張彥濤 褚智杰 孫君軍 劉偉峰 楊成 楊延輝

1河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，洛陽(yáng)471003；2河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，洛陽(yáng)471003

0 引言

原發(fā)性肝癌是一種難以根治的惡性腫瘤，其具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)[1]，其中90%以上為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。流行病學(xué)證據(jù)表明，HCC的發(fā)病率以及死亡率逐年上升[2-3]，其病死率高居惡性腫瘤的第2位[4-5]。隨著對(duì)HCC研究的不斷深入，人們對(duì)HCC的定期篩查越來(lái)越重視，此外隨著手術(shù)水平的提升，放療、化療藥物的進(jìn)步，及介入、靶向治療等精準(zhǔn)化治療技術(shù)的發(fā)展，HCC患者的生存時(shí)間和生存質(zhì)量已有了一定的改善。但目前，對(duì)HCC的治療仍有較大瓶頸，患者術(shù)后的5年生存率仍令人不甚滿意[6]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule-associated protein I light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ)是表征細(xì)胞自噬的標(biāo)志物，其可以反映細(xì)胞自噬水平的高低。在很多腫瘤細(xì)胞中，自噬基因都發(fā)生了表達(dá)減少、表達(dá)增加、突變等變異，而在細(xì)胞自噬的調(diào)控過(guò)程中，許多癌基因、致癌途徑和腫瘤抑制基因都充當(dāng)了重要角色[6-7]。激活轉(zhuǎn)錄因子3（activating transcription factor 3，ATF3）是 ATF/CREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其可通過(guò)啟動(dòng)或關(guān)閉靶基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)細(xì)胞凋亡、周期進(jìn)展及腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。目前主流的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，LC3-Ⅱ、ATF3在腫瘤發(fā)生過(guò)程中均發(fā)揮雙重作用，一方面可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，另一方面可以抑制腫瘤細(xì)胞形成。

目前，鮮有研究涉及基于LC3-Ⅱ、ATF3的聯(lián)合檢測(cè)，分析其在HCC中的作用機(jī)制。本研究中，分析9例新鮮HCC組織和癌旁組織，回顧性分析82例HCC組織和癌旁組織蠟塊標(biāo)本。通過(guò)Western blot和免疫組化法檢測(cè)樣本LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)，探究其表達(dá)水平與HCC患者臨床病理學(xué)特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年1月至2014年10月，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的HCC患者82例；其中，男性68例，女性14例，年齡（54.3±8.5）歲；收集相關(guān)的HCC組織和癌旁組織蠟塊標(biāo)本。選擇2018年11月至2019年3月，河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科收治的經(jīng)手術(shù)治療的HCC患者9例；其中，男性5例，女性4例，年齡（53.9±4.5）歲；收集相關(guān)的HCC組織和距腫瘤組織＞3 cm的癌旁組織樣本，9例新鮮組織樣本均于離體后30 min內(nèi)用生理鹽水沖洗凈、無(wú)菌紗布蘸干，錫箔紙包裹后置于液氮罐中快速冷凍，24 h后置于-80℃冰箱內(nèi)保存。收集患者的一般臨床病理資料，包括患者年齡、性別、血清甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、腫瘤分化程度、靜脈癌栓、腫瘤直徑、HBsAg等。

所有病例均經(jīng)過(guò)臨床病理證實(shí)，并具有完整病例資料和隨訪資料。所有病例患者在術(shù)前沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何抗腫瘤治療。本研究已通過(guò)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要材料與儀器

羊抗兔二抗、二辛可寧酸（bicinchoninincacid，BCA）蛋白定量試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×）、N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（N，N，N＇，N＇-Tetramethylethylenediamine，TEMED）、預(yù)染蛋白 Marker、聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色試劑盒、放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、非磷酸化蛋白酶抑制劑（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；兔/鼠通用型鏈霉親和素（Streptavidin，SP）試劑盒、聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯（Tween-20）（北京索萊寶科技有限公司），ATF3兔單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），LC3-Ⅱ兔單克隆抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔單克隆抗體（美國(guó) CST公司）。

-80℃冰箱、-20℃冰箱、高壓滅菌鍋、多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），光學(xué)顯微鏡（日本NIKON公司），RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），渦旋振蕩器、冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），普通離心機(jī)、Western blot電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色

病理組織蠟塊經(jīng)切片、烤片、脫蠟、水化等步驟后后，加入檸檬酸修復(fù)液進(jìn)行高壓鍋抗原修復(fù)；自然冷卻后，在室溫條件下用過(guò)氧化氫封閉10 min，山羊封閉血清作用10 min，甩去羊血清后滴加一抗（1∶500稀釋）孵育3 h，回收一抗后磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌 3 次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育30 min，PBS洗滌 3次（3 min/次）；3，3'-二氨聯(lián)苯胺（3，3'-diamiobenzidine，DAB）顯色，蘇木素染色，0.1%HCl分化；95%乙醇溶液洗2次（5 min/次），無(wú)水乙醇洗3次（5 min/次），二甲苯洗 3次（5 min/次），進(jìn)行脫水；中性樹膠封片鏡檢[8]。

