葉發(fā)慧 ，察艷艷，馮美玲，李 響，, ，劉瑞娟，，曹 東， ，張 波， ，劉寶龍，，陳文杰，，張懷剛

(1.中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院 西北高原生物研究所，中國(guó)科學(xué)院 種子創(chuàng)新研究院，西寧 810008；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；4.青海大學(xué)，西寧 810016；5.青海師范大學(xué)，西寧 810008)

普通小麥(TriticumaestivumL,AABBDD,2n=6x=42)是世界廣布的重要糧食作物，為人類提供30%糧食[1]，小麥面粉品質(zhì)與人類的營(yíng)養(yǎng)狀況直接相關(guān)。小麥面粉品質(zhì)由小麥胚乳中的貯藏蛋白決定。麥醇溶蛋白(Gliadin，Gli)是小麥儲(chǔ)藏蛋白的主要成分之一，在胚乳蛋白中高達(dá)40%，可通過二硫鍵與麥谷蛋白結(jié)合成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而賦予面筋一定的可塑性、粘性和延展性[2]。麥醇溶蛋白由小麥第1、第6部分同源群染色體短臂上的Gli-1和Gli-2位點(diǎn)編碼[3]。Gli-1位點(diǎn)包括Gli-A1、Gli-B1和Gli-D1；Gli-2位點(diǎn)包括Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2[4]。麥醇溶蛋白的位點(diǎn)都表現(xiàn)出廣泛的等位基因變異，到目前為止，在普通小麥的Gli-1和Gli-2位點(diǎn)上已鑒定出多于130個(gè)等位變異[5]。根據(jù)醇溶蛋白在酸性(pH3.1)聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acidic polyacrylamide gel electrophoresis，A-PAGE)中遷移率的不同，進(jìn)一步將醇溶蛋白細(xì)分為α，β，γ和ω醇溶蛋白(遷移率大小為ω<γ<β<α)[6]。麥醇溶蛋白譜帶組成幾乎不受環(huán)境影響，完全由基因控制[7]。因此，它也可作為特殊的生化和分子標(biāo)記，用于揭示不同材料間的遺傳差異[8]。少數(shù)骨干親本雜交等傳統(tǒng)小麥育種手段，導(dǎo)致現(xiàn)代小麥品種的遺傳背景日趨狹窄，嚴(yán)重限制了小麥面粉品質(zhì)的進(jìn)一步提高。從具有更廣泛遺傳變異的普通小麥野生近緣物種中，發(fā)掘具有優(yōu)質(zhì)基因的種質(zhì)資源并加以利用，是普通小麥遺傳改良的有效途徑[9]。

節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii,DD,2n=2x=14)是普通小麥D染色體組的二倍體供體物種[10]，廣泛分布于西起中東各國(guó)，東至中國(guó)的廣闊地域，具有豐富的遺傳多樣性[11]，擁有大量現(xiàn)代普通小麥品種所不具備的有益基因[12-14]。節(jié)節(jié)麥中醇溶蛋白位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制與普通小麥相似[15-16]，Gli-D1和Gli-D2位點(diǎn)具有多個(gè)等位基因的特征，這使得區(qū)分系、遺傳、變種和亞種，研究種群結(jié)構(gòu)和確定它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系成為可能[17]。節(jié)節(jié)麥D染色體組與普通小麥D染色體組完全同源，其優(yōu)良基因可通過遠(yuǎn)緣雜交直接轉(zhuǎn)移到普通小麥中, 培育新的普通小麥品種[18-20]。

本研究通過對(duì)212份節(jié)節(jié)麥材料的醇溶蛋白進(jìn)行酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳(A-PAGE)檢測(cè)，分析其遺傳多樣性，旨在了解這些節(jié)節(jié)麥種質(zhì)資源的醇溶蛋白多樣性狀況，為后續(xù)遠(yuǎn)緣雜交親本的選擇和進(jìn)一步的小麥品種改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2019年春季在中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行。

