儲(chǔ)健　賈添元　拱忠影　董晨影　周大煒

摘 要 大腸桿菌O抗原寡糖單位生物合成路徑的研究對(duì)于闡明特異性O(shè)抗原在細(xì)菌生長(zhǎng)和致病中所發(fā)揮的作用具有重要意義。本研究利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)研究了大腸桿菌O77 O抗原寡糖單位的生物合成路徑，考察了兩個(gè)甘露糖糖基轉(zhuǎn)移酶（WbaD 和WbaC）在大腸桿菌O77 O抗原寡糖單位生物合成過(guò)程中的作用，建立了高效、靈敏的細(xì)菌 O抗原寡糖重復(fù)單位生物合成路徑初步表征方法。首先采用MALDI-TOF MS技術(shù)，在負(fù)離子模式下，監(jiān)測(cè)WbaD 和WbaC酶促反應(yīng)產(chǎn)物-脂寡糖形成，初步探索了WbaD 和WbaC的作用方式，應(yīng)用碰撞誘導(dǎo)解離 （CID）技術(shù)對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物-脂寡糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步表征。結(jié)果表明，WbaD 和WbaC是O77 O-寡糖重復(fù)單位合成所需的僅有的兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，WbaD與O77的O抗原中d-Man-d-GlcNAc糖鍵的形成相關(guān)，WbaC與O77的O抗原中其余兩個(gè)d-Man-d-Man糖鍵的形成相關(guān); WbaD 和WbaC之間同時(shí)存在協(xié)同合作和交替作用方式。本研究建立的細(xì)菌 O抗原寡糖重復(fù)單位生物合成路徑高效表征方法為深入探索細(xì)菌O抗原生物合成機(jī)制和應(yīng)用生物工程技術(shù)大規(guī)模合成功能性糖鏈奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 O抗原寡糖重復(fù)單位; 酯寡糖; 生物合成路徑; 基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜

1 引 言

某些致病菌株可以引起人、畜、禽、獸共患的傳染性疾病，在人群密集和衛(wèi)生條件較差的區(qū)域爆發(fā)的潛在可能性較大， 特別是近年來(lái)，耐多藥和廣泛耐藥菌株的出現(xiàn)，迫切需要尋找新藥物及藥物作用靶點(diǎn)。O抗原是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁最外層的主要成分，由寡糖重復(fù)單位組成（幾個(gè)到幾十個(gè)），構(gòu)成O-寡糖抗原決定簇，是動(dòng)物免疫系統(tǒng)對(duì)入侵的革蘭氏陰性菌首先識(shí)別及攻擊的目標(biāo)，在致病性細(xì)菌侵染宿主細(xì)胞過(guò)程中起重要作用[1]。在細(xì)菌的感染過(guò)程中，體液和細(xì)胞的免疫應(yīng)答通常由特異性O(shè)-寡糖抗原決定簇決定，從而可確定細(xì)菌再次感染時(shí)機(jī)體可產(chǎn)生的免疫反應(yīng)[2]。

大腸桿菌細(xì)菌表面O抗原寡糖單位的生物合成中，糖基轉(zhuǎn)移酶將高能核苷二磷酸單糖供體中的單糖轉(zhuǎn)移到延伸中的寡糖單位上。確定糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特定功能是準(zhǔn)確表征O抗原寡糖重復(fù)單位生物合成路徑的關(guān)鍵。近期的研究表明，細(xì)菌糖蛋白多糖部分的變化與細(xì)菌感染緊密相關(guān)，其生物合成路徑涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶與細(xì)菌表面O抗原寡糖單位密切相關(guān)[3]。表征糖基轉(zhuǎn)移酶基因特定功能的常規(guī)方法是：首先在大腸桿菌中表達(dá)假定的糖基轉(zhuǎn)移酶基因克隆產(chǎn)物，隨后將表達(dá)產(chǎn)物、受體底物（脂載體）和供體底物（NDP-糖）孵育，應(yīng)用液相色譜監(jiān)測(cè)酶活性并純化制備酶促反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用一維和二維核磁共振（NMR）技術(shù)鑒定糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特定功能[4]。然而，常規(guī)方法樣品需要量大，并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程繁瑣。

