比較菌群的豐度。使用Pearson相關(guān)、Spearman秩相關(guān)或兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，然后將單因素分析結(jié)果為P＜0.1的變量納入多重線性回歸（逐步回歸法）。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

雙歧桿菌、腸桿菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率、決定系數(shù)和擴(kuò)增效率分別為-2.46、0.99、92%和-2.55、0.99、88%，均達(dá)到定量的標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。

2.2 腸道菌群的定量分析

HCC患者腸桿菌的豐度明顯高于雙歧桿菌[Log5（6.24±1.30）/g vs.Log5（7.59±1.11）/g，P=0.000]。ID（B/E＜1）的發(fā)生率為77.69%（94/121）。

2.3 單因素分析結(jié)果

單因素分析顯示，雙歧桿菌中，性別、TBA、WBC、NEU、MONO、HDL-C/LDL-C、HDL-C/T-CHO的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。對(duì)于腸桿菌，TBIL、性別、GLU的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。對(duì)于B/E值，MONO差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curves of plasmid DNA standards

表1 單因素分析腸道菌群的影響因素Table 1 Univariate analysis of the influencing factors for gut microbiota

2.4 多重線性回歸分析結(jié)果

多重線性回歸顯示，MONO是雙歧桿菌（P＜0.000）和ID（P=0.008）的主要影響因素；TBIL（P=0.011）、性別（P=0.027）、GLU（P=0.038）是腸桿菌的主要影響因素（表2）。

表2 多重線性回歸分析腸道菌群的影響因素Table 2 Multiple linear regression analysis of the influencing factors for gut microbiota

3 討 論

健康人的腸道菌群主要由專性厭氧有益菌組成，如雙歧桿菌，維持腸道菌群的平衡。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者中雙歧桿菌的豐度顯著低于腸桿菌，與健康人菌群的組成相反，這與之前的報(bào)道是一致的[15]。B/E值包括主要的有益菌雙歧桿菌和主要的條件致病菌腸桿菌，構(gòu)成腸道的定植抗性。因此，B/E值可以用來代表ID。B/E＜1表示ID，而且B/E越低，表示ID越嚴(yán)重[12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，HCC患者ID的發(fā)生率為77.69%。以往研究報(bào)道，HCC患者腸道細(xì)菌過度生長的發(fā)生率為71.8%，明顯高于肝硬化患者的發(fā)生率（41.1%）[16]。

本研究中，TBIL與腸桿菌呈正相關(guān)，是腸桿菌的主要影響因素之一；MONO與雙歧桿菌和ID呈負(fù)相關(guān)，是雙歧桿菌和ID的主要影響因素。其分子機(jī)制為:趨化因子CC家族（C-C motif chemokine ligand，CCL）如CCL3、CCL4、CCL5等，由肝腫瘤細(xì)胞分泌并參與MONO的激活[17-19]。作為肝功能的重要指標(biāo)，TBIL升高提示肝功能異常。肝臟功能障礙降低了肝臟清除內(nèi)毒素的能力，其主要活性成分脂多糖進(jìn)入體循環(huán)。當(dāng)脂多糖與MONO表面的相應(yīng)受體結(jié)合時(shí)，一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）的發(fā)生[20-21]。一方面，SIRS導(dǎo)致組織內(nèi)高代謝狀態(tài)，組織內(nèi)氧需求量增加，腸上皮細(xì)胞氧分壓降低。另一方面，由于SIRS灌注量低，腎素-血管緊張素的激活引起小動(dòng)脈收縮，而小腸缺血又進(jìn)一步加劇了小動(dòng)脈的收縮[22]。此外，在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)大量的炎癥介質(zhì)使腸道黏膜的通透性增加[23]。腸黏膜屏障因缺氧、缺血和腸黏膜通透性增加遭到破壞，導(dǎo)致腸道菌群的改變。Li等[24]的研究表明，TBIL與內(nèi)毒素呈正相關(guān)，而血漿內(nèi)毒素水平與慢性重型肝炎患者糞腸桿菌數(shù)量呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)HCC患者伴隨著雙歧桿菌的減少，腸桿菌的增加，循環(huán)MONO的激活[14]。此外，Chen等[25]的研究證實(shí)了腸道菌群與MONO亞群之間的密切聯(lián)系。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究證明了肝功能、炎癥指標(biāo)與腸道菌群的相關(guān)性，提示肝功能損傷和炎癥的治療有利于促進(jìn)腸道菌群的平衡，也為腸道菌群干預(yù)作為HCC的治療靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

性別與腸道菌群具有相關(guān)性，女性和男性的腸道菌群存在明顯的差異[26]。Huang等[27]發(fā)現(xiàn)，兼性厭氧細(xì)菌相對(duì)豐度的增加和厭氧細(xì)菌相對(duì)豐度的降低可以作為女性HCC的風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)，但對(duì)于男性HCC無效，因?yàn)榇菩缘哪c道菌群比雄性對(duì)肝損傷更敏感。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，即兼性厭氧菌腸桿菌在女性HCC中比在男性HCC中更為豐富。男性和女性腸道菌群的差異不僅有利于建立不同的HCC預(yù)警模型，也為腸道菌群的調(diào)節(jié)提供了不同的針對(duì)性干預(yù)措施。

此外，本研究結(jié)果還提示GLU是HCC患者腸桿菌的主要影響因素之一，兩者呈正相關(guān)。HCC的發(fā)生伴隨著代謝功能的改變，從而引起血糖的改變。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2直接參與高血糖對(duì)腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄重編，改變腸上皮細(xì)胞緊密連接和黏附連接的完整性，增加了腸道屏障的通透性，引起腸道菌群的改變[28]。還有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與個(gè)體化血糖控制相關(guān)[29]。以往研究[30]和本研究都證實(shí)了血糖與腸道菌群的相關(guān)性。這意味著良好的血糖控制有助于個(gè)人保持腸道菌群的平衡。

綜上所述，MONO、TBiL、性別和GLU被證實(shí)影響HCC患者的腸道菌群，從而導(dǎo)致ID。這些因素與腸道菌群的相關(guān)性可能為HCC患者腸道菌群的調(diào)節(jié)提供潛在靶點(diǎn)，同時(shí)也為腸道菌群干預(yù)治療HCC提供理論依據(jù)。

（本文編輯 姜暉）