供試材料為筆者前期已收集的212份節(jié)節(jié)麥種質(zhì)資源(表1、表2)，其中15份來自中國(guó)，58份地理位置不詳。

普通小麥‘中國(guó)春’作為對(duì)照材料，用以確定212份節(jié)節(jié)麥的醇溶蛋白組成類型。

表1 供試材料來源地Table 1 Origin of test materials

1.2 方 法

1.2.1 醇溶蛋白的提取 醇溶蛋白的提取參照傅賓孝等[21]的方法并稍做改動(dòng)。(研磨籽粒的量由1 粒改為半粒，蛋白提取液由100 μL改為 50 μL)。

1.2.2 溶液配制 溶液的配制參照王祖華等[22]的方法。

1.2.3 電泳分離 用酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離醇溶蛋白(A-PAGE)。將兩塊玻璃板清洗干凈后用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精再次清洗，涂上含量為2% 的剝離硅烷。將裝好的玻璃板傾斜放置在泡沫板上，取5～10 mL凝膠液按體積比1∶1比例加入體積分?jǐn)?shù)為1.2%的過氧化氫，迅速搖勻，沿長(zhǎng)玻璃板內(nèi)表面倒入底部，10 min后封底。玻璃板底部和泡沫板之間放 2 個(gè)10 μL規(guī)格的槍頭，便于底部凝膠倒吸。取30 mL凝膠原液，加入體積比1∶1的體積分?jǐn)?shù)為1%的過氧化氫，迅速搖勻，沿長(zhǎng)玻璃板內(nèi)表面倒入玻璃板夾縫中，直至溢出,迅速插入樣品梳，靜止3 h，慢慢垂直拔出樣品梳。每個(gè)樣品槽內(nèi)加入樣品8 μL，兩端加入‘中國(guó)春’作對(duì)照。反向連接電路，設(shè)置額定電壓350 V，電流30 mA，時(shí)間2 h。

1.2.4 染色 電泳結(jié)束后取下玻璃板，留下黏附凝膠的玻璃板，將凝膠和玻璃板一起放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，染色1 h。將膠和玻璃板一同取出，清水沖去表面染料，無需脫色，連同玻璃板一起拍照保存。

1.2.5 命名 參照Autran等[23]的命名方法，以‘中國(guó)春’的電泳圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，‘中國(guó)春’的第1條譜帶(遷移率最小的條帶)作為標(biāo)準(zhǔn)帶，其他譜帶的遷移率與它的遷移率比值作為相對(duì)遷移率來確定各蛋白質(zhì)條帶的位置,‘中國(guó)春’第1條譜帶的相對(duì)遷移率記為1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Gis軟件獲得遷移率；按Bushuk 等[24]的計(jì)算系統(tǒng)，以‘中國(guó)春’為對(duì)照，計(jì)算節(jié)節(jié)麥醇溶蛋白的相對(duì)遷移率。根據(jù)相對(duì)遷移率大小將電泳譜帶分為α、β、γ 和 ω 4 個(gè)區(qū)。按照條帶的有無將結(jié)果計(jì)為 1(有)和 0(無)， 利用NTsys軟件計(jì)算品種間相似系數(shù)(GS)，用 GS值按不加權(quán)成對(duì)群算術(shù)平均法(U-PGMA)進(jìn)行聚類分析。統(tǒng)計(jì)分析在 Microsoft Excel 2013中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇溶蛋白條帶多態(tài)性分析

