Neuropilin-1在非小細(xì)胞肺癌患者外周血Treg、PDC細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

施星月，陳翀，劉峰林，呂帝，徐杰，韓正祥

0 引言

神經(jīng)纖毛蛋白1（Neuropilin-1,NRP-1）是一種多功能的跨膜糖蛋白，在生理和病理?xiàng)l件下都可作為多種生長(zhǎng)因子或其他配體的共受體而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，在免疫、腫瘤、血管發(fā)育和神經(jīng)等系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1]，前期研究表明NRP-1在乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胃腸道腫瘤等多種人類腫瘤組織及癌細(xì)胞株中均過表達(dá)，但在相應(yīng)的正常組織中表達(dá)較低，并與腫瘤的預(yù)后相關(guān)，因此NRP-1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[2-5]。

Treg細(xì)胞（CD4+CD25+CD127-Treg）是一群具有低反應(yīng)性及免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，能阻斷機(jī)體抗腫瘤免疫，達(dá)到腫瘤免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用[6]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）是一種抗原呈遞細(xì)胞，目前人類外周血DC細(xì)胞主要分為髓樣樹突狀細(xì)胞（myeloid dendritic cell,MDC）和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytdid dendritic cell,PDC)（CD123+CD303+CD304+）2個(gè)亞型，其中PDC在誘導(dǎo)抗原特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)上發(fā)揮重要作用[7]。但有關(guān)NRP-1與Treg、PDC在非小細(xì)胞肺癌方面的研究卻鮮見報(bào)道，本研究檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌患者和健康體檢者外周血中NRP-1在Treg、PDC的表達(dá)，旨在探討其在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生中免疫調(diào)節(jié)的可能機(jī)制，并分析其與臨床參數(shù)的相關(guān)性，為NSCLC病情監(jiān)測(cè)、治療策略、療效判斷及預(yù)后評(píng)估提供新的相關(guān)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2018年6月—2019年9月就診于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的49例均經(jīng)手術(shù)、纖維支氣管鏡或經(jīng)皮肺穿刺活檢確診為非小細(xì)胞肺癌患者的外周血，具有完整的臨床、影像學(xué)、病理及隨訪資料。前期均未接受針對(duì)癌癥的治療（化療、放療以及生物免疫治療等），近3月內(nèi)未使用過免疫增強(qiáng)劑。全部符合世界衛(wèi)生組織（WHO）的診斷標(biāo)準(zhǔn)。49例非小細(xì)胞肺癌患者年齡30～74歲，中位年齡61歲。其中男32例、女17例。按2018年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM肺癌病理分期分為：Ⅰ期18例、Ⅱ12例、Ⅲ期11例、Ⅳ期8例。同時(shí)收集徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院33例健康體檢者外周血作為對(duì)照組，年齡22～70歲，中位年齡55歲。其中男17例、女16例。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

FITC/Alexa Fluor 488-A標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體試劑、APC標(biāo)記的抗人CD25單克隆抗體試劑、Alexa Fluor 700標(biāo)記的抗人CD3單克隆抗體試劑及PE.Cy5標(biāo)記的抗人CDl27單克隆抗體試劑均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；Brilliant Violet 421標(biāo)記的抗人CD304（NRP-1）單克隆抗體試劑、PEcy7標(biāo)記的抗人CD123單克隆抗體試劑、APC-Fire750標(biāo)記的抗人CD303單克隆抗體試劑、libIlr流式細(xì)胞儀及percp-cy5.5標(biāo)記的抗人CD45單克隆抗體試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

清晨空腹抽取外周靜脈血2 ml（肝素抗凝），于2 h內(nèi)檢測(cè)。取200 μl靜脈血于流式管中，加抗體2 μl混勻，暗處孵育20 min；加紅細(xì)胞裂解液2 ml，混勻，充分裂解紅細(xì)胞；加2 ml PBS混勻，2 000 r/min離心，洗滌3次，加 200 μl PBS混勻，置暗處4℃待上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)NRP-1的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步采用LSD 法對(duì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較。分類計(jì)數(shù)資料均采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)均為P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRP-l在肺癌患者和健康體檢者外周血Treg（CD4+CD25+CD127-Treg）細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果顯示，肺癌患者外周血CD4+T表達(dá)為（34.19±7.61）%，Treg表達(dá)為（8.24±1.12）%，Treg上中NRP-1的表達(dá)為17.44±5.04；健康體檢者外周血CD4+T表達(dá)為（38.91±4.85）%，Treg表達(dá)為（5.25±0.82）%，Treg中NRP-1的表達(dá)為12.69±3.29，見圖1。

