甜茶葉多糖的表征、體外抗氧化活性與體內(nèi)毒性

教小磐,劉 云

（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京市生物加工過程重點實驗室,北京 100029）

多糖通常是由多個單糖分子聚合、脫水形成的一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多羥基聚合物。多糖來源廣泛,根據(jù)來源不同可分為植物多糖、細(xì)菌多糖、真菌多糖和動物多糖。植物多糖普遍存在于自然界中,研究者已從各類植物中提取并分離出不同結(jié)構(gòu)的多糖[1]。近年來,對植物多糖的研究逐漸增多,主要集中在多糖的提取、分離純化、含量測定、結(jié)構(gòu)分析、藥理及生物學(xué)功能等方面。植物多糖研究的深入為活性多糖產(chǎn)品的生產(chǎn)開發(fā)奠定了基礎(chǔ)[2]。

甜茶（Rubus suavissimusS.Lee）,又名甜葉懸鉤子,為薔薇科懸鉤子屬多年生有刺灌木,因其葉片味甜,故稱為甜茶,是廣西、貴州、湖南等地區(qū)長期以來食用的甜味品種茶[3-4]。甜茶中含有茶多酚、黃酮、多糖及糖苷類等多種物質(zhì),杜晉偉[5]從甜茶葉中分離出多種二萜（苷）類化合物和三萜類化合物,其中,甜葉懸鉤子苷具有一定的藥理活性。鮑晨陽[6]對甜茶中甜茶苷、總多酚和總黃酮3 種主要成分的提取純化工藝進(jìn)行了深入研究。吳玉婷[7]初步研究了甜葉懸鉤子多糖的結(jié)構(gòu),揭示了多糖的結(jié)構(gòu)與其生物活性的關(guān)系。關(guān)于甜茶葉的研究主要集中在甜茶苷、多酚等物質(zhì),其多糖組分的研究相對空缺。甜茶作為“茶、糖、藥”的植物來源,具有重要的研究價值。

因此,本實驗提取了甜茶葉中的多糖組分,測定了其總糖含量及單糖組成,并對其體外抗氧化活性及生物體內(nèi)毒性進(jìn)行了相關(guān)研究,以期為甜茶多糖的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜茶葉購于湖南省永州市道縣；葡萄糖（glucose,Glu）、半乳糖（galactose,Gal）、甘露糖（mannose,Man）、阿拉伯糖（arabinose,Ara）、鼠李糖（rhamnose,Rha）、巖藻糖（fucose,Fuc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid,Glu UA）、半乳糖醛酸（galacturonic acid,Gal UA）標(biāo)準(zhǔn)品、三氟乙酸、乙腈（色譜純）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one,PMP） 美國Sigma公司；無水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇、丙酮、乙醚、甲醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-756CRT型紫外-可見分光光度計 上海佑儀儀器儀表有限公司；HH-ZK4型恒溫水浴鍋 北京星德儀器設(shè)備有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；3K15型臺式高速冷凍離心機(jī) 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Alltech Series 1500型高效液相色譜儀美國奧泰公司；VERTEX 70v傅里葉變換紅外光譜儀德國Bruker公司；SZ61體視顯微鏡、E330數(shù)碼單反相機(jī)日本奧林巴斯公司；斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng) 北京愛生公司。

1.3 方法

1.3.1 甜茶中多糖的提取和精制

精密稱取50 g甜茶粉末,乙醇/乙酸乙酯（1∶2,V/V）浸泡過夜脫脂；脫脂后的甜茶粉末以料液比1∶10 用80 ℃熱水浸提3 h,收集提取液,濾渣重復(fù)提取3 次；合并3 次提取液并濃縮；提取液加入4 倍體積的無水乙醇,4 ℃過夜沉淀,5 000 r/min 離心15 min 得沉淀,沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3 次,經(jīng)干燥得粗提物。

粗提物重新溶于水,過濾去雜質(zhì)；用Sevag法[8]（V（氯仿）：V（正丁醇）＝4∶1）脫蛋白,重復(fù)8～10 次,采用紫外分光光度計測定溶液吸光度,直至260～280 nm波長處無明顯吸收峰；透析（截流分子質(zhì)量8 000～12 000 Da）48 h 除去小分子物質(zhì)；采用活性炭脫色工藝[9]對多糖溶液進(jìn)行脫色,脫色溫度為50 ℃；脫色液加入4 倍體積無水乙醇二次沉淀過夜,5 000 r/min 離心15 min得沉淀；沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3 次；最后冷凍干燥,得精提物。