基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)可提供更靈敏、精準(zhǔn)和高重現(xiàn)性的結(jié)構(gòu)信息，為高通量快速檢測(cè)糖復(fù)合物提供了技術(shù)平臺(tái)[5～10]。近年來(lái)，碰撞誘導(dǎo)解離（CID）MALDI-TOF MS技術(shù)不斷發(fā)展和完善，如通過(guò)應(yīng)用特異性糖苷外切酶[11]、新型基質(zhì)的研發(fā)[12，13]、定性數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善[14]以及離子淌度[15]和糖芯片[16，17]的應(yīng)用等，進(jìn)一步拓寬了研究領(lǐng)域，并獲得了盡可能多的糖復(fù)合物定性信息。

在破譯腸出血性大腸桿菌（EHEC）O77的O抗原基因簇序列基礎(chǔ)上，結(jié)合O抗原寡糖重復(fù)單位的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)搜索序列的同源性，本研究組在前期工作中推測(cè)出O77 O抗原寡糖重復(fù)單位生物合成途徑涉及β-1，3-甘露糖糖基轉(zhuǎn)移酶（WbaD）和α-1，2-α-1，2-甘露糖糖基轉(zhuǎn)移酶（WbaC）（見(jiàn)圖1）。在此基礎(chǔ)上，利用電噴霧碰撞誘導(dǎo)解離串聯(lián)質(zhì)譜（CID-ESI-MSn）技術(shù)[18]研究了上述兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的功能。本研究以WbaD和WbaC為研究對(duì)象，利用MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)證明了各自酶促反應(yīng)產(chǎn)物的形成，進(jìn)一步應(yīng)用高能CID-MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對(duì)相應(yīng)酶促反應(yīng)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步表征，在此基礎(chǔ)上，建立了新的高效、靈敏的細(xì)菌 O抗原寡糖重復(fù)單位生物合成路徑的初步表征方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

4700 Applied Biosystems基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)ABI公司）。甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司）; α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，美國(guó)Fluka公司）; 2-嗎啉乙磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid， MES）、GDP-Man（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）; 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。 大腸桿菌O77 O抗原中wbaD 基因和wbaC基因的克隆、含相應(yīng)重組質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)及酶促反應(yīng)細(xì)胞膜提取物的制備的方法均參照文獻(xiàn)[18]。由于WbaD和WbaC與細(xì)胞膜之間存在相互作用，本研究利用含wbaD或wbaC基因的重組質(zhì)粒細(xì)胞膜部分作為酶的來(lái)源，進(jìn)行酶促反應(yīng)。

2.2 酶活性測(cè)定反應(yīng)體系

2.2.1 單酶酶促反應(yīng)體系 1 mmol/L 受體GlcNAc-PP-PhU（或WbaD 酶促反應(yīng)產(chǎn)物，空白對(duì)照以水替代）， 75 mmol/L MES 緩沖液（pH 6.5）， 5 mmol/L MnCl2， 5 mmol/L GDP-Man和10μL 細(xì)菌膜提取物（1～12μg，陰性對(duì)照分別以大腸桿菌DH5α和 BL21代替細(xì)菌膜提取物）。37℃水浴中反應(yīng)30 min后，沸水浴中加熱3 min，離心（12000 r/min，5 min）。取0.3μL稀釋200倍，取上清待測(cè)液與等體積基質(zhì)，滴于樣品探頭靶心，室溫干燥結(jié)晶后，直接分析測(cè)試。

2.2.2 雙酶（WbaD 和WbaC）偶聯(lián)酶促反應(yīng)體系 含1 mmol/L 受體GlcNAc-PP-PhU（空白對(duì)照以水替代）、 5 mmol/L MnCl2、 75 mmol/L MES緩沖液（pH 6.5）， 5 mmol/L GDP-Man和10μL 細(xì)菌膜（WbaD 和WbaC）提取物（1～24μg，分別以大腸桿菌DH5α和 BL21代替細(xì)菌膜提取物為陰性對(duì)照）。37℃水浴反應(yīng)一定時(shí)間后，沸水浴中加熱3 min，離心（12000 r/min，5 min）。取0.3μL稀釋200倍后，取上清待測(cè)液與等體積基質(zhì)，滴于樣品探頭靶心，室溫干燥結(jié)晶后，直接分析測(cè)試。