依照陽(yáng)性細(xì)胞及強(qiáng)度進(jìn)行陽(yáng)性與陰性評(píng)定。采用雙盲法在低倍鏡下觀察切片，分別在腫瘤細(xì)胞及癌旁組織細(xì)胞切片上隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／觀察細(xì)胞數(shù)）×100%。LC3-Ⅱ的陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。ATF3的陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)而細(xì)胞核不表達(dá)者為陰性。陽(yáng)性細(xì)胞分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞率≤10%為1分，11%～50%為2分，＞50%為3分。染色強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積＞3分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)[9-10]。

1.3.2 Western blot

適量液氮預(yù)冷無(wú)菌研缽及研磨杵后，取-80℃冰箱凍存的標(biāo)本50 mg迅速放入研缽中，繼續(xù)加適量液氮將組織研磨成細(xì)粉末狀；將組織轉(zhuǎn)入1.5 ml無(wú)菌無(wú)酶的離心管中，按每克組織加10 ml的比例加入RIPA裂解液（含非磷酸化蛋白酶抑制劑），置于冰上裂解 0.5～1 h（期間震蕩 4～6 次，每次 1 min）；4℃下，以12 000 r/min離心20 min，取上清并轉(zhuǎn)入新的無(wú)菌無(wú)酶離心管中（蛋白存在于上清液中）；用BCA定量法測(cè)定蛋白濃度，制備濃度相等的蛋白樣品（100℃水浴鍋加熱10 min使蛋白變性防止降解）；制備12%凝膠，加入制備好的電泳液進(jìn)行電泳，低溫下轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜（0.22 μm）1 h；TBST 洗膜，加入一抗 4℃過(guò)夜，其中LC3-Ⅱ、ATF3、GAPDH 均為 1∶1 000 稀釋；次日室溫復(fù)溫1 h，TBST洗膜3次（10 min/次）；室溫下加入二抗孵育 2 h，TBST洗膜 3次（10 min/次）；配置 ECL顯色液（A液、B液按1∶1比例配置）；使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，檢測(cè)目的蛋白條帶。利用ImageJ軟件檢測(cè)蛋白條帶灰度值并進(jìn)行定量分析，目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量[8,11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。LC3-Ⅱ、ATF3在HCC組織中的表達(dá)和臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；LC3-Ⅱ、ATF3兩者表達(dá)的相關(guān)性分析，采用Pearson相關(guān)分析；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果表明：LC3-Ⅱ主要定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜，染色呈棕黃色；ATF3主要定位于細(xì)胞核，染色呈棕黃色；LC3-Ⅱ、ATF3在HCC組織中低表達(dá)或不表達(dá)。（圖1）

2.2 Western blot結(jié)果

結(jié)果顯示，HCC組織、癌旁組織中均能檢測(cè)到LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)，其在癌旁組織中的表達(dá)均高于HCC組織（圖2）。定量分析結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ、ATF3在癌旁組織中的表達(dá)明顯高于HCC組織，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

2.3 LC3-Ⅱ、ATF3的表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系

HCC組織中LC3-Ⅱ、ATF3的表達(dá)水平不僅與腫瘤分化程度有關(guān)（均P＜0.05），也與是否合并靜脈癌栓有關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、血清AFP、腫瘤直徑、HBsAg等無(wú)明顯相關(guān)性（均P＞0.05）。（表1）

2.4 LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

對(duì)9例新鮮HCC組織中LC3-Ⅱ、ATF3的表達(dá)情況進(jìn)行Western blot定量分析。結(jié)果表明，LC3-Ⅱ、ATF3的表達(dá)在HCC組織中的變化趨勢(shì)一致。Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，在HCC組織中，LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)密切相關(guān)，且為正相關(guān)的趨勢(shì)（r=0.621，P＜0.001）。

圖1 肝細(xì)胞癌組織中LC3-Ⅱ和ATF3蛋白表達(dá)的免疫組化染色圖像

2.5 LC3-Ⅱ和ATF3對(duì)HCC患者生存期的影響

Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ高表達(dá)患者的生存期為（45.57±5.63）月，明顯長(zhǎng)于低表達(dá)者的（36．95±2．69）月，且預(yù)后更好（χ2=4.67，P=0.031）；ATF3高表達(dá)患者的生存期為（47.40±5.72）月，明顯長(zhǎng)于低表達(dá)者的（34．75±2．85）月，且預(yù)后更好（χ2=8．14，P=0.004）；LC3-Ⅱ、ATF3 同時(shí)高表達(dá)患者的生存期為（57．67±5．62）月，明顯長(zhǎng)于其他患者（36.64±2.57）月，且預(yù)后更好（χ2=12.47，P＜0.001）。（圖 4）

圖2 肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中LC3-Ⅱ和ATF3的Western blot結(jié)果

圖3 肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中LC3-Ⅱ和ATF3蛋白相對(duì)表達(dá)量