1.3.2 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)及甜茶多糖提取率的測定

總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.2.1 總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取鼠李糖5 mg,溶解后定容至100 mL,即得質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別稀釋至0.04、0.03、0.02、0.01 mg/mL。分別吸取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖溶液2 mL,加入體積分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液1 mL,再加入5 mL 濃硫酸,室溫下顯色30 min,使用紫外-可見分光光度計,測定溶液在490 nm波長處的吸光度,以鼠李糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 甜茶多糖提取率的測定

精密稱取5 mg甜茶多糖樣品溶于100 mL去離子水中,吸取甜茶多糖樣品溶液2 mL,加入體積分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液1 mL,再加入5 mL濃硫酸,室溫下顯色30 min,使用紫外-可見分光光度計測定溶液在490 nm波長處的吸光度,根據(jù)鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和甜茶多糖樣品的吸光度計算出甜茶多糖中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。甜茶多糖提取率按式（1）計算。

1.3.3 單糖組成的分析

單糖組成按照文獻(xiàn)[11-13]進(jìn)行分析。

酸水解[14]：精密稱取甜茶多糖10 mg,溶解于2 mL 2 mol/L的三氟乙酸溶液中,121 ℃水解1 h；50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除酸,加入1 mL超純水,得甜茶多糖水解液。

標(biāo)準(zhǔn)品處理：首先配制各單糖標(biāo)準(zhǔn)品母液,其中甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖的質(zhì)量濃度均為1.25 mg/mL,鼠李糖質(zhì)量濃度為7.0 mg/mL,葡萄糖質(zhì)量濃度為1.75 mg/mL,取各單糖標(biāo)準(zhǔn)品母液0.125 mL,得到混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL待用。

PMP衍生化：分別取1 mL各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液、1 mL混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液與1 mL甜茶多糖水解液,依次加入0.3 mol/L NaOH 500 μL和0.5 mol/L PMP-甲醇溶液500 μL混勻,70 ℃水浴反應(yīng)40 min,冷卻至室溫后加入0.3 mol/L HCl溶液中和,用1 mL CHCl3萃取3 次,分別取上層水相用去離子水定容至10 mL,即得各單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生液、混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生液及衍生化的甜茶多糖水解液,過0.22 μm濾膜,進(jìn)行高效液相色譜檢測。

先將各單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生液分別進(jìn)樣,根據(jù)每種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖來確定每種單糖的出峰時間,再將混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生液進(jìn)樣,得到混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖,根據(jù)各單糖出峰時間、峰面積繪出各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,衍生化的甜茶多糖水解液在相同的色譜條件下進(jìn)行測定,根據(jù)甜茶多糖水解液高效液相色譜圖中各峰的保留時間,利用計算機(jī)積分得到各峰的峰面積,并將峰面積代入各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可得出甜茶葉多糖的單糖組成及物質(zhì)的量比。

儀器條件：色譜柱為COSMOSIL 5C18-MS-II柱（4.6 mm×250 mm）；流動相為0.1 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液-乙腈（83∶17,V/V）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為20 μL；波長為245 nm；時間為60 min。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜的測定

采用KBr壓片法。取100 mg干燥KBr粉末研細(xì),加入甜茶多糖樣品混合研細(xì),壓成透明薄片。采用VERTEX 70v傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測定。

1.3.5 抗氧化能力的測定

1.3.5.1 總還原力的測定

總還原力測定參照文獻(xiàn)[15]。分別取質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖水溶液各1.0 mL,依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%K3Fe(CN)6溶液各1.0 mL,混合液50 ℃水浴反應(yīng)20 min,冷卻后,向混合物中加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液,3 000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液依次加入2.5 mL去離子水、1.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.1% FeCl3溶液。以去離子水為參比,在700 nm波長處測定吸光度。取質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC進(jìn)行同樣處理作為陽性對照。以吸光度表征總還原力。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力的測定

