張金明 劉寶會(huì) 歐陽(yáng)昭廣 賈智 劉大勇

天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院300070

0 引 言

牙周炎是常見(jiàn)的慢性口腔疾病，是累及牙周支持組織的感染性疾病[1]。由細(xì)菌侵入造成的牙周組織損傷是造成牙齦萎縮、牙齒松動(dòng)甚至脫落的主要原因，不僅影響患者的咀嚼、發(fā)音等生理功能，同時(shí)也對(duì)患者心理也產(chǎn)生不良影響[2]。傳統(tǒng)牙周治療僅能在短期內(nèi)終止牙周炎的進(jìn)一步發(fā)展，不能使被破壞的牙周組織完全恢復(fù)，如不定期進(jìn)行牙周維護(hù)，牙周炎仍會(huì)復(fù)發(fā)[3-4]。因此，在牙周治療的基礎(chǔ)上，使用其他輔助療法，如局部藥物治療等，對(duì)牙周炎患者進(jìn)行牙周維護(hù)，抑制細(xì)菌增殖，甚至促進(jìn)牙周組織再生，成為亟待解決的問(wèn)題。

在牙周炎的藥物治療方法中，最安全且有效的方法是口腔局部緩釋給藥，其不僅能提升機(jī)體的藥物利用度，減少全身用藥帶來(lái)的副反應(yīng)，而且有助于長(zhǎng)期維持血藥濃度，降低用藥量，提升患者的依從性[5-7]。由于口腔的特殊解剖結(jié)構(gòu)、生態(tài)與生理特點(diǎn)，傳統(tǒng)的口服給藥或凝膠藥物的局部涂抹給藥均存在局限性，導(dǎo)致療效較差[8-9]。為了優(yōu)化局部給藥方式，針對(duì)藥物載體的生物材料緩釋體系在口腔疾病治療中的應(yīng)用得到了廣泛的研究[10]。

緩釋系統(tǒng)(sustained release system，SRS)是控制藥物在體內(nèi)釋放的一種材料，亦可稱長(zhǎng)效制劑或延效制劑，能通過(guò)適宜的方法延緩藥物在體內(nèi)的釋放。SRS具有能調(diào)控藥物的釋放速率，長(zhǎng)期維持有效的血藥濃度；減少藥物浪費(fèi)及破壞；掩蓋藥物的不良?xì)馕叮粶p少藥物對(duì)機(jī)體組織刺激等諸多優(yōu)點(diǎn)。大量的基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（D，L-lactic acid-co-glycolic acid）]，PLGA]載 藥微球是一種理想的SRS，其具有良好的生物相容性、可控的降解速率、便于工業(yè)化制備等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛研究和應(yīng)用[11-12]。

辛伐他?。╯imvastatin，SIM）可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）基因的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，有利于骨組織的礦化[13-16]。納米銀粒子（Ag nanoparticles，AgNPs）由于其較強(qiáng)的抗菌能力，作為一種無(wú)機(jī)抗感染材料已受到廣泛的關(guān)注和研究[17]。與抗生素不同，AgNPs的應(yīng)用不會(huì)造成細(xì)菌耐藥性，可有效避免抗生素的濫用[18]。此外，通過(guò)絲素蛋白(silk fibroin，SF)改性的載SIM的PLGA微球有較好的釋放模式，其釋放速率更低，釋放曲線更為平緩[19]。因此，如能將SIM和AgNPs負(fù)載于PLGA微球內(nèi)，并通過(guò)SF進(jìn)行改性，從而制備出具有一定緩釋效果的牙周炎輔助治療聯(lián)合載藥SRS，有望在一定程度上抑制牙周細(xì)菌增殖，同時(shí)實(shí)現(xiàn)牙槽骨的修復(fù)再生。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

