王繼蓮， 任 羽， 李明源

(喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院 葉爾羌綠洲生態(tài)與生物資源研究高校重點實驗室， 喀什 844006)

低溫淀粉酶多由低溫微生物分泌，可在室溫環(huán)境下催化分解淀粉(包括糖原、糊精)分子內(nèi)的糖苷鍵，且在0 ℃保持酶學(xué)活性[1-2]。相比同功能中溫酶、低溫酶的周轉(zhuǎn)系數(shù)Kcat值和生理效率Kcat/Km值更高，但熱穩(wěn)定性較差[3]。綜合認(rèn)為，其適冷機制主要歸因于分子內(nèi)互作的減弱以及酶分子和溶劑間互作增強，并經(jīng)過適當(dāng)構(gòu)象折疊提高酶分子柔韌性，提升了其與底物作用范圍，減弱了自身活化能，從而提高低溫催化性能，但同時也導(dǎo)致穩(wěn)定性下降[4-7]。低溫淀粉酶經(jīng)適度加熱即迅速失活，這種加熱一般并不影響反應(yīng)系統(tǒng)中其它酶活性，這在一些生產(chǎn)工藝如淀粉無蒸煮、食品保鮮方面非常有利。其在低溫需求的醫(yī)藥化工方面也有一定的應(yīng)用[8]。

目前，低溫酶產(chǎn)生菌多存在酶活性不高且產(chǎn)量低的問題，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高昂，成為制約其生產(chǎn)工藝規(guī)?；钠款i。為解決此類問題，可通過誘變、基因工程或進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件的方法獲得高產(chǎn)且性質(zhì)穩(wěn)定的菌株。其中，培養(yǎng)條件優(yōu)化多考慮單因素試驗設(shè)計、正交設(shè)計以及響應(yīng)面法等。響應(yīng)曲面法(Response surface methodology，RSM)可通過分析相關(guān)回歸方程探尋最佳參數(shù)水平組合，集成優(yōu)化多變量問題。該方法以其界面簡便直觀、編碼的回歸方程擬合精度高、可優(yōu)化評價諸多因素間主效應(yīng)和相互作用等特點，在實驗設(shè)計與結(jié)果表達方面更優(yōu)良，廣泛用于生物過程優(yōu)化[9-12]。

項目組前期從東帕米爾高原凍土中分離鑒定一株產(chǎn)低溫淀粉酶假單胞菌株P(guān)seudomonassp.D5-2(GenBank登錄號KU296965)[13]，但酶活力不甚理想，限制其進一步研究開發(fā)。為此，本研究在單因素基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法，借助Design Expert10軟件，采用Box-Benhnken設(shè)計建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化D5-2產(chǎn)酶培養(yǎng)基，以期提升酶活力，為后續(xù)深入闡釋低溫酶催化機理和工業(yè)應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

假單胞菌Pseudomonassp.D5-2[13]，分離自東帕米爾高原凍土層，最適生長溫度15 ℃，最適生長pH 7.5，其所產(chǎn)淀粉酶粗酶最適催化溫度25 ℃，熱穩(wěn)定性較差，最適反應(yīng)pH 6.5。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g/L，酵母提取物10 g/L，pH自然。

以上培養(yǎng)基115 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化培養(yǎng)

將D5-2活化后，接種至5 mL 液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)12～18 h即得種子培養(yǎng)液。將種子液按2%比例接入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h。取一定體積發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，所得上清為粗酶液。

1.2.2 淀粉酶活力測定

采用 DNS(3,5-二硝基水楊酸dinitrosalicylic acid)法[14]測定上清液粗酶活力。

在pH 6.0，25 ℃條件下，每毫升酶液每分鐘分解釋放出1 μg葡萄糖所需酶量定義為 1個活力單位(U)，記為U/mL。

1.2.3 單因素試驗

1)碳源種類及濃度對酶活力影響。以10 g/L不同種類碳源(果糖/蔗糖/麥芽糖/乳糖/玉米粉)替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，其余條件不變分析酶活力差異。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的乳糖濃度分別調(diào)整為5、10、15、20、25和30 g/L，考察不同濃度乳糖對菌株產(chǎn)酶活力影響。

