王雪剛 張新枝 楊澍 甘蘇琴 劉詩 郝坤艷 周彬 于樂成

近年來，隨著乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)抗病毒藥物，主要是核苷(酸)類似物(Nucleoside/nucleotide Analogues, NAs)的廣泛使用，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的病毒復制及肝臟炎癥均得到了很好的控制[1-2]。在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等肝生化指標持續(xù)正常、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)下降不明顯、HBV DNA和HBeAg檢測不出的情況下，如何更精準地監(jiān)測患者病毒復制情況和選擇合理的停藥時機，是目前臨床實踐中常見的問題[3]。隨著這些新問題的提出，HBV RNA作為新的可能反映肝細胞內(nèi)HBV cccDNA水平的血清學指標，近年來迅速成為臨床和相關(guān)基礎(chǔ)研究人員關(guān)注的一個熱點。

HBV是一種DNA病毒，近年來一直以血清HBV DNA水平作為反映患者病毒復制水平的指標。血清HBV RNA的檢測早在1994年就有文獻報道，研究者利用PCR和RT-PCR可以同時從HBV相關(guān)肝癌和CHB患者血清檢測到HBV DNA和HBV RNA[4-5]。由于當時對HBV RNA臨床意義的認知不如HBV DNA和HBsAg明確，所以在相當長的時間里未得到臨床醫(yī)生和科研工作者應(yīng)有的重視。2015年以來，研究者們發(fā)現(xiàn)在HBV DNA獲得持續(xù)抑制的患者中，仍然能檢測到血清HBV RNA，其存在的意義和價值立即引起了臨床醫(yī)生和研究者的極大興趣[6-8]。

隨著對血清HBV RNA臨床應(yīng)用的關(guān)注，許多檢測HBV RNA的方法和試劑盒也應(yīng)運而生。我們對比了文獻報道中常用的“互補DNA末端快速擴增法”(rapid amplication of complimentary DNA-ends，RACE)和一種Sansure國產(chǎn)試劑盒檢測CHB患者血清HBV RNA的效能，采樣兩種方法對治療和未治療患者血清中的HBV RNA水平檢測值進行了評價，以期探討不同檢測方法在臨床應(yīng)用中的一致性和可替代性。

資料與方法

一、研究對象

收集2018年6—9月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院肝病門診就診的CHB患者，排除接受干擾素、合并丙型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒等其他病毒感染的患者。共納入101例，其中未接受NAs治療患者39例，曾經(jīng)或正在接受NAs治療者62例，均為參加常規(guī)隨訪的患者。所有患者均已簽署知情同意書，項目經(jīng)南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會批準。

二、HBV DNA及HBsAg等血清學指標的檢測

三、血清HBV RNA檢測

第二種方法采用圣湘公司HBV RNA定量試劑盒(科研用HBV RNA PCR-熒光探針法定量檢測試劑盒，Sansure法試劑盒)，在公司技術(shù)人員指導下，完全按照試劑盒說明的步驟操作。通過逆轉(zhuǎn)錄 HBV 核酸中的 pgRNA(經(jīng) DNA 酶消化)，利用針對 HBV pgRNA 序列設(shè)計的一組特異性引物與熒光探針，配以 PCR 反應(yīng)液，應(yīng)用一步法逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量 PCR 檢測技術(shù)，通過熒光信號的變化實現(xiàn) HBV pgRNA 的定量檢測。PCR 檢測體系含有陽性內(nèi)對照(內(nèi)標)和四個定量參考品，通過檢測內(nèi)標基因來監(jiān)測提取核酸中是否具有 PCR 抑制物，評價核酸提取的質(zhì)量，避免 PCR 假陰性。PCR 檢測體系含有內(nèi)參比熒光 ROX，用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動分析報告熒光與內(nèi)參比熒光ROX的比值。

四、統(tǒng)計學處理

采用Graphpad 8.0軟件進行統(tǒng)計分析及統(tǒng)計繪圖，組間均值比較采用t檢驗；HBV DNA與HBV RNA及兩種HBV RNA檢測結(jié)果的相關(guān)性采用R值進行計算；兩種方法檢測的HBV RNA 在未治療和治療患者中的一致性用Bland-Altman圖表示；兩種HBV RNA之間的關(guān)系采用線性回歸方程表示。

結(jié) 果

一、患者一般情況

101例患者的性別、年齡分布、HBeAg陽性的人數(shù)，以及ALT、HBsAg、HBV DNA水平的中位數(shù)和范圍見表1。

表1 治療組和未治療組患者的一般情況

二、治療組和未治療組的HBsAg水平和HBV DNA水平

兩組患者的HBsAg水平差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0023)，未治療組的HBsAg平均值明顯高于治療組(3.382與2.691 lg U/L)。HBV DNA水平在兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，未治療組的HBV DNA平均值明顯高于治療組(5.842對1.656 lg IU/mL)。見圖1。