1,1 -二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力的測定參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。分別取質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖水溶液各2.0 mL,分別加入0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL混勻,室溫避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長處測定不同質(zhì)量濃度多糖溶液的吸光度。空白組以2 mL的去離子水代替多糖溶液。本底用去離子水代替DPPH-乙醇溶液。取質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC進(jìn)行同樣處理作為陽性對照。按公式（2）計算多糖溶液對DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白管吸光度；Aa為測定管吸光度；Ab為測定管本底吸光度。

1.3.5.3 ·OH清除能力的測定

羥自由基（·OH）清除能力的測定參照文獻(xiàn)[17-18]。分別取質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的多糖水溶液各1.0 mL,分別依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、9 mmol/L的H2O2溶液各1.0 mL,混勻后37 ℃反應(yīng)30 min,于510 nm波長處測定吸光度?？瞻捉M用去離子水代替多糖溶液,本底用去離子水代替H2O2溶液。取質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的VC進(jìn)行同樣處理并作為陽性對照。按公式（3）計算多糖溶液對·OH清除率。

式中：A0為空白管吸光度；Aa為測定管吸光度；Ab為測定管本底吸光度。

1.3.6 多糖的毒性測定

1.3.6.1 斑馬魚的飼養(yǎng)與胚胎的收集

斑馬魚（Brachydanio rerio）生長周期短、發(fā)育快速,比傳統(tǒng)的嚙齒類動物模型具有更大的優(yōu)勢。本實驗選用斑馬魚受精后6 h（6 hours post-fertilization,6 hpf）的胚胎和斑馬魚受精后3 d（3 days post-fertilization,3 dpf）的幼魚為研究對象[19-20]。斑馬魚養(yǎng)殖于（28.5±1.0）℃的人工海水中,斑馬魚養(yǎng)殖室內(nèi)采用人工光源對斑馬魚的生活周期進(jìn)行光調(diào)控,照明周期為14 h光照,10 h黑暗交替。餌料選用孵化48 h的豐年蝦,每日中午飼喂1 次。

胚胎收集：當(dāng)天開燈后立即將收卵皿置于魚缸底部,斑馬魚受光刺激開始出現(xiàn)明顯的追尾現(xiàn)象,產(chǎn)卵后受精卵會由紗網(wǎng)的網(wǎng)眼漏到平皿底,即刻將平皿提出,取出紗網(wǎng),將沉在平皿底部的魚卵吸出,每20～30 min收集魚卵1 次,沖洗幾次后轉(zhuǎn)至盛有人工海水的小平皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.6.2 斑馬魚毒性實驗

依據(jù)斑馬魚藥物毒性實驗[21]中藥物（頭孢唑啉）質(zhì)量濃度的范圍（胚胎在頭孢唑啉給藥質(zhì)量濃度高于0.3 mg/mL時全部致畸；幼魚在頭孢唑啉給藥質(zhì)量濃度高于0.3 mg/mL時全部死亡）確定在低、中、高3 個甜茶多糖質(zhì)量濃度下進(jìn)行測定。甜茶多糖（給藥組）母液質(zhì)量濃度為5 mg/mL,將母液用人工海水分別稀釋至0.1、1.0、2.5 mg/mL。

采用斑馬魚野生型TU品系。分別取6 hpf的斑馬魚胚胎和3 dpf的斑馬魚幼魚,每組各30 枚置于2 mL含0.1、1.0、2.5 mg/mL甜茶多糖的人工海水中,每個甜茶多糖質(zhì)量濃度組重復(fù)3 次。顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎和幼魚在接觸多糖溶液后,連續(xù)3 d的表型和存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010、OriginPro 2017C軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜茶多糖總糖含量與單糖組成分析結(jié)果

冷凍干燥后的水提甜茶多糖為淺黃色的絮狀物,多糖的得率為0.6%,相比文獻(xiàn)[8]中甜茶多糖得率（3.4%）及文獻(xiàn)[22]中普洱茶多糖得率（1.25%）而言較低。分析原因可能是本實驗中采用了二次醇沉,多糖純度進(jìn)一步提高,因此得率較低。進(jìn)一步地將所測得甜茶多糖的吸光度代入鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y＝14.975x+0.098 9（R2＝0.996 4）,即得甜茶多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。甜茶多糖的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.2%,其結(jié)果高于文獻(xiàn)[7]中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