2.3 MALDI-TOF MS條件

Nd：YAG激光器， 波長(zhǎng)355 nm， 基質(zhì)為α-CHCA，反射模式，負(fù)離子譜檢測(cè)。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中，碰撞小室內(nèi)碰撞氣體為空氣， 其壓力3.33×104 Pa， 碰撞能量1 kV。為方便質(zhì)譜解析，本研究將預(yù)期的酶促反應(yīng)產(chǎn)物苯氧基十一烷基二磷酸二和四糖視為五和七糖（寡糖），苯氧基十一烷基和二磷酸基相應(yīng)地分別代表一個(gè)和兩個(gè)糖環(huán)。所有碎片應(yīng)用Domon-Costello命名法識(shí)別[19]。

3 結(jié)果與討論

3.1 WbaD和WbaC酶活性的質(zhì)譜監(jiān)測(cè)

在負(fù)離子模式下，WbaD 酶促反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析結(jié)果見(jiàn)圖2C，豐度最高的準(zhǔn)分子離子峰 m/z 789.2134 [M-H]與Man-GlcNAc-PP-PhU（苯氧基十一烷焦磷酸化二糖）的分子量相對(duì)應(yīng)， 表明WbaD具有明顯的甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性; WbaC酶促反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOF MS分析結(jié)果見(jiàn)圖2D，豐度最強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰 m/z 1113.5176 [M-H]與Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU的分子量相對(duì)應(yīng)， 表明WbaD 酶促反應(yīng)產(chǎn)物在WbaC催化下，甘露糖基被連續(xù)轉(zhuǎn)移到Man-GlcNAc-PP-PhU受體上，最終生成Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU。以大腸桿菌BL21（不含質(zhì)粒）的細(xì)胞膜作為酶促反應(yīng)的負(fù)對(duì)照，以水代替給予體底物進(jìn)行酶促反應(yīng)的空白對(duì)照，均未檢測(cè)到相應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性（圖2A和2B）。

3.2 WbaD 酶活性的初步表征

在負(fù)離子模式下，WbaD產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。以m/z 789.4332 [M-H]為前驅(qū)離子（圖3）， 觀察到4個(gè)源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子，分別為m/z 444.5749 [M-H- P-PhU]、m/z 524.6265 [M-H-PhU]、m/z 462.6034 [C3]和m/z 405.5491 [M-Man-H2O-GlcNAc-H]。源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子有m/z 241.2966 [M-H-P-PhU-Man-Ac]和m/z 423.5699 [M-H-Man-GlcNAc]。 m/z 79.1739 [PO3]和m/z 159.0979 [HPO3PO3]源于磷酸二脂鍵部分兩個(gè)鍵的同時(shí)碎裂;? m/z 691.1074[M-H3PO4-H]源于m/z 789.4332 脫掉1個(gè)H3PO4分子。未發(fā)現(xiàn)涉及開(kāi)環(huán)的產(chǎn)物離子。

對(duì)于WbaD產(chǎn)物， MS2 譜圖（圖3） 中特征碎片離子m/z 423和 405分別對(duì)應(yīng)[PP-PhU-H]及該碎片離子失去水分子得到的碎片離子， 與已發(fā)表的PP-PhU 數(shù)據(jù)一致[18，20]， 同時(shí)證明初始受體底物的PP-PhU 基團(tuán)并未受到酶促反應(yīng)的影響; 焦磷酸化二糖部分存在3個(gè)特征碎片離子m/z 444 [M-H-P-PhU]， m/z 524 [M-H-PhU]和m/z 462.6034 [C3]，可以推斷WbaD催化轉(zhuǎn)移一個(gè)甘露糖殘基到GlcNAc-PP-PhU上，形成了Man-GlcNAc-PP-PhU。

3.3 雙功能酶WbaC 酶活性的初步表征

在負(fù)離子模式下，雙功能酶WbaC酶促反應(yīng)中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜如圖4和圖5所示。

以m/z 951.5690 [M-H]為WbaC 酶促反應(yīng)中間產(chǎn)物的前驅(qū)離子， 觀察到4個(gè)源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子（圖3），分別為m/z 606.6842 [M-H-P-PhU]、 m/z 686.7902 [M-H-PhU]、m/z 624.7021 [C3]和m/z 405. 4538 [M-H-Man-GlcNAc-H2O-Man]。源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子有m/z 423.4701 [M-H-Man-GlcNAc-Man]。m/z 79.1707 [PO3]和m/z 159.0580 [HPO3PO3]源于磷酸二脂鍵部分兩個(gè)鍵的同時(shí)碎裂;? m/z 853.1914[M-H3PO4-H]源于m/z 951.5690 脫掉1個(gè) H3PO4分子。未發(fā)現(xiàn)涉及開(kāi)環(huán)的產(chǎn)物離子。