2)氮源種類及濃度對酶活力影響。以10 g/L不同種類氮源(胰蛋白胨/牛肉膏/酪蛋白/尿素/硫酸銨)代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母提取物，其余條件不變分析酶活力差異。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的胰蛋白胨濃度分別調(diào)整為5、10、15、20、25和30 g/L，考察不同濃度下的菌株產(chǎn)酶活力。

3)無機鹽種類及濃度對酶活力影響。在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加1 g/L的不同鹽離子(Na+/ K+/ Mg2+/ Mn2+/ Cu2+)，其他條件不變分析酶活力差異。將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的Cu2+濃度分別調(diào)整為0.5、1、1.5、2、2.5和3 g/L，考察不同濃度下的菌株產(chǎn)酶活力。

1.2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基

根據(jù)單因素結(jié)果，以對菌株產(chǎn)酶影響最大的乳糖、胰蛋白胨和CuSO43個因素為自變量，借助Design-Expert 10統(tǒng)計軟件，通過Box-Benhnken設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基組分，測定相應(yīng)酶活力，具體水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析中各因子和水平

1.2.5 模型擬合及統(tǒng)計分析

對所得結(jié)果進行二次回歸擬合及方差分析檢驗，得出各變量最佳參數(shù)。模型及因素的顯著性統(tǒng)計意義通過F值考察，所有試驗均做3個平行。

1.2.6 模型驗證

按照模型最佳參數(shù)進行驗證實驗，檢驗?zāi)Ｐ偷目煽啃裕治鲎罱K優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 碳源種類及質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶的影響

碳源種類、濃度在相關(guān)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)過程中扮演重要角色，對產(chǎn)酶起到誘導(dǎo)作用。由圖1可知，乳糖的誘導(dǎo)作用最顯著，酶產(chǎn)量為85 U/mL。其次是麥芽糖和玉米粉，這可能與其蛋白酶系組成有關(guān)，其他碳源促進效果不明顯，因而選擇乳糖作為最佳碳源。

圖1 不同碳源對Pseudomonas sp.D5-2產(chǎn)酶影響

圖2 乳糖濃度對Pseudomonas sp.D5-2產(chǎn)酶影響

隨乳糖濃度增加，酶活力先升高后降低，在15 g/L時酶活力最大為90 U/mL。繼續(xù)增加濃度，酶活力開始下降，可能產(chǎn)生了阻遏效應(yīng)。

2.1.2 氮源種類及質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶影響

氮源為微生物合成含氮代謝物提供相應(yīng)來源。由圖 3可知，有機氮源比無機氮更適宜產(chǎn)酶，尤以胰蛋白胨促進作用最顯著，其次是牛肉膏。而無機氮源硫酸銨則抑制了酶活。推測原因可能是有機氮源含有不同結(jié)構(gòu)碳架，利于供給較多合成前體，營養(yǎng)更周全，導(dǎo)致菌體新陳代謝比較旺盛。而無機氮源結(jié)構(gòu)簡單，發(fā)酵早期即被作為速效型氮源迅速利用，被消耗殆盡后造成發(fā)酵液pH值降低，影響細胞膜各種成分運輸和粗酶合成。