212份材料共分離出2 143 條譜帶(部分材料電泳圖見圖1)，單個(gè)材料變幅為7～16條，平均為10.11條，大部分有9～12條，占總條帶的 73.11%(表2)；18份材料(8.49%)分離出12條以上的譜帶，39份材料(18.40%)分離出9條以下的譜帶。來自巴基斯坦的388號(hào)分離出的譜帶最多，為16條；其次是來自阿塞拜疆的346號(hào)材料，分離出15條譜帶；19份材料(8.96%)均分離出7條譜帶，主要來自阿塞拜疆和烏茲別克斯坦。來自中國(guó)的15份材料分離出13、12、11、10、9、8條譜帶，分別占6.67%、20.0%、13.3%、 13.3%、20.0%和 26.67%。212份材料共分離出422種不同相對(duì)遷移率的譜帶(表3)，譜帶相對(duì)遷移率的變幅為0.27～5.82；第一條譜帶相對(duì)遷移率最小的是37號(hào)材料，這份材料兩條譜帶的相對(duì)遷移率為0.72和0.89,均小于1；最后一條譜帶的相對(duì)遷移率為5.82，是44號(hào)材料和321號(hào)材料，其中44號(hào)材料分離出的最小譜帶的相對(duì)遷移率為0.99。譜帶頻率變幅為0.24%～ 7.35%，44號(hào)材料相對(duì)遷移率出現(xiàn)次數(shù)最多，為 7.35%，其次是58號(hào)；有94種相對(duì)遷移率只出現(xiàn)1 次。對(duì)照‘中國(guó)春’共分離出17條譜帶，遷移率為1～5.15，在所有材料中，有28份材料譜帶的相對(duì)遷移率小于1，其中6份材料的2條帶均小于1；譜帶相對(duì)遷移率大于 5.15的材料共有60份，18號(hào)、19號(hào)、24號(hào)、34號(hào)、41號(hào)、43號(hào)和44號(hào)7份材料均分離出12～13條譜帶，第一條譜帶的相對(duì)遷移率小于1，最后一條譜帶的相對(duì)遷移率大于5.15。

表2 供試材料編號(hào)及其醇溶蛋白帶數(shù)Table 2 Number of test materials and the number of gliadin bands

(續(xù)表2 Continued table 2)

箭頭代表相對(duì)遷移率為1的主帶

參照Bushuk 等[24]的方法，根據(jù)相對(duì)遷移率大小將422種譜帶分為 α、β、γ 和 ω 4 個(gè)區(qū)(表4)。α區(qū)有362條譜帶，占總數(shù)的16.89%，127種變異類型，占總數(shù)的30.09%；β區(qū)有470條譜帶，占總數(shù)的21.93%,有60種變異類型，占總數(shù)的14.22%；γ區(qū)有483條譜帶，占總數(shù)的 22.54%，有105種變異類型，占總數(shù)的24.88%；ω區(qū)有828條譜帶，占總數(shù)的30.81%，有130種變異類型，占總數(shù)的30.81%。ω區(qū)譜帶數(shù)最多，占總譜帶數(shù)的38.64%，α區(qū)多態(tài)性條帶最多，高達(dá)34.70%，譜帶組合類型最多。

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

利用NTsys軟件對(duì)212份材料進(jìn)行遺傳相似性分析，發(fā)現(xiàn)這些材料的遺傳相似系數(shù)(GS)變幅為0～0.58，平均值為0.037。不存在GS值為1的現(xiàn)象，而有68.54%的GS值為0。來自中國(guó)的18號(hào)和19號(hào)材料的GS值最高(0.58)，表明二者親緣關(guān)系最近。

2.3 U-PGMA聚類分析

對(duì)212份材料進(jìn)行基于UPGMA法的聚類分析(圖2)，212份材料在GS=0.032水平上可分為5個(gè)大類。第Ⅰ類包含8份材料，部分材料來自伊朗(3份)和烏茲別克斯坦(1份)，可分為2個(gè)亞類，各包含4份材料；這一類群的遺傳相似系數(shù)最小，分布面積較局限，并沒有大面積出現(xiàn)。第Ⅱ類包含35份材料；部分材料來自伊朗(7份)、中國(guó)(7份)、塔吉克斯坦(4份)、土耳其(2份)、巴基斯坦(1份)、格魯尼亞(1份)、阿塞拜疆(2份)和法國(guó)(2份)，可分為2個(gè)亞類，分別包含6份和29份材料。這一類群中包含7份伊朗材料和7份中國(guó)材料，兩者遺傳相似系數(shù)高；中國(guó)的材料1份來自新疆(11號(hào))，3份來自河南(18號(hào)、19號(hào)和20號(hào))，3份來源地不詳(10號(hào)、22號(hào)和23號(hào))。第Ⅲ類包含23份材料，部分來自伊朗(6份)、中國(guó)(1份)、土庫(kù)曼尼斯坦(1份)、烏茲別克斯坦(3份)、阿富汗(1份)、土耳其(1份)、巴基斯坦(3份)、塔吉克斯坦(1份)和阿塞拜疆(1份)，可分為2個(gè)亞類，分別包含9份和14份材料。第Ⅳ類包含8份材料，部分來自伊朗(1份)和巴基斯坦(2份)，可分為2個(gè)亞類，分別包含3份和5份材料。第Ⅴ類包含139份材料，部分來自伊朗(11份)、巴基斯坦(18份)、阿富汗(9份)、土耳其(15份)、烏茲別克斯坦(8份)、阿塞拜疆(8份)、中國(guó)(7份)、阿拉伯(2份)、哈薩克斯坦(2份)、吉爾吉斯斯坦(1份)、俄羅斯(4份)、塔吉克斯坦(4份)、土庫(kù)曼尼斯坦(1份)、亞美尼亞(1份)和印度(1份)，可分為3個(gè)亞類，分別包含43、58和37份材料；7份來自中國(guó)，1份新疆(12號(hào))，2份陜西(14號(hào)和248號(hào))，2份河南(16號(hào)和265號(hào))，2份產(chǎn)地不詳(24號(hào)和29號(hào))；中國(guó)的材料與巴基斯坦、阿富汗的材料親緣關(guān)系較近。筆者據(jù)此推測(cè)，伊朗地區(qū)至少存在5類節(jié)節(jié)麥居群，并具有5種可能的對(duì)外傳播擴(kuò)散路徑(圖3)。

