光遺傳學(xué)技術(shù)在睡眠-覺(jué)醒相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)及環(huán)路研究中的應(yīng)用綜述

孫 華，郭永馨，張文娟，仝 黎

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 麻醉手術(shù)中心，北京 100853

睡眠是高等脊椎動(dòng)物普遍的生理機(jī)制，并且是維持人體特別是大腦功能所必需的一種行為。在日常生活中睡眠不足會(huì)導(dǎo)致疲憊、記憶力和注意力下降。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)時(shí)間的睡眠剝奪最終會(huì)誘發(fā)動(dòng)物免疫力下降、運(yùn)動(dòng)能力下降、體溫調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂、下丘腦功能嚴(yán)重紊亂，甚至導(dǎo)致多器官功能不全而死亡[1]。睡眠紊亂的相關(guān)疾病也是困擾患者的棘手問(wèn)題。因此有許多神經(jīng)科學(xué)研究步入睡眠與覺(jué)醒調(diào)節(jié)機(jī)制的領(lǐng)域，開(kāi)展了許多關(guān)于睡眠-覺(jué)醒神經(jīng)核團(tuán)及環(huán)路研究。在這些研究中，應(yīng)用了多種神經(jīng)生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)方法，如電生理、熒光標(biāo)記、鈣成像技術(shù)、免疫組化技術(shù)、手術(shù)切除相應(yīng)核團(tuán)以及應(yīng)用各種神經(jīng)遞質(zhì)受體的激動(dòng)劑和拮抗劑等。在眾多方法中，光遺傳學(xué)技術(shù)近年來(lái)脫穎而出。2005 年Deisseroth 的實(shí)驗(yàn)室第一次把視紫紅質(zhì)通道蛋白2(ChR2)表達(dá)于離體哺乳動(dòng)物海馬神經(jīng)細(xì)胞中，控制其電活動(dòng)以及神經(jīng)遞質(zhì)釋放[2]。之后光遺傳學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，結(jié)合了基因工程技術(shù)和前沿的光學(xué)技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用。由于其可在特定時(shí)間、特定細(xì)胞精確性表達(dá)而成為時(shí)下生命科學(xué)以及神經(jīng)科學(xué)研究的有力工具。本文就光遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于睡眠-覺(jué)醒神經(jīng)核團(tuán)及環(huán)路研究的成果進(jìn)行綜述。

1 光遺傳學(xué)技術(shù)在睡眠覺(jué)醒核團(tuán)研究中的應(yīng)用

光遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)腦區(qū)睡眠覺(jué)醒的核團(tuán)進(jìn)行光刺激，需要在特異性的細(xì)胞中找到合適的光遺傳蛋白表達(dá)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行蛋白工具的選擇，興奮性的視蛋白主要有ChR2，抑制性的視蛋白主要有NpHR(嗜鹽菌紫質(zhì))和Arch(蘇打紅鹽菌的視蛋白)等[3-4]。視蛋白需與某一種熒光蛋白如黃色熒光蛋白(YFP)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(GFP)和增強(qiáng)型紅色熒光蛋白(mCherry)等同時(shí)表達(dá)，以檢驗(yàn)其是否正常表達(dá)同時(shí)便于觀察神經(jīng)元和神經(jīng)環(huán)路的具體位置。這些已經(jīng)選定的視蛋白和熒光蛋白結(jié)合的基因片段需要通過(guò)特殊的病毒載體轉(zhuǎn)染于目標(biāo)神經(jīng)細(xì)胞。載體包括腺相關(guān)病毒、慢病毒等。為了特異性表達(dá)，同時(shí)還需要基因工程技術(shù)將含有Cre 酶的基因片段表達(dá)于相關(guān)特異性細(xì)胞中，如膽堿能神經(jīng)元、GABA 能神經(jīng)元、Orexin 能神經(jīng)元等調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒的神經(jīng)元中。最近的一項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，一種犬腺病毒2 載體可以注射于小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元軸突末端的區(qū)域，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)距離的逆行性轉(zhuǎn)導(dǎo)，使所有神經(jīng)元胞體表達(dá)視蛋白[5]。在上述工作完成后就需要在相應(yīng)部位置入光纖導(dǎo)管，根據(jù)視蛋白種類選擇不同波長(zhǎng)的光來(lái)刺激動(dòng)物的特定區(qū)域，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元的快速興奮或抑制，而光刺激模式的選擇則需要結(jié)合不同的神經(jīng)元類型在實(shí)驗(yàn)中摸索。有研究者也發(fā)明了無(wú)線光遺傳學(xué)技術(shù)，將胡椒大小的電子器件置入小鼠大腦，無(wú)線光刺激后對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響，可以減少對(duì)小鼠正?；顒?dòng)的干擾[6]。這一技術(shù)可以對(duì)小鼠睡眠環(huán)境產(chǎn)生更小的影響，與光纖導(dǎo)管相比有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