2.2 對(duì)照組和非小細(xì)胞肺癌組臨床指標(biāo)比較

對(duì)照組外周血CD4+T、PDC的表達(dá)均明顯高于非小細(xì)胞肺癌組，對(duì)照組外周血Treg/CD4+T表達(dá)與NRP-1的表達(dá)均明顯低于非小細(xì)胞肺癌組（均P<0.05），見表1。

表1 對(duì)照組和肺癌組臨床指標(biāo)比較 (±s)Table 1 Comparison of clinical indicators between control group and NSCLC group (±s)

表1 對(duì)照組和肺癌組臨床指標(biāo)比較 (±s)Table 1 Comparison of clinical indicators between control group and NSCLC group (±s)

2.3 Treg/CD4+T、NRP-1、PDC與NSCLC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3.1 Treg/CD4+T 49 例NSCLC外周血中Treg/CD4+T表達(dá)情況與腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著TNM分期的升高和分化程度的降低，TregCD4+T的表達(dá)呈增高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

圖1 肺癌患者(A)與健康體檢者(B)外周血Treg細(xì)胞膜中NRP-l的表達(dá)流式圖Figure 1 Flow cytometry of NRP-l expression in Treg cell membrane in peripheral blood of NSCLC patients(A) and healthy subjects(B)

2.3.2 Treg中NRP-1的表達(dá) 49例NSCLC外周血Treg中NRP-1的表達(dá)情況與腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），隨著TNM分期的升高和分化程度的降低，NRP-1的表達(dá)呈增高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.3.3 PDC中NRP-1的表達(dá) 49例NSCLC外周血PDC中NRP-1的表達(dá)情況與腫瘤最大徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著TNM分期的升高，NRP-1在PDC中的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表2 Treg/CD4+T、NRP-1與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 (±s)Table 2 Correlation of Treg/CD4+T,NRP-1 with clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

表2 Treg/CD4+T、NRP-1與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 (±s)Table 2 Correlation of Treg/CD4+T,NRP-1 with clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

Notes:a:compared withⅠ,b:compared with Ⅱ,c:compared with Ⅲ,all P<0.05;#:compared with G3,@:compared with G2,all P<0.05.

表3 NRP-1在PDC中的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 (±s)Table 3 Relation between NRP-1 expression on PDC and clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

表3 NRP-1在PDC中的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 (±s)Table 3 Relation between NRP-1 expression on PDC and clinicopathological parameters of NSCLC patients (±s)

Notes:a:compared with Ⅰ,b:compared with Ⅱ,c:compared with Ⅲ,P<0.05.

2.4 Treg/CD4+T與CD4+T、NRP-1（Treg）、PDC的相關(guān)性分析

NSCLC患者Treg/CD4+T與NRP-1存在明顯的正相關(guān)關(guān)系（r>0,P<0.05）；Treg/CD4+T與PDC存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r<0,P<0.05），見表4。

3 討論

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，死亡率在中國(guó)癌癥相關(guān)死亡率中排名第一。最常見的病理類型是非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），主要包含鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、腺癌（LAC）和大細(xì)胞癌（LCC）[8]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，化學(xué)治療、放射治療、靶向治療以及免疫治療雖然延長(zhǎng)了一部分中晚期肺癌患者的生存期，然而5年生存率仍小于21%[9]。因此，尋找簡(jiǎn)便易操作的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)具有重要的臨床意義。近年來，關(guān)于肺癌患者的免疫功能引起重視，研究表明惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)與機(jī)體的免疫功能缺陷有關(guān)，肺癌患者存在一定程度的免疫功能異常。隨著對(duì)肺癌免疫耐受機(jī)制的深入研究，CD4+T、NRP-1、Treg以及PDC在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的相互作用日益引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

表4 Treg/CD4+T與CD4+T、NRP-1(Treg)、PDC的相關(guān)性分析Table 4 Correlation of Treg/CD4+T with CD4+T,NRP-1(Treg) and PDC