圖1 治療組和未治療組患者HBsAg和HBV DNA水平比較

三、兩種HBV RNA檢測方法的檢測效能

按照Sansure法的試劑說明，其線性范圍為 3×102～1.00×109拷貝/mL，檢測下限(Low level of detection, LOD)為100拷貝/mL. 本實驗室按照文獻建立的RACE法的線性范圍為4×103～4×1010拷貝/mL，LOD為3 890 拷貝/mL。雖然數(shù)值顯示RACE法比Sansure法的LOD更高，但是在本研究中檢測相同的臨床樣本，RACE法比Sansure法的檢測值平均高出0.68 lg 拷貝/mL。

四、治療組和未治療組的HBV RNA水平

兩組患者的血清HBV RNA水平在治療組和未治療組間差異有統(tǒng)計學意義，但差異不如HBV DNA水平的組間差異顯著(P=0.0134)。兩種方法相比，RACE法比Sansure法檢測到的陽性患者更多，分別在101例患者中檢測出60和56例。RACE法比Sansure法的檢出平均檢值更高，分別為3.16 lg 拷貝/mL和2.53 lg 拷貝/mL。治療組中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分別為2.259 lg 拷貝/mL和1.650 lg 拷貝/mL(P=0.153 2)；未治療組中RACE和Sansure的HBV RNA平均值分別為4.583 lg 拷貝/mL和3.878 lg 拷貝/mL(P=0.308 6)。兩種方法檢測值的差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

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圖2 治療組和未治療組患者HBV RNA水平比較

五、治療組和未治療組患者HBV DNA與HBV RNA水平的相關(guān)性

在治療組中血清HBV DNA水平與HBV RNA水平?jīng)]有相關(guān)性，RACE法R2= 0.440 6，Sansure法R2= 0.508 1(圖3A)。

在未治療組中，兩種方法均顯示血清HBV DNA水平與HBV RNA水平顯著相關(guān)，RACE法R2=0.844 8，Sansure法R2= 0.866 7(圖3B)。

將治療組和未治療組混合分析，相關(guān)性不佳，RACE法R2= 0.610 0，Sansure法R2= 0.653 0(圖3C)。

RACE法和Sansure法的HBV RNA檢測值具有顯著的相關(guān)性?？傮w上兩種方法檢測值經(jīng)相關(guān)性檢驗為R2=0.8740，具有顯著相關(guān)性(圖3D)。

兩種方法在治療和未治療患者中的一致性采用Bland-Altman圖表示(圖4)。以兩種測量結(jié)果的差值為縱軸，以測量結(jié)果的均數(shù)為橫軸，繪制散點圖，用虛線標注出95%一致性界限(95% limits of agreement, 95% LoA)。95% LoA的范圍較窄(兩個目標之間的差值在治療組為-1.789到0.22 lg 拷貝/mL，未治療組為-2.25到0.53 lg 拷貝/mL)。以RACE法為基準，Sansure法的偏差在治療組為-0.78 lg 拷貝/mL，在未治療組為-0.86 lg 拷貝/mL。偏差值均小于2，兩種檢測值的一致性好(圖4)。經(jīng)deming線性回歸分析，以Race法結(jié)果作為X，以Sansure法結(jié)果作為Y，兩者的回歸方程為Y=0.9189X-0.3754。

圖3 HBV DNA水平與HBV RNA水平的相關(guān)性及兩種HBV RNA檢測值的相關(guān)性

圖4 兩種檢測方法HBV RNA水平在治療和未治療患者中的Bland-Altman一致性分析

討 論

HBV在復制過程中會產(chǎn)生5種HBV mRNA，在早期的研究中，研究者們雖然利用RT-PCR檢測到血清中存在HBV RNA，但未進一步探索其具體組成。近年報道血清HBV RNA有3.5 kb pgRNA、截斷的RNA、剪切的RNA等多種存在形式[10-12]。2016年Wang 等利用HBV 特異性引物分別擴增并定量檢測血清總HBV RNA(包括上述5種mRNA)和HBV 3.5 kb mRNA，發(fā)現(xiàn)總HBV RNA的量與3.5 kb mRNA的量無明顯差異，因此推斷血清中HBV RNA主要為3.5 kb mRNA，而3.5 kb mRNA包括兩種mRNA，即pre-C mRNA和pgRNA。Wang等進一步設(shè)計HBV特異性引物分別擴增pre-C mRNA與pgRNA的總和，結(jié)果未檢測到pre-C mRNA擴增產(chǎn)物，因此證實血清HBV RNA主要是3.5 kb pgRNA[7]。2018年，Bai等報道血清中HBV RNA主要是pgRNA或3’端已被降解的pgRNA，長度從3.5 kb到幾百bp之間呈現(xiàn)出異質(zhì)性，這些RNA主要存在于核心顆粒中，大多數(shù)以抗原抗體復合物的形式存在于血清中，少數(shù)也存在于完整的病毒顆粒中[13]。