2 利用光遺傳學(xué)技術(shù)研究下丘腦的神經(jīng)核團(tuán)

下丘腦是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)和內(nèi)分泌活動(dòng)的較高級(jí)神經(jīng)中樞，調(diào)節(jié)體溫、攝食、睡眠、水鹽平衡和內(nèi)分泌腺活動(dòng)等重要的生理功能。在以往研究中睡眠覺(jué)醒調(diào)節(jié)核團(tuán)主要位于腹外側(cè)視交叉前區(qū)(ventrolateral preoptic area，VLPO)、 下 丘 腦 外 側(cè)區(qū)黑色素聚集激素神經(jīng)元(melanin-concentrating hormone，MCH)、下丘腦外側(cè)區(qū)食欲肽(Orexin)神經(jīng)元和結(jié)節(jié)乳頭核(tuberomammillary nucleus，TMN)中[7]。這些核團(tuán)相互影響，共同參與了睡眠覺(jué)醒的調(diào)節(jié)。

20 世紀(jì)末研究者們發(fā)現(xiàn)了食欲肽(Orexin)及其受體在調(diào)節(jié)神經(jīng)活性和調(diào)節(jié)攝食行為方面的作用[8]。之后在動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)中又有研究發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)元及受體還參與了睡眠與覺(jué)醒的轉(zhuǎn)換，并運(yùn)用基因敲除技術(shù)敲除Orexin 基因研究其對(duì)睡眠狀態(tài)的影響[9-10]。在這些理論的基礎(chǔ)上，F(xiàn)errari 等[11]將攜帶有編碼VGAT 啟動(dòng)子和ChR2 的慢病毒注射在轉(zhuǎn)基因小鼠的下丘腦外側(cè)區(qū)，采用光遺傳學(xué)技術(shù)調(diào)控投射在該區(qū)域的Orexin 能神經(jīng)元的GABA能神經(jīng)元軸突末梢，從而調(diào)控動(dòng)物在睡眠到覺(jué)醒狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。另有研究者采用小鼠動(dòng)物模型利用光遺傳學(xué)技術(shù)激活中縫背核(dorsal raphe nucleus，DRN)區(qū)五羥色胺能(5-HT)神經(jīng)元，記錄Orexin 能神經(jīng)元的突觸后反應(yīng)，結(jié)果顯示5-HT 神經(jīng)元可能通過(guò)5HT1A 受體直接抑制Orexin 能神經(jīng)元，也可能通過(guò)調(diào)控GABA 能神經(jīng)元間接抑制Orexin 能神經(jīng)元，進(jìn)而調(diào)節(jié)動(dòng)物的清醒狀態(tài)以及睡眠狀態(tài)[12]。此外也有在體研究用光遺傳刺激該核團(tuán)，來(lái)研究其與應(yīng)激焦慮相關(guān)的行為學(xué)表現(xiàn)，同時(shí)也引起了睡眠向覺(jué)醒的改變[13]?？傊?，Orexin 能神經(jīng)元因其在腦內(nèi)投射廣泛，在未來(lái)的神經(jīng)環(huán)路研究中仍有著重要的意義。

下丘腦外側(cè)區(qū)MCH 神經(jīng)元與Orexin 能神經(jīng)元在腦內(nèi)投射區(qū)域基本相似，與Orexin 能神經(jīng)元在睡眠覺(jué)醒調(diào)節(jié)中有著互補(bǔ)的作用。在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中用光遺傳學(xué)方法刺激MCH 神經(jīng)元可增加非快速動(dòng)眼睡眠期(non-rapid eye movement sleep，NREM)及快速動(dòng)眼睡眠期(rapid eye movement sleep，REM)的睡眠時(shí)間[14]。2016 年有研究結(jié)果顯示，在大鼠下丘腦注射攜帶ChR2 的病毒，利用光遺傳學(xué)技術(shù)分別采用5 Hz、10 Hz 和30 Hz 的藍(lán)光特異性激活MCH 神經(jīng)元，可增加夜晚REM 期及NREM 期的睡眠時(shí)間，白晝期間僅REM 期睡眠增加[14]。也有在體研究指出在光刺激MCH 后NREM 期增加并且腦電圖分析出現(xiàn)穩(wěn)定的慢波Delta 波，以上兩種研究的不同結(jié)果可能是與刺激的頻率方式以及刺激部位不同導(dǎo)致的。MCH 神經(jīng)元既可促進(jìn)NREM 向REM 期的轉(zhuǎn)換，同時(shí)也對(duì)NREM 期睡眠的產(chǎn)生和維持發(fā)揮作用[15]。

