馬雨璇 王 娜 王 冰 李 鋼,

(1. 南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院, 江蘇 南京 210023; 2. 南京師范大學(xué) 分析測(cè)試中心, 江蘇 南京 210023)

細(xì)菌性陰道炎是一種陰道感染性疾病，臨床上常見(jiàn)于育齡女性人群。它由于多種病原體混合感染引發(fā)陰道內(nèi)正常菌群失調(diào)，改變了患者陰道的內(nèi)部環(huán)境，產(chǎn)生炎癥等多種婦科病，同時(shí)改變患者的月經(jīng)周期性激素，嚴(yán)重影響患者的正常生活[1-4]。細(xì)菌性陰道炎在外陰陰道感染中所占比例在40%～50%，其發(fā)病率遠(yuǎn)高于念珠菌性陰道炎、滴蟲(chóng)性陰道炎[5]。有研究認(rèn)為，它對(duì)于育齡女性危害非常大，廣大婦女應(yīng)高度重視，并保持良好的衛(wèi)生習(xí)慣[6]。硝呋太爾(Nifuratel)，化學(xué)名為5-[(甲硫基)甲基]-3-[(5-硝基亞糠基)氨基]-2-噁唑烷酮，結(jié)構(gòu)如圖1所示，是由意大利普利(PoLi)化學(xué)工業(yè)公司獨(dú)家開(kāi)發(fā)生產(chǎn)的一個(gè)主要用于婦科混合性感染的藥物[7]。硝呋太爾是硝基呋喃衍生物，屬?gòu)V譜類抗生素，對(duì)婦科感染的常見(jiàn)病原體如革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌、滴蟲(chóng)、霉菌、衣原體和支原體都有很強(qiáng)的殺滅作用[8]。大量臨床資料顯示，使用硝呋太爾制霉素陰道軟膏治療細(xì)菌性陰道炎，療效頗為理想，遠(yuǎn)勝于甲硝唑，且具有較高的安全性、可靠性，停藥后復(fù)發(fā)率低[9-13]。除此以外，它還能對(duì)陰道組織中的乳酸桿菌進(jìn)行保護(hù)，從而維持陰道環(huán)境處于生態(tài)平衡狀態(tài)，防止發(fā)生霉菌二重感染[14]。

圖1 硝呋太爾的化學(xué)結(jié)構(gòu)(分子量為285)Fig. 1 Structure of Nifuratel (Mr 285)

本文先用紫外可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)確定硝呋太爾樣品最大吸收波長(zhǎng)，高效液相色譜(HPLC)測(cè)定其純度，使用元素分析(EA)、質(zhì)譜分析(MS)、傅里葉變換紅外光譜(IR)[15]、核磁共振波譜分析(NMR)確證樣品化學(xué)結(jié)構(gòu)，檢測(cè)結(jié)果與硝呋太爾化學(xué)結(jié)構(gòu)一致，再利用熱分析(DSC和TGA)[16]、X-射線粉末衍射(PXRD)以及掃描電子顯微鏡(SEM)等儀器測(cè)定硝呋太爾的熔點(diǎn)、分解溫度、晶型結(jié)構(gòu)以及微觀形貌。此外，將硝呋太爾樣品置于高濕環(huán)境下對(duì)晶型的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果顯示硝呋太爾樣品晶型在高濕環(huán)境下沒(méi)有發(fā)生變化，十分穩(wěn)定。

1 硝呋太爾樣品的結(jié)構(gòu)確證

1.1 儀器與試劑

儀器：日本理學(xué)公司的D/max 2500VL/PC型陽(yáng)極轉(zhuǎn)靶X射線衍射儀；日本電子公司的JSM-5610型掃描電子顯微鏡；美國(guó) Perkin Elmer公司的Analysis Diamond 差示掃描量熱儀和Analysis Pyrisl熱重分析儀；德國(guó)元素分析系統(tǒng)公司的Vario EL III元素分析儀；美國(guó)瓦里安公司的Varian2200質(zhì)譜儀；德國(guó)布魯克公司的VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀；瑞士布魯克公司的 AV-400核磁共振波譜儀；美國(guó)Varian公司的Cary 5000型紫外可見(jiàn)近紅外分光光譜儀；美國(guó)AGILENT公司的AGILENT 1100高效液相色譜儀。

試劑：硝呋太爾樣品由重慶某公司提供。

1.2 光譜分析

紫外可見(jiàn)吸收光譜分析：以乙腈為溶劑溶解樣品，檢測(cè)范圍為200～800 nm，確定最大吸收波長(zhǎng)。

傅里葉變換紅外光譜法分析：采用KBr壓片法檢測(cè)樣品，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，用聚苯乙烯膜校正。