表1 LC3-Ⅱ、ATF3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

目前，手術(shù)治療仍為治療HCC的第一選擇[12-13]，但臨床上僅有不足30%的原發(fā)性肝癌患者可以接受手術(shù)治療[12]，且手術(shù)整體切除率低、復(fù)發(fā)率高[14]，導(dǎo)致HCC的預(yù)后很不理想[15-17]。有條件的患者可以選擇進(jìn)行肝移植，不能手術(shù)的早期患者也可以選擇放療、化療、介入治療和靶向治療[18-21]。目前，HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制仍不明晰，極大地限制了HCC的治療。因此，探索HCC發(fā)生發(fā)展所涉及的分子機(jī)制，對(duì)于改善HCC的治療有重要意義，同時(shí)也可為HCC的生物學(xué)預(yù)防提供依據(jù)。

圖4 肝細(xì)胞癌患者的Kaplan-Meier生存曲線與LC3-Ⅱ和ATF3表達(dá)的關(guān)系

本研究中，使用Western blot和免疫組化方法檢測(cè)9例新鮮的HCC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織，以及82例HCC和對(duì)應(yīng)的癌旁組織蠟塊標(biāo)本中的LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中的表達(dá)顯表達(dá)顯著低于癌旁組織。進(jìn)一步分析LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)與HCC患者臨床特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)與腫瘤分化程度、靜脈侵襲情況密切相關(guān)（均P＜0.05）。通過(guò)對(duì)HCC患者的隨訪資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)水平與HCC患者的預(yù)后密切相關(guān)。因此，可以認(rèn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ和ATF3聯(lián)合檢測(cè)可作為HCC惡性程度評(píng)估的重要指標(biāo)，且有助于判斷HCC患者的預(yù)后；LC3-Ⅱ和ATF3有望成為HCC治療的重要靶點(diǎn)。

本研究的結(jié)果提示，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。LC3-Ⅱ是公認(rèn)的反映細(xì)胞自噬水平的標(biāo)志物[22-23]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自噬所發(fā)揮的作用是雙向性的，一方面，通過(guò)過(guò)度激活自噬死亡途徑的方式，自噬可以清理掉一部分已經(jīng)產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞；另一方面，腫瘤細(xì)胞在面對(duì)嚴(yán)苛的外部環(huán)境時(shí)，如缺血、缺氧、代謝障礙、營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子匱乏、抗腫瘤治療等，可以通過(guò)激活自噬獲得能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持自身的生存，并減少細(xì)胞的凋亡，提高其抗應(yīng)激能力[24-27]。在癌癥的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，自噬發(fā)揮著舉足輕重的作用，隨著細(xì)胞外環(huán)境的變化，自噬在腫瘤發(fā)生過(guò)程中所發(fā)揮的作用也不斷變化[28-30]。ATF3屬于應(yīng)激相關(guān)基因，在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下，ATF3的表達(dá)處于低表達(dá)的穩(wěn)態(tài)，但當(dāng)出現(xiàn)應(yīng)激信號(hào)時(shí)，ATF3基因可迅速作出反應(yīng)，并通過(guò)多種途徑促進(jìn)ATF3表達(dá)。有研究結(jié)果顯示，高表達(dá)的ATF3可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞存活[31]。然而，也有體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高表達(dá)的ATF3能夠顯著抑制食管癌細(xì)胞的增殖，即當(dāng)ATF3處于高水平表達(dá)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的成瘤能力受到了明顯的抑制[32]。這些研究結(jié)果均提示LC3-Ⅱ和ATF3在HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，進(jìn)而影響HCC進(jìn)展。

LC3-Ⅱ和ATF3在其他惡性腫瘤中已經(jīng)被廣泛研究。有研究者對(duì)Salinomycin誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Salinomycin誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的關(guān)鍵在于抑制ATF4-DDIT3/CHOP-TRIB3-AKT1-MTOR通路，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在其中扮演了負(fù)性調(diào)節(jié)因子的角色[33-34]。在前列腺癌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中，ATF4/ATF3/CHOP軸參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[35-37]，此外在前列腺癌中，ATF4-DDIT3/CHOP-TRIB3-AKT1-MTOR通路也參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的自噬，兩條通路具有共同的下游因子CHOP。該結(jié)果再次提示LC3-Ⅱ和ATF3在調(diào)控腫瘤進(jìn)展的過(guò)程中關(guān)系密切。

本研究結(jié)果表明，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中呈低表達(dá)狀態(tài)；LC3-Ⅱ和ATF3的表達(dá)與HCC組織的分化程度及靜脈侵襲密切相關(guān)（均P＜0.05），而與年齡、性別、血清AFP、腫瘤直徑、HBsAg等無(wú)明顯相關(guān)性（均P＞0.05）；LC3-Ⅱ和ATF3高表達(dá)的患者生存率明顯高于低表達(dá)者（P＜0.05）。此外，LC3-Ⅱ和ATF3在HCC組織中的表達(dá)正相關(guān)，提示兩者在HCC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著相輔相成的作用。當(dāng)然，該結(jié)果需要一系列的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，LC3-Ⅱ和ATF3很可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的協(xié)同作用，有望成為評(píng)估HCC惡性程度及預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的重要指標(biāo)，并有望成為HCC的潛在治療靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突