MCH 神經(jīng)元被認(rèn)為是一種GABA 能神經(jīng)元，釋放GABA 抑制下游神經(jīng)元，最近有研究證實(shí)用光遺傳學(xué)刺激中隔核外側(cè)區(qū)(lateral septal nucleus，LS)的MCH 神經(jīng)元軸突末端，通過(guò)電生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)MCH 神經(jīng)元向LS 區(qū)投射釋放谷氨酸使LS 激活，而谷氨酸同時(shí)激活了其他部位的GABA 能神經(jīng)元，這些GABA 能神經(jīng)元也投射到LS 區(qū)并形成了的前饋抑制機(jī)制[16]。之前研究發(fā)現(xiàn)只有在睡眠期才可以觀察到MCH 神經(jīng)元的活動(dòng)，最近有證據(jù)表明它在覺(jué)醒期也有神經(jīng)活動(dòng)[17]。上述發(fā)現(xiàn)證明MCH 神經(jīng)元不只是一種GABA 能神經(jīng)元而且還釋放谷氨酸影響下游神經(jīng)元，可能參與覺(jué)醒期的調(diào)節(jié)，未來(lái)也可以研究MCH 神經(jīng)元與Orexin 之間是否存在協(xié)同作用，并尋找在覺(jué)醒期調(diào)節(jié)方面的相關(guān)環(huán)路。 結(jié)節(jié)乳頭核是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中組胺的唯一來(lái)源，雖然已經(jīng)知道腹外側(cè)視交叉前區(qū)是主要的睡眠激活中心[18]，也知道組胺能神經(jīng)元在覺(jué)醒中的作用[19]，但仍然不知道哪些神經(jīng)環(huán)路參與其中。Williams 等[20]將光遺傳學(xué)技術(shù)與電生理技術(shù)結(jié)合來(lái)探究TMN 區(qū)組胺能神經(jīng)元與VLPO 區(qū)GABA 能神經(jīng)元在促進(jìn)覺(jué)醒功能中的神經(jīng)環(huán)路，用組氨酸脫羧酶-Cre 小鼠結(jié)合ChR2-mCherry 表達(dá)在結(jié)節(jié)乳頭核腹外側(cè)區(qū)(vlTMN)的組胺能神經(jīng)元，在光刺激相應(yīng)區(qū)域后可以用電生理技術(shù)記錄vlTMN 神經(jīng)元和VLPO 神經(jīng)元中的自發(fā)抑制性突觸后電流(sIPSC)，發(fā)現(xiàn)從TMN 區(qū)釋放的組胺通過(guò)H3 受體可以減少GABA 能神經(jīng)元向vlTMN 神經(jīng)元的傳入從而對(duì)自身進(jìn)行去抑制，并且組胺能神經(jīng)元可以通過(guò)H1 受體激活GABA 中間神經(jīng)元從而抑制VLPO 區(qū)GABA 能神經(jīng)元對(duì)vlTMN 區(qū)的抑制，以激活TMN 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞。VLPO 區(qū)神經(jīng)元和TMN 區(qū)神經(jīng)元彼此相互抑制，激活一個(gè)相應(yīng)的會(huì)抑制另外一個(gè)的表達(dá)。這一結(jié)果驗(yàn)證了之前研究中睡眠與覺(jué)醒調(diào)節(jié)的“觸發(fā)開(kāi)關(guān)”假說(shuō)，使睡眠或覺(jué)醒狀態(tài)轉(zhuǎn)換迅速[9]。Neuron 的一篇小鼠在體光遺傳學(xué)研究顯示，組胺能神經(jīng)元以旁分泌形式釋放GABA來(lái)參與睡眠調(diào)節(jié)，敲除轉(zhuǎn)基因小鼠組胺能神經(jīng)元中的VGAT 基因(編碼GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體)可導(dǎo)致覺(jué)醒期額外增加[21]。這樣的自身調(diào)節(jié)機(jī)制可能是為了使睡眠覺(jué)醒趨于一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，防止組胺能神經(jīng)過(guò)度激活，導(dǎo)致睡眠覺(jué)醒調(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)紊亂。也許其他神經(jīng)元中也有類似的機(jī)制，使大腦中神經(jīng)環(huán)路調(diào)節(jié)穩(wěn)定。