本文應(yīng)用的RACE法即是只能檢測帶A尾的HBV RNA，由于其第一步逆轉(zhuǎn)錄時的引物只能靶向A尾，因此只有帶A尾的RNA能被檢測出來。而本文應(yīng)用的Sansure法則是需要DNA酶消化的一步法RT-qPCR法，該方法的好處是可以同時檢測帶A尾和不帶A尾的RNA；缺點是應(yīng)用DNA酶消化后，一方面需要質(zhì)控HBV DNA是否已經(jīng)被完全消化干凈(試劑盒設(shè)計了相關(guān)質(zhì)控對照)，另一方面需考慮DNA酶對HBV RNA也有消耗作用(Sansure試劑盒無相關(guān)質(zhì)控對照)，這會導致HBV RNA的水平被低估。從理論上講，Sansure法能檢測的RNA種類更多，其水平應(yīng)該更高。但是本研究結(jié)果顯示RACE法在未治療和治療患者中的檢測值均高于Sansure法。除了考慮到不同方法的敏感性不同，還需考慮DNA酶對HBV RNA的消耗作用可能影響了Sansure法的檢測水平。

另外，我們也注意到，治療組和未治療組的HBV DNA水平具有顯著差異，而HBV RNA的水平差異沒有HBV DNA顯著，在治療組患者中這種趨勢更加明顯。這種情況的出現(xiàn)主要是由于在接受治療的患者中大多數(shù)HBV DNA已經(jīng)轉(zhuǎn)陰，但是部分患者HBV RNA仍然是陽性。在62例治療組患者中，HBV DNA陽性患者為21例，Sansure法檢測的陽性患者為26例，RACE法檢測的陽性患者為31例。這使得各組的平均值也有所不同，提示Sansure法的敏感性仍有改進和提升空間。

兩種檢測方法在治療組患者中均比HBV DNA能檢測到更多陽性患者，這主要是由于NAs治療阻斷了HBV RNA的逆轉(zhuǎn)錄過程，而對從cccDNA到HBV RNA的轉(zhuǎn)錄過程并沒有影響。由于HBV RNA是cccDNA的直接下游產(chǎn)物，患者從HBV DNA轉(zhuǎn)陰到HBV RNA轉(zhuǎn)陰還需要cccDNA的耗竭作為中間過程，我們最近的一項研究闡明了這中間的時間差[15]。在血清HBV DNA與HBV RNA水平的相關(guān)性分析中，只在未治療組患者中觀察到了兩者的顯著相關(guān)性，而在治療組患者中未觀察到相關(guān)性。這也與上述NAs治療阻斷HBV RNA逆轉(zhuǎn)錄的機制有關(guān)。這部分結(jié)果也與雅培公司的報道一致[16]。雖然實驗效能評價中LOD數(shù)值Sansure法比RACE法更低，但是相同樣本用兩個方法同時檢測的檢測值則是RACE法更高，這主要是由于兩個方法使用的標準品不一致：RACE法采用本實驗室自己合成的標準品，Sansure法采用相應(yīng)試劑盒提供的標準品，其線性范圍和LOD值并不具有可比性。如果HBV RNA檢測能像HBV DNA的檢測系統(tǒng)一樣，有世界衛(wèi)生組織(World health organization, WHO)提供的統(tǒng)一的以IU為單位的標準品進行標定，則不同平臺的結(jié)果，其線性范圍和LOD之間才具有可比性[17]。

雖然從原理上來說，本研究的兩種方法檢測的是不同種類的HBV RNA，即Sansure法可同時檢測帶A尾和不帶A尾的RNA，而RACE法只能檢測到帶A尾的RNA。但是我們的結(jié)果顯示，總體上Sansure法和RACE法的相關(guān)性和一致性較好，并可通過線性回歸公式由一個檢測值推算出另一個檢測值。雅培公司建立了一種自動化的、同時靶向X區(qū)和C區(qū)的HBV RNA檢測方法，其結(jié)果用HBV DNA的標準品作為參比時，在治療的患者中HBV RNA的水平比HBV DNA平均高(2.45 ± 1.13)lg[16]。但在我們的結(jié)果中，治療組患者中除了HBV DNA陰性的樣本外，Sansure法和RACE法的平均檢測值均低于HBV DNA的檢測值。說明這兩種檢測方法的效能仍需進一步提高。

在未接受NAs治療的患者中，血清HBV DNA水平與HBV RNA水平具有很好的相關(guān)性，因此用HBV DNA水平來檢測HBV的復制水平是很可靠的辦法。但是在接受NAs治療的很多患者血清HBV DNA已經(jīng)低于LOD，這時候血清HBV RNA即成為更有效、更可靠的監(jiān)測病毒復制和預測臨床療效的標志物。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RACE法在較多的研究報道中被應(yīng)用于預測NAs和干擾素治療應(yīng)答或者病程進展，具有較好的預測效能。目前尚未見Sansure法應(yīng)用于臨床的報道。另外，兩種方法均未見應(yīng)用于NAs停藥復發(fā)的預測[6, 8, 18-19]。鑒于目前尚無HBV RNA的標準檢測方法，沒有統(tǒng)一標準品，也沒有批準用于臨床檢測的商業(yè)試劑盒，不同方法的臨床應(yīng)用場景還需進一步探索。因此，較合理的做法是我們在應(yīng)用HBV RNA水平作為標志物用于病情監(jiān)測和預測應(yīng)答之前，首先需要對不同的方法學進行比較和評估，然后再挑選出合適的方法應(yīng)用于臨床相關(guān)研究。