SF（北京圣諾泰德醫(yī)療科技有限公司公司），PLGA（美國(guó) Sigma公司），聚乙烯醇（聚合度 500，水解度88%，中國(guó)石化集團(tuán)四川維尼綸廠），SIM（江西大帝制藥有限公司），殼聚糖(chitosan，CTS)（浙江金殼藥業(yè)有限公司），AgNPs（長(zhǎng)沙巴溪儀器有限公司），溴化鉀（KBr）（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（索萊寶生物科技有限公司），透析袋（天津晟佰昊生物技術(shù)有限公司）。

5810R型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），F(xiàn)D-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DelsaNano型固體表面ZETA電位分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司），Gemini 300掃描電子顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備載SIM的PLGA微球

所使用的PLGA中，按分子質(zhì)量統(tǒng)計(jì)的平均分子質(zhì)量（重均分子質(zhì)量）為10 000，DL-LA（D,L-lactic acid）與 GA（glycolic acid）的比例為 50∶50。采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備SRS。分別稱取100 mg PLGA與 5、10、15、20 mg SIM 共同溶于 10 ml的二氯甲烷；滴入50 ml體積分?jǐn)?shù)為1%的聚乙烯醇溶液，800 r/min槳式攪拌2 h；在室溫下待二氯甲烷完全揮發(fā)，8 000 r/min離心10 min，棄上清；去離子洗滌，并超聲重分散，重復(fù)3次后，將樣品冷凍干燥，并于-40℃下避光保存，從而得到具有不同SIM和PLGA質(zhì)量比的載SIM的PLGA微球（SIM-PLGA微球）。

1.2.2 SF修飾的SIM-PLGA微球制備

稱取10 mg SIM-PLGA微球（質(zhì)量比1∶10）混于10 ml SF 溶液（1 mg/ml）中混懸 1 h，8 000 r/min下離心10 min，水洗3次；用10 ml體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛溶液交聯(lián)1 h，8 000 r/m下離心10 min，水洗3次；加入10 ml硼氫化鈉溶液（30 mmol/L）終止交聯(lián)反應(yīng)；30 min后，8 000 r/min離心10 min，水洗3次；將樣品凍干，于-40℃下避光保存，從而得到SF修飾的SIM-PLGA微球（SF-SIM-PLGA微球）。

1.2.3 CTS吸附的SF-SIM-PLGA微球制備

取10 ml CTS乙酸水溶液（0.1 mg/ml）與10 mg SF-SIM-PLGA微球混懸30 min；8 000 r/min離心10 min，水洗3次；用10 ml體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛溶液交聯(lián)1 h；8 000 r/min離心10 min，水洗3次；加入10 ml硼氫化鈉溶液（30 mmol/L）終止交聯(lián)反應(yīng)；30 min后，8 000 r/min離心10 min，水洗3次；將樣品冷凍干燥，并于-40℃下避光保存，從而得到CTS吸附的SF-SIM-PLGA微球（CTS-SF-SIM-PLGA微球）。

1.2.4 AgNPs雜化的CTS-SF-SIM-PLGA微球制備

重新按照1.2.3節(jié)中的步驟，將1 ml AgNPs水溶液（0.1 mg/ml）處理 CTS-SF-SIM-PLGA 微球，使AgNPs吸附于微球表面；將樣品冷凍干燥，并于-40℃下避光保存，得到AgNPs雜化的CTS-SF-SIMPLGA微球（AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球）。

1.2.5 SF修飾的AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球制備

將10 mg AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球與10 ml絲素蛋白溶液（1 mg/ml）混懸 2 h；8 000 r/min 離心10 min，水洗；用10 ml體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛溶液交聯(lián)1 h；加入10 ml硼氫化鈉溶液（30 mmol/L）終止交聯(lián)反應(yīng)；30 min后，8000 r/min離心10 min，水洗3次；將樣品冷凍干燥，并于-40℃下避光保存，得到SF修飾的AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球（SFAgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球）。

1.2.6 載藥微球的形態(tài)觀察

將凍干的微球粉末分散在去離子水中制成混懸液，然后滴落至預(yù)先處理過(guò)的硅片上自然晾干，噴金后于掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）下觀察，并分析能量色散X射線譜（energy dispersive spectroscopy，EDS）。