表3 不同遷移率在212份材料中出現(xiàn)的頻率Table 3 Frequency of different mobilities in 212 materials

(續(xù)表3 Continued table 3)

表4 4個(gè)區(qū)醇溶蛋白帶型統(tǒng)計(jì)結(jié)果及多樣性Table 4 Statistical results of gliadin in four zones and diversity of gliadin

3 討 論

1959年Jones第一次將醇溶蛋白劃分為α、β、γ 和 ω 4個(gè)區(qū)[7]，1975年Gubareva利用加拿大栽培小麥的電泳圖對(duì)其進(jìn)行命名，稱為“數(shù)字字母命名”系統(tǒng)[24]。其公式表示方法為：按遷移率的大小，將α、β、γ和ω 4 個(gè)區(qū)域分別分成 1～7、1～5、1～5 和 1～12 條譜帶；染色強(qiáng)烈的譜帶的數(shù)字添加下劃線表示，染色弱的數(shù)字添加圓括號(hào)表示，而雙重線則用數(shù)字上方的兩個(gè)點(diǎn)表示。下標(biāo)1表示2區(qū)移動(dòng)快的臨近波，下標(biāo)2表示移動(dòng)慢的臨近波。同年，Autran等[25]利用生長(zhǎng)在法國(guó)的春小麥和冬小麥的電泳圖再次對(duì)4區(qū)進(jìn)行規(guī)范，根據(jù)遷移率為65的γ-醇溶蛋白計(jì)算其余譜帶的相對(duì)遷移率，并將相對(duì)遷移率為0.65的譜帶定位主帶。在后面研究中發(fā)現(xiàn)，法國(guó)命名系統(tǒng)并不能應(yīng)用到加拿大栽培小麥上，1977年Bushuk等[24]發(fā)現(xiàn)這一問題，并將法國(guó)材料的主帶定為相對(duì)遷移率為0.5的譜帶。因?yàn)樵囼?yàn)材料的地域等差異，本研究中的材料未找到其遷移率為0.5的主帶，由此可見，麥醇溶蛋白現(xiàn)有的命名方法并不具備廣泛的普適性。筆者經(jīng)過多次重復(fù)試驗(yàn)證明，在保證時(shí)間、電壓、電流等試驗(yàn)參數(shù)一致的前提下，‘中國(guó)春’的第1條譜帶清晰易辨識(shí)，相對(duì)位置也比較穩(wěn)定，可作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)帶。將其他譜帶的遷移率和‘中國(guó)春’第1條譜帶遷移率的比值作為相對(duì)遷移率來確定各醇溶蛋白條帶的位置，可準(zhǔn)確鑒定每一條醇溶蛋白譜帶，且無需除‘中國(guó)春’以外的其他材料作為對(duì)照。

圖2 212份種質(zhì)材料醇溶蛋白聚類圖Fig.2 Clusters of 212 accessions based on gliadin band patterns