X-射線粉末衍射法分析：測(cè)定條件為管壓：45 kV, 管流：150 mA，Cu-Kα輻射，石墨彎晶單色器，發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°，接受狹縫(RS)=0.15 mm。掃描速度:10°·min-1，步寬：0.02°。

1.3 高效液相色譜分析

用C18柱，以0.02%的碳酸銨溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0左右)-乙腈(65∶35，V/V)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)，流速1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。樣品用乙腈溶解，濃度為1 mg/mL，取樣10 μL。

1.4 元素分析

樣品經(jīng)干燥后燃燒分解，定量轉(zhuǎn)換，檢測(cè)，再經(jīng)數(shù)據(jù)處理得到C、H、S、N的百分含量。

1.5 質(zhì)譜分析

以乙腈為溶劑，ESI源為檢測(cè)條件，用Varian2200質(zhì)譜儀檢測(cè)樣品。

1.6 核磁共振波譜分析

以乙腈為溶劑，TMS(四甲基硅烷)作為內(nèi)標(biāo)，檢測(cè)1H譜。

1.7 熱分析

差示掃描量熱法分析：稱取樣品約2.0 mg放入鋁坩堝中密封，將坩堝放入DSC中進(jìn)行測(cè)試，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，升溫速率為10 K·min-1，升溫范圍為 25～200 ℃，進(jìn)行DSC分析。

熱重分析：稱取樣品約2.0 mg放入坩堝，將坩堝放入TGA中進(jìn)行測(cè)試，以氮?dú)鉃楸Ｗo(hù)氣，升溫速率為10 K·min-1，升溫范圍為25～400 ℃，進(jìn)行TGA分析。

1.8 掃描電子顯微鏡法分析

取樣品粘結(jié)在樣品座上，鍍膜處理后放置于掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 高濕穩(wěn)定性考察

為了確保該制劑的有效性和安全性,按照中國(guó)藥典2015版第四部“原料藥物與藥物制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則”,我們考察了硝呋太爾在25 ℃避光，相對(duì)濕度為92.5%條件下放置的外觀性狀、晶型及吸濕增重等重要指標(biāo)隨時(shí)間變化的情況。

3 結(jié)果分析

3.1 光譜分析

紫外可見(jiàn)吸收光譜分析：經(jīng)檢測(cè)，硝呋太爾樣品最大吸收波長(zhǎng)為365 nm，第二大吸收波長(zhǎng)為260 nm。

傅里葉變換紅外光譜法分析：圖2為硝呋太爾的紅外圖譜。圖中1 607 cm-1、1 529 cm-1和1 413 cm-1是呋喃環(huán)的環(huán)骨架吸收峰；3 131 cm-1和3 166 cm-1是呋喃環(huán)上碳?xì)涞纳炜s振動(dòng)；931 cm-1和744 cm-1是呋喃環(huán)上碳?xì)涞膹澢駝?dòng)；1 363 cm-1、1 349 cm-1和810 cm-1是-NO2的吸收峰，1 753 cm-1是C=O的伸縮振動(dòng)；1 259 cm-1和1 236 cm-1是C-O的伸縮振動(dòng)；2 984 cm-1是-CH3的伸縮振動(dòng)；1 458 cm-1和1 385 cm-1是-CH3的彎曲振動(dòng)，1 027 cm-1是C-N鍵的吸收峰，1 129 cm-1是-CH2SCH3的吸收峰。

圖2 硝呋太爾的紅外圖譜Fig. 2 FT-IR of Nifuratel

X-射線粉末衍射法分析：用PXRD檢測(cè)硝呋太爾樣品，衍射圖譜呈現(xiàn)出尖銳的衍射峰，說(shuō)明該樣品以結(jié)晶狀態(tài)存在。其衍射圖譜見(jiàn)圖3。

圖3 硝呋太爾的PXRD圖譜Fig. 3 PXRD image of Nifuratel

3.2 高效液相色譜分析

根據(jù)紫外可見(jiàn)吸收光譜的分析結(jié)果確定最大吸收波長(zhǎng)，由于365 nm有熒光，所以選擇260 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)得樣品保留時(shí)間為4.791 min，純度為99.86%，符合結(jié)構(gòu)確證所需的純度要求。

3.3 元素分析

對(duì)硝呋太爾樣品進(jìn)行C、H、S、N的元素分析。數(shù)據(jù)如表1，測(cè)定值與理論值的誤差在允許的范圍之內(nèi)。元素分析結(jié)果符合硝呋太爾的結(jié)構(gòu)組成C10H11N3O5S。