1.2.7 Zeta電位的測(cè)定

稱取10 mg各載藥微球，制備載藥微球分散液各1 ml，稀釋40倍后，放入Zeta電位測(cè)試儀中，測(cè)量3次。將結(jié)果取平均值，制作Zeta電位圖。

1.2.8 傅里葉變換紅外光譜表征

稱取適量?jī)龈傻?SIM、SF、PLGA微球、SIMPLGA微球，SF-SIM-PLGA微球，分別與200 mg KBr粉末混合壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定各樣品的紅外光譜圖。

圖1 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球掃描電鏡圖像與微球直徑分布

1.2.9 載藥微球的體外釋放

精密稱量4 mg的SIM-PLGA微球，置于經(jīng)超純水浸泡煮沸處理過(guò)的透析袋中，將透析袋兩端扎緊；將透析袋懸置于盛有40 ml無(wú)水乙醇/PBS（體積比 1∶4）的緩釋液中（pH 6.8）；于 37℃下 100 r/min恒速振蕩，并分別于 0.5、1、2、4、8、12、24 h 和 3、5、7、10、14 d時(shí)，取樣4 ml；取樣時(shí)立即補(bǔ)加相同量的釋放介質(zhì)，并在波長(zhǎng)238 nm處測(cè)定試樣的紫外吸光度，計(jì)算累積釋放量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，微球直徑數(shù)據(jù)取3次測(cè)量的平均值，表面Zeta電位數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 SIM-PLGA載藥微球的表面形貌

采用單一乳化溶劑揮發(fā)法成功制備出PLGA微球。如圖1A所示，所制備的PLGA微球呈直徑大小不一的球形，表面上有凹坑。使用Nano Measure軟件對(duì)SEM圖像中的微球直徑進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表明，PLGA 微球直徑在 4.2～16.4 μm，平均直徑為9.7 μm，絕大多數(shù) PLGA 微球的直徑在 6.6～13.1 μm，如圖1B所示。

具有不同SIM和PLGA質(zhì)量比的SIM-PLGA微球的SIM圖像如圖2所示?；赟EM圖像的微球直徑測(cè)量結(jié)果表明，不同SIM-PLGA微球的直徑范圍為6.8～10.7 μm。所有SIM-PLGA微球外形均呈規(guī)則的球形，且大小不一。當(dāng)SIM和PLGA的質(zhì)量比為5∶100時(shí)，微球表面較為光滑，部分微球表面分布有凹坑（圖2A）；當(dāng)SIM和PLGA的質(zhì)量比為10∶100時(shí)，所有微球表面均勻分布有細(xì)小凹痕，使微球表面顯示出較粗糙的形貌，部分微球表面分布有淺凹坑（圖2B）；當(dāng)SIM和PLGA的質(zhì)量比為 15∶100時(shí)，大多數(shù)微球表面分布有凹坑，微球表面形貌與質(zhì)量比為 5∶100時(shí)較相似（圖 2C）；當(dāng) SIM 和 PLGA的質(zhì)量比為20∶100時(shí)，所有微球表面均有緊密分布的凹坑，同時(shí)在微球表面可見(jiàn)大量SIM的晶體沉積（圖2D）。

上述結(jié)果表明，隨著SIM質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，SIM-PLGA微球的形狀未出現(xiàn)明顯的改變，均呈規(guī)則的球形，且其表面呈凹坑狀外觀。綜合考慮微球的直徑分布和微球表面形貌，選取SIM和PLGA質(zhì)量比為10∶100的SIM-PLGA微球進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 具有不同載辛伐他?。⊿IM）與聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）質(zhì)量比的載藥微球的掃描電鏡圖像

圖3 表面改性后的的載辛伐他汀（SIM）的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球的掃描電鏡圖像

2.2 表面修飾后的SIM-PLGA載藥微球的表面形貌

CTS-SF-SIM-PLGA和AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球的SEM圖像如圖3所示。可見(jiàn)，通過(guò)AgNPs雜化處理后，CTS-SF-SIM-PLGA微球的表面凹坑數(shù)量較少，且微球表面更粗糙。