對(duì)于WbaC 酶促反應(yīng)中間產(chǎn)物， 同樣在MS2 譜圖（圖4）中， 特征碎片離子m/z 423和 405分別對(duì)應(yīng)[PP-PhU-H]及此碎片離子失去水分子得到的碎片離子， 與已發(fā)表的PP-PhU 數(shù)據(jù)一致[18，20]， 同時(shí)證明初始受體底物的PP-PhU 基團(tuán)并未受到酶促反應(yīng)的影響; 3個(gè)特征碎片離子m/z 606 [M-H-P-PhU]、 m/z 686 [M-H-PhU]和m/z 624 [C3]的存在，可以推斷WbaC催化轉(zhuǎn)移一個(gè)甘露糖殘基到Man-GlcNAc-PP-PhU上，形成了Man-Man-GlcNAc-PP-PhU。

以m/z 1113.5828 [M-H]為WbaC 酶促反應(yīng)終產(chǎn)物的前驅(qū)離子（圖5）， 觀察到4個(gè)源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產(chǎn)物離子，分別為m/z 768.8329 [M-H-P-PhU]、4 m/z 848.8521 [M-H-PhU]、 m/z 786.8129 [C3]和m/z 405. 4028 [M-H-Man-GlcNAc-H2O-Man-Man]。m/z 423.4065 [M-H-Man-GlcNAc-Man-Man]為源于糖苷鍵斷裂的產(chǎn)物離子。 m/z 79.1664 [PO3]和m/z 159.0576 [HPO3PO3]源于磷酸二脂鍵部分兩個(gè)鍵的同時(shí)碎裂;? m/z 1015.3563 [M-H3PO4-H]來(lái)源于離子m/z 1113.5828 脫掉 1個(gè)H3PO4分子。未發(fā)現(xiàn)涉及開(kāi)環(huán)的產(chǎn)物離子。

對(duì)于WbaC 酶促反應(yīng)終產(chǎn)物， 同樣在MS2 譜圖中（圖5）， 特征碎片離子m/z 423和 405分別對(duì)應(yīng)[PP-PhU-H]及此碎片離子失去水分子得到的碎片離子， 與已發(fā)表的PP-PhU 數(shù)據(jù)一致[18，20]， 同時(shí)證明初始受體底物的PP-PhU 基團(tuán)并未受到酶促反應(yīng)的影響; 3個(gè)特征碎片離子m/z 768 [M-H-P-PhU]、 m/z 848 [M-H-PhU]和m/z 786 [C3]的存在，可以推斷雙酶（WbaD 和WbaC）連續(xù)催化轉(zhuǎn)移3個(gè)甘露糖殘基到 GlcNAc-PP-PhU上，形成了Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU。上述結(jié)果表明，WbaC不僅能添加第二個(gè)甘露糖殘基，而且能添加第三個(gè)甘露糖殘基，具有雙甘露糖糖基轉(zhuǎn)移酶功能。雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶并不多見(jiàn)，到目前為止，得到明確表征的雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶有以相同的或不同的糖苷鍵連接方式催化轉(zhuǎn)移單獨(dú)一種單糖的雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶（如Alg11，GDP-Man）[21]， 也有以相同的或不同的糖苷鍵連接方式催化轉(zhuǎn)移兩種不同單糖的雙功能糖基轉(zhuǎn)移酶（如AtGALS1，UDP-Gal 和UDP-Arap）[22]。

通過(guò)質(zhì)量數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，WbaD（m/z 789.4332）和WbaC（m/z 1113.5828）產(chǎn)物離子的高能CID MALDI-TOF/TOF MS碎片離子都主要源于磷酸二酯鍵部分的斷裂， 提供的脂寡糖骨架信息可證實(shí)新的單糖殘基已經(jīng)成為脂寡糖的一部分。雖然缺少可提供重要的區(qū)域選擇性信息的跨環(huán)斷裂碎片離子和源于寡糖部分糖苷鍵斷裂的Y型離子， 無(wú)法確定脂寡糖中的寡糖序列和新加入單糖殘基與相鄰單糖殘基間糖苷鍵的鏈接方式，但MALDI-TOF-MS技術(shù)能測(cè)定完整的糖鏈分子質(zhì)量， 同時(shí)還可以應(yīng)用CID技術(shù)證明新的單糖殘基被轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的底物脂寡糖，借助已知細(xì)菌表面O抗原寡糖單位生化合成途徑涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶生物信息學(xué)分析結(jié)果，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌表面O抗原寡糖重復(fù)單位生化合成途徑的高通量初步表征。