圖3 不同氮源對Pseudomonas sp.D5-2產(chǎn)酶影響

胰蛋白胨濃度對產(chǎn)酶影響較大，濃度為10 g/L時酶活力最高，濃度繼續(xù)增加，酶活力受到抑制開始下降，因此最佳濃度為10 g/L。

圖4 胰蛋白胨濃度對Pseudomonas sp.D5-2產(chǎn)酶影響

2.1.3 無機鹽種類及質(zhì)量濃度對產(chǎn)酶影響

無機鹽可調(diào)節(jié)細胞滲透壓，維持菌體細胞的等滲作用，或作為輔酶或酶的組成部分，或激活菌體中的酶促進細菌生長繁殖。由圖5可知，Cu2+對菌株產(chǎn)酶激活最明顯，其次是Na+，其余離子不利于發(fā)酵產(chǎn)酶?？赡苁荂u2+參與了該淀粉酶酶蛋白組成。

圖5 無機鹽對Pseudomonas sp.D5-2產(chǎn)酶影響

Cu2+濃度為1～2 g/L時菌株產(chǎn)酶活力旺盛，趨于穩(wěn)定狀態(tài)，其中2 g/L時酶活力最高。低于或高于此濃度，菌株產(chǎn)酶受到抑制。

圖6 Cu2+濃度對Pseudomonas sp.D5-2產(chǎn)酶影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 試驗方案及回歸模型

根據(jù)單因素確定的對酶活力影響較大的自變量，設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面試驗，分析各因素主效應(yīng)及交互作用，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

用Design Expert 10方差分析模塊得到酶活力(Y)與乳糖濃度(A)、胰蛋白胨(B)、硫酸銅濃度(C)編碼水平下的二次響應(yīng)面回歸模型Y=+95.86+2.27A+2.74B+1.91C+2.75AB+2.80AC+0.63BC-3.67A2-3.49B2-3.04C2。式中A、B、C各項系數(shù)絕對值的大小直接反映其對淀粉酶活力指標(biāo)值的影響程度，系數(shù)正負表示影響作用趨向。

2.2.2 方差分析

模型一次項A、B、C差異極顯著，表明乳糖、胰蛋白胨和硫酸銅濃度均可極顯著影響菌株發(fā)酵產(chǎn)酶。二次項A2、B2、C2顯著，說明酶活力與乳糖、蛋白胨、Cu2+濃度不是簡單的線性關(guān)系；交互作用項中AB、AC、BC的P值分別為<0.0001、<0.0001、0.0692，表明胰蛋白胨和乳糖、硫酸銅交互作用均顯著，而乳糖和硫酸銅交互作用不顯著。

綜合F值大小或方程一次項系數(shù)絕對值大小，確定各因素對酶活力影響為胰蛋白胨>乳糖>硫酸銅。

表 3 回歸模型方差分析

2.2.3 響應(yīng)面分析

1)乳糖和胰蛋白胨交互作用。固定Cu2+濃度為2 g/L，當(dāng)乳糖濃度為10～20 g/L、胰蛋白胨5～15 g/L時，酶活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，說明二者濃度過高或過低都不能使酶活力最大，只有它們?nèi)∧尺m中值時才可達到最高值。

胰蛋白胨濃度曲面較乳糖平緩，說明胰蛋白胨對酶活力影響更大。等高線性狀反映出兩因素間交互作用強弱，橢圓形說明二者間交互作用較強，圓形則無交互作用。圖7等高線圖為橢圓形，說明二者交互作用對D5-2產(chǎn)酶影響顯著。

圖7 乳糖和胰蛋白胨濃度對酶活力影響的響應(yīng)面以及等高線圖

2)乳糖和硫酸銅交互作用。圖8為胰蛋白胨濃度10 g/L時，乳糖和Cu2+濃度對酶活力影響的等高線及響應(yīng)面圖。等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，說明兩者交互作用較強。乳糖濃度曲面較硫酸銅曲面變化較為平緩，說明乳糖濃度對酶活力影響大于硫酸銅。