2.3 SIM-PLGA載藥微球的傅里葉變換紅外光譜

圖4中顯示了SIM、PLGA微球、SIM-PLGA微球、SF、SF-SIM-PLGA微球的傅里葉變換紅外光譜。結(jié)果顯示，SF-SIM-PLGA微球在1 626 cm-1處出現(xiàn)峰值，其由絲素酰胺Ⅰ區(qū)的振動(dòng)模式引起的，表明SF成功地對(duì)SIM-PLGA微球進(jìn)行了修飾。

圖4 載藥微球與其成分的傅里葉變換紅外光譜

2.4 EDS分析結(jié)果

各種PLGA載藥微球的能譜分析結(jié)果如圖5所示，其中SIM-PLGA微球的EDS譜線中可觀察到氮元素（N）峰，CTS-SF-SIM-PLGA微球的EDS譜線中可觀察到鈉元素（Na）峰（圖5C），AgNPs-CTS-SFSIM-PLGA微球的譜線中可觀察到Ag峰（圖5D）。EDS結(jié)果表明，SF、CTS和AgNPs納米銀已成功吸附在SIM-PLGA微球表面。

圖5 載藥微球的能譜分析圖

2.5 載藥微球表面Zeta電位

結(jié)果顯示，SIM-PLGA微球的表面Zeta電位為（-30.3±1.31）mV；在 SF 表面改性后，SF-SIM-PLGA微球的表面電位Zeta電位為（-23.1±0.69）mV，仍為穩(wěn)定狀態(tài)；而繼續(xù)經(jīng)CTS修飾后，CTS-SF-SIM-PLGA微球的表面Zeta電位為（+12.62±2.52）mV，轉(zhuǎn)變?yōu)檎娗逸^為穩(wěn)定；再通過(guò)AgNPs雜化后，AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球的表面Zeta電位為（-23.03±0.65）mV，說(shuō)明AgNPs已成功負(fù)載于微球表面；最后再次通過(guò)SF絲素蛋白改性后，SF-AgNPs-CTS-SF-SIMPLGA 微球的表面 Zeta電位為（-25.4±0.70）mV，表明整個(gè)體系處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)。（圖6）

2.6 載藥微球的體外釋放

SF-AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球和SF-SIMPLGA微球的體外釋放曲線如圖7所示。結(jié)果表明，SF-SIM-PLGA微球的初始釋放率為31.26%，其12 h內(nèi)SIM的累計(jì)釋放量為40.96%，并于24 h達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，此時(shí)的累計(jì)釋放量為44.75%；SF-AgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球的初始釋放率為23.68%，其12 h內(nèi)SIM的累計(jì)釋放量為28.45%，并于24 h達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，此時(shí)的累計(jì)釋放量為30.76%。由此可知，采用無(wú)機(jī)雜化材料修飾的載藥微球具有更好的緩釋特性。

3 討論與結(jié)論

生物材料表面改性可從3個(gè)方面進(jìn)行，即表面形貌改善、生物學(xué)性質(zhì)改善、化學(xué)修飾[20-21]。因此，本研究中從不同角度對(duì)SIM-PLGA微球進(jìn)行表面改性，并研究其性能。EDS結(jié)果表明，SF、CTS和AgNPs可成功吸附在SIM-PLGA微球表面。表面Zeta電位結(jié)果表明，修飾后的SRS處于穩(wěn)定的狀態(tài)。在本研究中，CTS與AgNPs通過(guò)正負(fù)電吸附作用相結(jié)合，修飾了經(jīng)SF包覆的SIM-PLGA微球。CTS具有優(yōu)異的生物相容性、抗菌性和促進(jìn)創(chuàng)口愈合的性能，是一種最理想的抗菌材料[22-23]。AgNPs有良好的抗菌效果，且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，作為替代抗生素的新型抗菌劑已在口腔疾病治療中得到廣泛研究[24-25]。將生物相容性極佳的CTS與抗菌性能極強(qiáng)的AgNPs相復(fù)合，有望制得兼具強(qiáng)效抗菌與低生物毒性的新材料。