需要特別指出的是，針對(duì)脂寡糖糖鏈精細(xì)結(jié)構(gòu)的表征，現(xiàn)有軟硬件條件下CID-MALDI-TOF/TOF和CID-ESI-MSn都無(wú)法表征異頭構(gòu)型（SymbolaA@或SymbolbA@）。MALDI和ESI質(zhì)譜在CID 模式下產(chǎn)生的脂寡糖串聯(lián)質(zhì)譜圖均主要表現(xiàn)為源于磷酸二酯鍵部分的斷裂[18， 20]。在涉及脂寡糖中寡糖的連接順序和連接方式的確定時(shí)， CID-ESI-MSn提供的結(jié)構(gòu)信息更細(xì)致（圖6和圖7）。首先， ESI-MS/MS源于糖苷鍵斷裂的Y型離子是對(duì)脂寡糖中的寡糖連接順序進(jìn)行確認(rèn)的重要依據(jù)之一。其次， 對(duì)于糖鏈結(jié)構(gòu)的解析，CID-ESI-MSn 離子阱的多級(jí)質(zhì)譜可提供重要的區(qū)域選擇性信息的跨環(huán)斷裂碎片離子， 確認(rèn)脂寡糖中寡糖的連接方式（圖6和圖7）; 而CID-MALDI-TOF/TOF中呈現(xiàn)出一個(gè)斷層。再次，CID-MALDI-TOF/TOF能耐受較高濃度的鹽、緩沖劑和其它難揮發(fā)成分， 大大地降低了對(duì)樣品預(yù)處理的要求; 樣品用量少，僅需微升級(jí)的樣品溶液; 以單電荷峰為主， 碎片峰少， 有利于對(duì)復(fù)雜混合物的檢測(cè); 由于在靈敏度、分辨率、速度、通量等指標(biāo)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在分析珍稀生物樣品時(shí)非常有力。而CID-ESI-MSn方式進(jìn)行樣品預(yù)處理需嚴(yán)格除鹽，樣品用量為毫升級(jí)， 脂寡糖的跨環(huán)斷裂碎片離子需要三級(jí)及以上質(zhì)譜確定。在硬件條件許可的條件下，兩條路線互補(bǔ)使用，在O-重復(fù)單位生物合成路徑完整表征的研究中十分必要。

3.4 細(xì)菌 O抗原寡糖重復(fù)單位生物合成涉及的全部糖基轉(zhuǎn)移酶作用方式初步探索

高爾基體內(nèi)多糖的合成不僅依賴糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性，還取決于其正確的定位及彼此間的時(shí)空相互作用[23]。文獻(xiàn)報(bào)道的糖基轉(zhuǎn)移酶間相互作用有協(xié)同[24，25]和交替[26，27]兩種方式。借助時(shí)間推移分析[28，29]，初步考察了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用方式。初始受體底物為GlcNAc-PP-PhU，給體底物GDP-Man過(guò)量，WbaD 和WbaC同時(shí)存在條件下，反應(yīng)開(kāi)始10 min（圖8A），同時(shí)出現(xiàn)Man-GlcNAc-PP-PhU（相對(duì)豐度大）和Man-Man-GlcNAc-PP-PhU（相對(duì)豐度?。﹥蓚€(gè)質(zhì)譜峰，表明與WbaD協(xié)同合作，WbaC催化轉(zhuǎn)移了第一個(gè)甘露糖殘基; 隨后，初始受體底物（GlcNAc-PP-PhU）質(zhì)譜峰不斷降低，伴隨著WbaD 產(chǎn)物（Man-GlcNAc-PP-PhU）先后徹底消失，然后出現(xiàn)Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU峰（相對(duì)豐度?。▓D8B），表明WbaC催化轉(zhuǎn)移第二個(gè)甘露糖殘基，與WbaD以交替方式形成重復(fù)單位; 120 min后，隨著Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU峰強(qiáng)度不斷增加，Man-Man-Man-GlcNAc-PP-PhU成為唯一的終產(chǎn)物（圖8C）。