圖3 節(jié)節(jié)麥可能的傳播路徑Fig.3 Material propagation path

本研究從212份節(jié)節(jié)麥材料中共發(fā)現(xiàn)422種不同遷移率的譜帶，譜帶出現(xiàn)頻率變幅為0.24%～ 7.35%。譜帶相對(duì)遷移率變幅為0.27～5.82。根據(jù)相對(duì)遷移率的大小，可將譜帶分為 α、β、γ 和 ω 4 個(gè)區(qū)，其中處于α區(qū)譜帶的相對(duì)分子質(zhì)量最小，相對(duì)遷移率最大，可能由于擴(kuò)散效應(yīng)等原因，在A-PAGE膠圖上最不清晰。為提高該區(qū)譜帶的辨識(shí)度，建議使用雙向電泳等其他方法驗(yàn)證α區(qū)譜帶組成。本研究中，譜帶遷移范圍最大的是44號(hào)材料，范圍最小的是阿富汗的270號(hào)材料。小于對(duì)照‘中國(guó)春’第1條主帶和大于對(duì)照‘中國(guó)春’最后一條譜帶的材料分別有28份和60份。有7份材料譜帶的最小相對(duì)遷移率小于1，最大相對(duì)遷移率大于5.15(譜帶遷移范圍大于對(duì)照‘中國(guó)春’)。這7份材料在聚類圖(圖2)中分布在Ⅱ類(4份)、Ⅲ類(1份)和Ⅴ類(2份)，在第Ⅱ類的4份中，18號(hào)材料和19號(hào)材料來自中國(guó)，34號(hào)材料地理位置不詳，但它和來自中國(guó)的材料親緣關(guān)系最近；同樣，位于第Ⅲ類群的44號(hào)材料也是材料地理位置不詳，但它和來自中國(guó)的材料近緣關(guān)系最近。位于第Ⅴ類群中的24號(hào)材料也來自中國(guó)。由此可見，中國(guó)的節(jié)節(jié)麥居群中存在著具有較廣遷移率范圍醇溶蛋白譜帶的材料。醇溶蛋白譜帶遷移范圍異常的材料是否會(huì)對(duì)小麥品質(zhì)改良有積極作用呢？值得進(jìn)一步研究。

結(jié)合參試材料的聚類結(jié)果(圖2)和地理分布(圖3)，發(fā)現(xiàn)來自伊朗的材料遺傳多樣性最豐富，此結(jié)果支持節(jié)節(jié)麥的起源地是伊朗地區(qū)的觀點(diǎn)[26]。中國(guó)境內(nèi)的節(jié)節(jié)麥至少存在 3 種類型。一類(類型Ⅴ)遍布節(jié)節(jié)麥的自然分布區(qū)，而另兩類(類型Ⅱ和Ⅲ)則是在西北南三個(gè)方向上僅存在于伊朗及其毗鄰地區(qū)，唯獨(dú)向東一路分布到中國(guó)。這兩類材料是以伊朗→土庫(kù)曼尼斯坦→塔吉克斯坦→中國(guó)的單線路徑傳播，并沒有向四周擴(kuò)散，而這一路徑正好與古絲綢之路陸路中的一條不謀而合，由此可見，至少不能排除這類材料是經(jīng)古絲綢之路等人為途徑傳播至中國(guó)的可能。從聚類結(jié)果來看，類型Ⅱ中，和伊朗原始材料親緣關(guān)系最近的11號(hào)材料來自中國(guó)新疆，18、19和20號(hào)材料來自中國(guó)河南。來自新疆的12號(hào)材料、陜西的14號(hào)、248號(hào)材料和河南的265號(hào)材料同處于第Ⅴ類群中，親緣關(guān)系較近，根據(jù)這些結(jié)果可以推測(cè)，中東地區(qū)節(jié)節(jié)麥從阿富汗和巴基斯坦傳入中國(guó)新疆地區(qū)后(主要是巴基斯坦)，很可能繼續(xù)向東傳播到黃河中下游地區(qū)。這與筆者之前新疆及黃河流域節(jié)節(jié)麥的高分子谷蛋白研究結(jié)果一致(未發(fā)表資料)。