載藥微球的體外釋放結(jié)果表明，SF-AgNPs-CTSSF-SIM-PLGA微球和SF-SIM-PLGA微球的初始釋放速率均較快，且未發(fā)現(xiàn)明顯的突釋現(xiàn)象，在釋放初期其釋放的藥物主要為包載于PLGA微球表面凹坑內(nèi)的SIM。此外，由于釋放介質(zhì)中乙醇的存在，其會(huì)產(chǎn)生PLGA微球溶脹作用，也可能使載藥微球的初始釋放速率較快[26-28]。此后，載藥微球內(nèi)部藥物的釋放速率隨PLGA微球的不斷降解得到緩慢釋放，并逐漸達(dá)到平穩(wěn)釋放狀態(tài)，此時(shí)降解產(chǎn)物乙酸會(huì)逐漸增加，體系中的pH值逐漸降低[29]，離子數(shù)量增加，而離子能催化PLGA的降解。隨著PLGA降解的不斷進(jìn)行，其也在進(jìn)行自催化降解[30]。此外，SFAgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球的緩釋效果明顯優(yōu)于未經(jīng)無(wú)機(jī)材料雜化的SF-SIM-PLGA微球，原因是SIM-PLGA微球經(jīng)包覆后，SIM釋放到外界只需要通過(guò)絲素蛋白形成的孔隙，而AgNPs雜化并用SF修飾后，SIM 釋放則需要經(jīng)過(guò) SF、CTS、AgNPs，以及最外層的SF，因此釋放速率相對(duì)較慢。

在疾病治療過(guò)程中，采用局部緩釋給藥系統(tǒng)，可以長(zhǎng)期保持藥物的有效濃度，從而提高臨床治療水平。與傳統(tǒng)給藥方式相比，SRS具有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，如長(zhǎng)時(shí)間保持血藥濃度、提高藥物的生物利用度、有效避免藥物的副反應(yīng)等[31]。近年來(lái)，作為一種新型的SRS，各種微球被廣泛研究[32]。其中，PLGA屬于合成高分子材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性，在緩釋藥物載體方面有著非常廣泛的應(yīng)用前景[33]。SF是一種天然高分子蛋白[34]，具有良好的生物相容性、生物可降解性，且無(wú)毒性作用。SF表面有負(fù)電荷，并含有精氨酸、甘氨酸和天門冬氨酸組成的RGD序列，可以相互識(shí)別細(xì)胞膜上的受體整合素，這種特殊的相互作用有利于細(xì)胞的黏附和增殖[35]。PLGA與SF相結(jié)合有利于SRS發(fā)揮作用。

圖6 載藥緩釋材料表面Zeta電位圖

圖7 載藥微球的辛伐他汀體外釋放曲線

針對(duì)口腔內(nèi)特殊的解剖結(jié)構(gòu)和微生物環(huán)境，可通過(guò)正負(fù)電吸附結(jié)合CTS與AgNPs并且修飾用SF進(jìn)行表面改性處理的SIM-PLGA微球[36-37]。其中，CTS與AgNPs可使載藥微球具有廣譜抗菌特性。因此，AgNPs雜化的SIM-PLGA微球可同時(shí)發(fā)揮抑菌與成骨效應(yīng)[38]。

本研究中采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備SIM-PLGA微球，并依次通過(guò)SF及CTS對(duì)其表面進(jìn)行改性，之后通過(guò)靜電吸附將AgNPs加載到載藥微球表面，最終使用SF在微球最外層進(jìn)行修飾及包裹，獲得SFAgNPs-CTS-SF-SIM-PLGA微球。該微球具有抑菌與成骨作用，且表現(xiàn)出較好的體外釋放效果，可應(yīng)用于口腔內(nèi)的局部緩釋給藥，在牙周炎治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突