圖1 8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物（A）和甜茶多糖水解液（B）的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of mixture of eight standard monosaccharides (A) and hydrolysate of polysaccharides from Rubus suavissimus S.Lee (B)

混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生液的高效液相色譜圖如圖1A所示,8 種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液衍生物在該色譜條件下實現(xiàn)了較好的分離。根據(jù)各單糖出峰時間、峰面積繪出各單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見表1,所測定的8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,擬合度較高。衍生化的甜茶多糖水解液在相同的色譜條件下進(jìn)行測定,結(jié)果見圖1B。結(jié)果表明,甜茶多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成,其物質(zhì)的量比為1.17∶21.79∶3.54∶1.00∶1.33∶2.86。其中鼠李糖含量最高,半乳糖含量最低。圖1B中30.50 min的新峰已驗證不是葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸,分析可能是一種新的糖醛酸,與傅里葉變換紅外光譜結(jié)果中含C＝O的伸縮振動峰相對應(yīng)。由于其含量較低,因此未做進(jìn)一步檢測。

表1 8 種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 1 Calibration curves of eight monosaccharides

2.2 甜茶多糖的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖2 甜茶多糖的傅里葉變換紅外光譜Fig.2 Fourier transform infrared spectra of Rubus suavissimus S.Lee polysaccharides

如圖2所示,甜茶多糖樣品在4 000～500 cm-1區(qū)具有多糖類物質(zhì)的一般特征。3 295、2 936、1 597、1 417、1 337、1 233、1 148、1 035、982、896、825 cm-1均有特征吸收。3 295 cm-1附近的強寬譜帶是糖類—OH的伸縮振動吸收峰,2 936 cm-1附近的吸收峰是甲基或亞甲基的C—H伸縮振動峰,1 200～1 420 cm-1附近的吸收峰是C—H的彎曲振動峰,與C—H的伸縮振動構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收[23]。1 597 cm-1附近的吸收峰是C＝O的伸縮振動峰,同時與吸收的水相關(guān),說明甜茶多糖對水有較強的親和力[24]。980～1 200 cm-1的吸收峰為吡喃糖環(huán)的伸縮振動峰,證明甜茶多糖樣品中單糖以吡喃糖苷的形式存在,與單糖組成結(jié)果一致。825 cm-1和896 cm-1的吸收峰分別代表α與β類型的糖苷鍵[25]。

2.3 甜茶多糖的抗氧化能力分析結(jié)果

2.3.1 總還原力分析結(jié)果

還原力是評價天然產(chǎn)物抗氧化能力的重要指標(biāo)。溶液的吸光度越大,其還原力越強。

圖3 VC和甜茶多糖的還原力Fig.3 Reducing power of VC and polysaccharides from Rubus suavissimus S.Lee

由圖3可知,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,吸光度增大,其還原力增強,但均低于同等質(zhì)量濃度VC的還原力。任嘉興等[18]對羊肚菌多糖的抗氧化活性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)羊肚菌多糖在質(zhì)量濃度1.0 mg/mL時,吸光度為0.25,略高于本實驗結(jié)果。Zhang Zuofa等[26]研究了金針菇多糖的還原能力,在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時,其多糖吸光度低于0.2,與陽性對照丁基羥基茴香醚同樣具有較大差異,這與本實驗結(jié)果較為一致。由此可知,甜茶多糖具有一定的還原力,但與VC相比較弱。

2.3.2 甜茶多糖DPPH自由基清除能力分析結(jié)果

DPPH法是評價抗氧化活性的常用方法,多糖作為抗氧化物質(zhì)可直接作用于DPPH自由基,使其顏色變淺,從而引起吸光度的變化[27]。

圖4 VC和甜茶多糖的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of VC and polysaccharides from Rubus suavissimus S.Lee