4 結(jié) 論

在負(fù)離子模式下，對(duì)大腸桿菌O77兩個(gè)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶酶促反應(yīng)產(chǎn)物（wbaD基因和wbaC基因編碼的）混合物的MALDI-TOF和CID MALDI-TOF/TOF分析結(jié)果證明WbaD和WbaC涉及脂多糖的合成：WbaD轉(zhuǎn)移Man殘基到GlcNAc， 而WbaC連續(xù)轉(zhuǎn)移兩個(gè)Man殘基到Man。本方法可方便地用于O-抗原合成涉及的其它糖基轉(zhuǎn)移酶的分析。除通用的糖基轉(zhuǎn)移酶（WecA）之外， WbaD 和WbaC是O77 O-重復(fù)單位合成所需的僅有的兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶。為深入考察O抗原寡糖重復(fù)單位的生物合成機(jī)制，本研究初步探索了兩個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的作用方式，發(fā)現(xiàn)協(xié)同合作和交替方式同時(shí)存在。本研究結(jié)果為闡明細(xì)菌O抗原合成機(jī)理，探索O抗原在細(xì)菌生長(zhǎng)和致病中的作用，以及重組疫苗和應(yīng)用生物工程技術(shù)大規(guī)模合成功能性糖鏈提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Characterization of Biosynthetic Pathway of Tetrasaccharide Repeating

Unit of Escherichia Coli O77 O-antigen by Matrix-assisted Laser

Desorption-Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry

CHU Jian1， JIA Tian-Yuan2，3， GONG Zhong-YING4， DONG Chen-Ying 2，3， ZHOU Da-Wei*2，3

1（School of Automation and Electrical Engineering， Tianjin University of Technology and Education， Tianjin 300222， China）

2（TEDA Institute of Biological Sciences and Biotechnology， Nankai University， Tianjin 300457， China）

3（Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology， Ministry of Education， Nankai University， Tianjin 300457， China）

4（Department of Neurology， Tianjin First Center Hospital， Nankai University， Tianjin 300192， China）

Abstract Mass spectrometry is a rapid， sensitive and accurate approach for the direct monitoring of enzyme-catalyzed reaction that does not require chromophore or radiolabeling， and thus provides a viable alternative to existing analytical techniques. Herein， a simple and efficient assay for characterization of E. coli O77 O-unit biosynthetic pathway by using matrix-assisted laser desorption-ionization （MALDI） mass spectrometry with collision-induced dissociation （CID） was demonstrated by WbaD and WbaC （two glycosyltransferases from E. coli O77 O antigen） lipooligosacharide enzymatic products， respectively. The rapid and direct monitoring of the enzymatic reaction was achieved by subjecting a small amount （0.3 μL） of the reaction mixture to MS analysis without chromatographic separation or desalting steps， and subsequent MS-MS analyses of their lipooligosacharide enzymatic products via collision-induced dissociation enabled the structure of the products of enzyme-catalyzed reaction to be determined. The results demonstrated that WbaD catalyzed the transfer of the first Man residue to GlcNAc-PP-PhU and formed Man-GlcNAc-PP-PhU， and WbaC acted actted after WbaD， adding two Man residues to the growing polymer. Furthermore， the model for E. coli O77 O-unit biosynthesis was studied with the help of time-lapse analysis， and it was proposed that WbaC and WbaD acted in both cooperative and alternating fashion to form the repeat unit and WbaC did not act in tandem with WbaD. Collectively， these data demonstrated that a high-energy CID MALDI-TOF/TOF MS-based platform was applicable to the facile characterization of biosynthetic pathways of O-unit and offered significant advantages over current methods in terms of speed， sensitivity， reproducibility， automation and reagent costs， which would open new way for the future mechanistic study of O-unit biosynthesis and exploitation of these fascinating glycocatalysts.

Keywords O-antigen oligosaccharide repeating unit; Lipooligosaccharide; Biosynthetic pathway; Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry

（Received 29 December 2019; accepted 12 June 2020）

This work was supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities， Nankai University （No. 63191133） and the Tianjin Enterprise Science and Technology Commissioner Project （No. 18JCTPJC65600）.

2019-12-29收稿; 2020-06-12接受

本文系中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（No.63191133） 和天津市企業(yè)科技特派員項(xiàng)目（No. 18JCTPJC65600） 資助

* E-mail： daweizhou@nankai.edu.cn