T淋巴細(xì)胞亞群的主要作用是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，在正常機(jī)體內(nèi)各T細(xì)胞亞群保持動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體正常細(xì)胞免疫應(yīng)答。當(dāng) T淋巴細(xì)胞亞群比例出現(xiàn)異常時(shí)，殺傷腫瘤細(xì)胞、控制腫瘤生長(zhǎng)的作用明顯減低[10]。CD3+代表總T細(xì)胞，主要分為 CD4+、CD8+T細(xì)胞兩大亞群，本研究檢測(cè)CD4+T（CD3+CD4+T）在非小細(xì)胞肺癌患者和健康體檢者的細(xì)胞比率，結(jié)果顯示非小細(xì)胞肺癌患者CD4+T細(xì)胞比率明顯低于健康體檢者，可能原因是腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)抑制性免疫微環(huán)境的形成。臨床上可通過檢測(cè)腫瘤患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群的變化來進(jìn)一步評(píng)估患者免疫功能狀態(tài)和病情變化，可指導(dǎo)臨床使用免疫調(diào)節(jié)劑及其他藥物。

目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NRP-1是VEGF165高親和力受體，NRP-1通過NRP-1b1/b2結(jié)構(gòu)域與絡(luò)氨酸激酶受體VEGFR2結(jié)合，促進(jìn)腫瘤血管的生成，在腫瘤細(xì)胞增殖、黏附、遷移、侵襲中都發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)[1]。Treg是一群具有獨(dú)特免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，不但可抑制自身免疫性疾病的發(fā)生，而且還參與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)[11]。近年來癌癥患者腫瘤組織及外周血中Treg的積累已被廣泛研究，并且與癌癥進(jìn)展、腫瘤免疫逃逸、預(yù)后差和對(duì)治療缺乏反應(yīng)有關(guān)。但迄今為止國(guó)內(nèi)外研究中鮮見NRP-1和Treg兩者在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相關(guān)研究。本研究同時(shí)檢測(cè)了NRP-1和Treg兩者在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)明顯高于健康體檢者，隨著肺癌TNM分期的升高和分化程度的降低，NRP-l、Treg的表達(dá)呈明顯遞增趨勢(shì)。而且，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)外周血中NRP-1表達(dá)與Treg細(xì)胞比率呈正相關(guān)（r>0,P<0.05）。NRP-1在癌癥患者外周血Treg中的表達(dá)上調(diào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，NRP-1與Treg介導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸機(jī)制有關(guān)，NRP-1充當(dāng)VEGF的共受體，并已被證明在腫瘤的Treg浸潤(rùn)中起重要作用，通過在Treg中表達(dá)的NRP-1起作用，腫瘤衍生的VEGF吸引NRP-1+Treg進(jìn)入腫瘤組織[12]，增強(qiáng)腫瘤的免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

在人外周血中，NRP-1在PDC細(xì)胞上高表達(dá)，當(dāng)前有許多標(biāo)記用于識(shí)別PDC，包括CD123、BDCA-2（CD303）和NRP1（CD304）。研究表明NRP-1可通過與腫瘤細(xì)胞衍生出的VEGF的相互作用而參與PDC的腫瘤浸潤(rùn)，而Treg則可通過與NRP-1的相互作用，弱化DC活化效應(yīng)性T細(xì)胞的功能，最終使效應(yīng)性淋巴細(xì)胞活化不足，抗腫瘤抗原效應(yīng)減弱[1]。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示非小細(xì)胞肺癌外周血Treg與PDC呈明顯負(fù)相關(guān)（r<0,P<0.05）。近年來，程序性死亡受體1（programmed death 1,PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death ligand 1,PD-L1）免疫檢查點(diǎn)抑制劑成為肺癌免疫治療研究熱點(diǎn)，PD-1在活化后的CD8+T、CD4+T、B、DC及單核細(xì)胞等諸多免疫細(xì)胞上表達(dá)[13-14]。胸腺來源的Treg細(xì)胞（tTreg）可表達(dá)PD-1。PD-1/PD-L1相互作用有助于使CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化成Treg細(xì)胞，Treg細(xì)胞上表達(dá)的PD-1還可以與T細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1相互作用，以介導(dǎo)免疫抑制，在抗原識(shí)別過程中，NRP-1表達(dá)促進(jìn)Treg與DC的相互作用，從而抑制T細(xì)胞活化[15]。但非小細(xì)胞肺癌患者外周血中NRP-1與Treg、PDC、PD-1相互作用的具體機(jī)制，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此明確其相互作用的關(guān)系可能有利于對(duì)非小細(xì)胞肺癌免疫治療。

NRP-1在人外周血Treg、PDC細(xì)胞表達(dá)的研究結(jié)果有顯著差異，提示NRP-1通過與Treg、PDC的廣泛相互作用在免疫調(diào)節(jié)和功能中起著重要作用。但NRP-1與Treg、PDC之間的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，從而使抗NRP-1治療成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)和途徑，為臨床尋找新的治療方法提供理論依據(jù)。