由圖4可知,在0.2～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),甜茶多糖對DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出劑量依賴性,在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,甜茶多糖的DPPH自由基清除率達(dá)到63.7%,低于1.0 mg/mL VC的清除率（94.5%）,但甜茶多糖來源于天然產(chǎn)物,相比而言其清除能力較強。李月等[28]研究苦膽草多糖的DPPH自由基的清除能力,在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時,其清除率為24.0%,低于相同質(zhì)量濃度甜茶多糖的清除率（36.0%）。Bi Hongtao等[17]研究真菌多糖的抗氧化活性,其結(jié)果顯示,在質(zhì)量濃度1 mg/mL時,真菌多糖的DPPH自由基清除率為55%,低于本實驗相同質(zhì)量濃度甜茶多糖的清除率。結(jié)果表明,水提甜茶多糖具有較強的DPPH自由基清除能力。

2.3.3 甜茶多糖·OH清除能力分析結(jié)果

·OH是活性氧中對生物體毒性最強的一種自由基,過量的·OH可以損傷細(xì)胞膜、殺死紅細(xì)胞、降解DNA等[29]。

圖5 VC和甜茶多糖的·OH清除能力Fig.5 ·OH radical scavenging activity of VC and polysaccharides from Rubus suavissimus S.Lee

如圖5所示,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,其·OH清除能力增強,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時,甜茶多糖的·OH清除率為34.5%,與VC在0.2 mg/mL時的清除率相當(dāng),證明甜茶多糖具有一定的·OH清除能力。分析其機(jī)制可能是多糖組分通過提供氫原子來終止自由基鏈反應(yīng)[30]。Chen Fang等[31]研究了山楂多糖的·OH清除能力,在質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時,其清除率為75%,高于本實驗結(jié)果。朱嬌嬌等[32]研究了3 種天然植物多糖的抗氧化作用,在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,3 種植物多糖的·OH清除率均低于20%,低于本實驗中1.0 mg/mL的甜茶多糖清除率（34.5%）。

2.4 甜茶多糖對斑馬魚胚胎和幼魚毒性分析結(jié)果

受精后發(fā)育至6 h的斑馬魚胚胎和受精后發(fā)育至3 d的幼魚（圖6）分別置于不同質(zhì)量濃度的甜茶多糖溶液的毒性表型和毒性實驗結(jié)果如表2所示。

圖6 斑馬魚胚胎和幼魚暴露于甜茶多糖的毒性實驗結(jié)果Fig.6 Toxicity results of zebrafish embryos and juveniles exposed to polysaccharides from Rubus suavissimus S.Lee

表2 斑馬魚胚胎和幼魚毒性實驗結(jié)果Table 2 Results of zebrafish embryos and juveniles toxicity study

由表2、圖6可知,在0.1、1.0、2.5 mg/mL的質(zhì)量濃度下,甜茶多糖均未表現(xiàn)出對斑馬魚胚胎和幼魚的致畸和致死作用,表明甜茶多糖具有一定的安全、低毒特點。丁興杰等[33]以受精后48 h發(fā)育正常的斑馬魚胚胎作為心臟毒性模型,研究了附子多糖的毒性。結(jié)果表明,附子多糖干預(yù)后,斑馬魚心率、胚胎死亡率無明顯變化,與本實驗結(jié)果一致。同時,程祖春等[34]也將斑馬魚胚胎模型作為抗腫瘤藥物的毒性評價方法。Sarmah等[35]以斑馬魚為模型,評估了環(huán)境毒物對心臟發(fā)育和功能的影響。采用斑馬魚作為模型生物簡便可行、穩(wěn)定可靠、預(yù)測性好,能夠為甜茶多糖的生物應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

本實驗以甜茶葉為材料,采用水提醇沉法提取了多糖成分,研究了其組成、體外抗氧化及體內(nèi)毒性作用。采用苯酚-硫酸法和衍生化高效液相色譜法分別測定了總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和單糖組成,并結(jié)合傅里葉變換紅外光譜進(jìn)一步證實了多糖組分。結(jié)果表明,在甜茶多糖中,總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70.2%,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖6 種單糖組成,其物質(zhì)的量比為1.17∶21.79∶3.54∶1.00∶1.33∶2.86。體外抗氧化實驗結(jié)果表明,甜茶多糖作為天然活性成分,具有一定的抗氧化能力,其中DPPH自由基清除能力相對較強。以斑馬魚為模型生物的體內(nèi)毒性實驗表明,甜茶多糖未表現(xiàn)出對斑馬魚胚胎和幼魚的致畸和致死作用,證明其具有安全、低毒的特點,本實驗為甜茶多糖的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù)。