圖8 乳糖和硫酸銅濃度對酶活力影響的響應(yīng)面以及等高線圖

3)胰蛋白胨和硫酸銅交互作用。固定乳糖濃度為15 g/L，當(dāng)硫酸銅濃度在1.5～2.5 g/L時，酶活力呈現(xiàn)先增大后減小趨勢。等高線呈橢圓形，說明胰蛋白胨和硫酸銅濃度的交互作用對酶活力影響顯著。胰蛋白胨濃度曲面緩于硫酸銅，說明胰蛋白胨濃度對酶活力影響程度高于硫酸銅。

圖9 硫酸銅和胰蛋白胨濃度對酶活力影響的響應(yīng)面以及等高線圖

2.3 驗證實驗

預(yù)測最優(yōu)培養(yǎng)基組分為乳糖濃度19.715 g/L，胰蛋白胨濃度14.191 g/L，硫酸銅濃度2.417 g/L，此條件下，酶活力為98.876 U/mL。將上述模型根據(jù)實際情況修正參數(shù)后(調(diào)整乳糖19.7 g/L，胰蛋白胨14.2 g/L，硫酸銅2.4 g/L)進行3次重復(fù)實驗，結(jié)果酶活力為99.7、99.6和98.4 U/mL，平均99.2 U/mL。實測值接近模型預(yù)測值，表明回歸模型與實際情況擬合良好，方程可信度較好。

3 討論與結(jié)論

科學(xué)的培養(yǎng)基組分和配比不僅促進菌體快速生長繁殖，增強微生物的代謝性能，也能提高能源利用率，降低控制生產(chǎn)成本?，F(xiàn)代數(shù)學(xué)中的很多統(tǒng)計優(yōu)化技術(shù)逐漸滲透到微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化中[15-17]。高云航等[18]應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化BacilluslicheniformisMX5產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶發(fā)酵條件，酶活達到最大值103.965 U/L。陳曉媛等[19]在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化里氏木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件，最終羧甲基纖維素酶活力、微晶纖維素酶活力、纖維二糖酶活力和濾紙酶活力均得到提升。Sharma和Arora[20]利用響應(yīng)面分析優(yōu)化Phlebiafloridensis產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的含水量、NH4Cl及麥芽提取物含量，結(jié)果漆酶活力增加34倍。

在淀粉酶活力提升方面，也有諸多采用響應(yīng)面優(yōu)化菌株發(fā)酵條件的報道。但不同于本研究確定的最適碳源乳糖，氮源胰蛋白胨，無機鹽離子Cu2+，王淑軍等[21]對海洋細菌Pseudoalteromonassp.G23產(chǎn)低溫淀粉酶的響應(yīng)面分析表明，可溶性淀粉最利于其產(chǎn)酶，其次是糊精，而葡萄糖、蔗糖、纖維素則抑制菌株產(chǎn)酶。劉紅飛等[22]對Pseudoalteromonassp.GS230發(fā)酵產(chǎn)低溫淀粉酶的響應(yīng)面分析顯示，最佳碳源為可溶性淀粉，氮源為牛肉膏和蛋白胨，Na+、K+、Ca2+等能顯著激活酶活力，但Cu2+強烈抑制淀粉酶活力。而庫米拉·馬吉提的分析表明[23]，枯草芽孢桿菌4-1產(chǎn)低溫淀粉酶的最佳發(fā)酵無機鹽離子為Ca2+。綜上，不同培養(yǎng)條件對菌株產(chǎn)酶影響較大，推測原因可能與酶系組成有關(guān)，當(dāng)然也可能受到菌株種屬特異性及分離地域影響。

本研究通過建立連續(xù)變量三維曲面模型，對影響D5-2發(fā)酵產(chǎn)低溫淀粉酶的生物過程因子最佳水平和交互作用進行評價，以獲得最優(yōu)發(fā)酵條件，最終酶活力達99.2 U/mL。由于細胞行為和生物合成特性受環(huán)境因素影響較復(fù)雜，對大規(guī)模復(fù)雜工業(yè)環(huán)境的響應(yīng)行為還需進一步研究，才能更全面支撐工業(yè)生物過程的優(yōu)化與放大。