表1 硝呋太爾的元素分析數(shù)據(jù)

3.4 質(zhì)譜分析

對(duì)硝呋太爾樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。硝呋太爾的分子量為285，由圖4可知，質(zhì)荷比286.1是樣品[M+H]+的峰；質(zhì)荷比308.0是樣品[M+Na]+的峰，質(zhì)荷比324.0是[M+K]+的峰，質(zhì)荷比593.0的峰是[2M+Na]+的峰，質(zhì)荷比609.0是[2M+K]+的峰。通過(guò)質(zhì)譜分析可證明樣品的分子量與硝呋太爾的分子量一致。

圖4 硝呋太爾的質(zhì)譜圖(+ESI)Fig. 4 MS of Nifuratel (+ESI)

3.5 核磁共振波譜分析

表2是硝呋太爾的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)及歸屬。根據(jù)1H-NMR譜圖數(shù)據(jù)分析，氫譜中共給出8組氫，各組峰的積分比例由低場(chǎng)到高場(chǎng)為1∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶3。由于旁邊基團(tuán)的影響使7號(hào)位的兩個(gè)氫分裂成兩個(gè)峰，經(jīng)初步判斷，該樣品氫譜大致符合硝呋太爾結(jié)構(gòu)式。

表2 硝呋太爾的氫譜核磁共振數(shù)據(jù)

3.6 熱分析

差示掃描量熱儀分析：圖5是硝呋太爾的DSC曲線。由圖5可知，硝呋太爾在187.69 ℃開(kāi)始熔解，在189.70 ℃時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)測(cè)得的熱焓為123.19 J/g。通過(guò)差示掃描量熱分析可知在這種測(cè)試條件下硝呋太爾的熔點(diǎn)為187.69 ℃。

圖5 硝呋太爾的DSC曲線Fig. 5 DSC curve of Nifuratel

熱重分析：圖6是硝呋太爾的TGA曲線。由圖6可知，樣品在201.56 ℃時(shí)開(kāi)始分解失重，在273.78 ℃時(shí)分解速率達(dá)到最大。通過(guò)TGA曲線可知，硝呋太爾的分解溫度為273.78 ℃。

圖6 硝呋太爾的TGA曲線Fig. 6 TGA curve of Nifuratel

3.7 掃描電子顯微鏡法分析

硝呋太爾的掃描電鏡圖如圖7所示。由圖7可知，硝呋太爾樣品外觀形貌呈片層狀和塊狀。

圖7 硝呋太爾的SEM圖譜Fig. 7 SEM image of Nifuratel

3.8 高濕穩(wěn)定性影響

取硝呋太爾樣品分成A、B兩份敞口放置在以飽和硝酸鉀溶液營(yíng)造相對(duì)濕度為92.5%的密閉容器中，避光放置10天，在第五天和第十天分別對(duì)A樣品進(jìn)行外觀性狀觀察和稱重，對(duì)B樣品取出部分進(jìn)行PXRD檢測(cè)。結(jié)果如圖8和表3所示，硝呋太爾樣品在高濕環(huán)境下穩(wěn)定，晶型的2θ和d值沒(méi)有變化，第五天和第十天的PXRD曲線上部分峰(I)與最強(qiáng)峰(I0)相比的比值降低，在高濕環(huán)境下樣品顏色一直呈鮮黃色，沒(méi)有發(fā)生改變，吸重在5%以下。綜合判斷硝呋太爾在高濕(RH=92.5%)環(huán)境下穩(wěn)定。根據(jù)藥典無(wú)須進(jìn)行RH=75%環(huán)境下的濕度穩(wěn)定性考察。

圖8 不同天數(shù)的高濕PXRD圖譜Fig. 8 High-humidity PXRDimage of different days

表3 硝呋太爾的高濕數(shù)據(jù)

4 討論

通常情況下做結(jié)構(gòu)測(cè)定工作，對(duì)樣品的純度要求較高，為了達(dá)到這一要求，測(cè)定前要對(duì)試樣做精制處理。本實(shí)驗(yàn)中首先用高效液相色譜測(cè)試純度，結(jié)果顯示硝呋太爾樣品符合結(jié)構(gòu)測(cè)定的純度要求(98%以上)。元素分析和質(zhì)譜也驗(yàn)證了這一結(jié)果，表明能夠進(jìn)行下一步的結(jié)構(gòu)分析。

在進(jìn)行高濕穩(wěn)定性考察時(shí)，要注意第五天和第十天取出進(jìn)行PXRD檢測(cè)的樣品不要再放回去，以免影響剩余樣品的濕度環(huán)境，但又要考察吸濕增重，所以準(zhǔn)備A、B兩份樣品。