3 用光遺傳學(xué)技術(shù)研究丘腦網(wǎng)狀核與丘腦皮質(zhì)環(huán)路

丘腦網(wǎng)狀核(thalamic reticular nucleus，TRN)是位于丘腦與皮質(zhì)之間的GABA 能抑制性神經(jīng)核團(tuán)，參與感覺(jué)的加工、注意力控制、睡眠覺(jué)醒的調(diào)節(jié)[22]。睡眠梭形波產(chǎn)生于丘腦皮質(zhì)環(huán)路中，是在NREM 睡眠期觀察到的特征性腦電圖節(jié)律，頻率為7 ～ 15 Hz。用光遺傳學(xué)方法刺激轉(zhuǎn)基因(VGAT-ChR2)小鼠TRN 神經(jīng)元，同時(shí)記錄皮質(zhì)腦電圖，發(fā)現(xiàn)刺激頻率不同形成的腦電圖波形也不同，最終確定了最有效的激發(fā)皮質(zhì)睡眠梭形波的光刺激模式，產(chǎn)生在結(jié)構(gòu)與功能上與自發(fā)睡眠梭形波相似的波形，這些波形延長(zhǎng)了NREM 期睡眠時(shí)間，并且波形密度與睡眠時(shí)間相關(guān)[23]。這進(jìn)一步證實(shí)了丘腦是感覺(jué)信息中繼站，睡眠梭形波可能通過(guò)阻止外界感覺(jué)信息傳入來(lái)增加睡眠穩(wěn)定性以此維持睡眠。由此可以看出，丘腦皮質(zhì)神經(jīng)環(huán)路是睡眠調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要部分。Lewis 等[24]用光遺傳學(xué)技術(shù)刺激TRN 區(qū)可在腦電圖中檢測(cè)到慢波，并減少了覺(jué)醒狀態(tài)的持續(xù)時(shí)間，可以對(duì)皮質(zhì)的狀態(tài)進(jìn)行快速調(diào)節(jié)。也有在體動(dòng)物光遺傳學(xué)研究表明LH-GABA 神經(jīng)元投射抑制性信號(hào)控制TRNGABA 神經(jīng)元形成前饋抑制的環(huán)路，用光遺傳刺激該神經(jīng)環(huán)路中LH-GABA 神經(jīng)元可在NREM 期抑制TRN 神經(jīng)元活性從而引起覺(jué)醒，在REM 期則沒(méi)有顯著變化，同時(shí)也可以引起深度麻醉中的覺(jué)醒。而用光遺傳蛋白Arch 抑制該環(huán)路則可以增加小鼠NREM 睡眠持續(xù)時(shí)間，使NREM 期睡眠穩(wěn)定，腦電圖分析顯示Delta 波增多。在立體定位儀下注射有CHETA-EYFP 片段的腺相關(guān)病毒，結(jié)合病毒示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)了LH-GABA 與TRN 前后區(qū)域都有單突觸聯(lián)系。用Arch 蛋白抑制TRN 細(xì)胞也可引起NREM 期覺(jué)醒[25]。以往的研究指出膽堿能神經(jīng)元與REM 期產(chǎn)生有關(guān)，參與促覺(jué)醒作用。但最新研究顯示應(yīng)用光遺傳學(xué)技術(shù)刺激傳入TRN 的膽堿能神經(jīng)元會(huì)激活GABA 能神經(jīng)元而引起睡眠[26]。繼續(xù)深入研究TRN 區(qū)與其他核團(tuán)的聯(lián)系仍需借助光遺傳學(xué)手段。

丘腦室旁核(thalamic paraventricular nucleus，PVT)也成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，利用光遺傳學(xué)技術(shù)可發(fā)現(xiàn)丘腦室旁核中谷氨酸能神經(jīng)元促進(jìn)了睡眠向覺(jué)醒的轉(zhuǎn)換，而這一促覺(jué)醒作用可能與下丘腦外側(cè)區(qū)中Orexin 能神經(jīng)元向該區(qū)域的投射相關(guān)[27]。

4 用光遺傳學(xué)技術(shù)研究中腦腹側(cè)背蓋區(qū)神經(jīng)核團(tuán)

之前對(duì)于中腦腹側(cè)背蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)的研究主要集中于機(jī)體的獎(jiǎng)賞機(jī)制、成癮現(xiàn)象以及恐懼記憶的形成[28-30]。近些年VTA核團(tuán)參與睡眠機(jī)制的調(diào)節(jié)逐漸受到關(guān)注。一項(xiàng)發(fā)表于PNAS 的研究結(jié)果證實(shí)，通過(guò)光遺傳學(xué)特異性激活VTA 核團(tuán)多巴胺神經(jīng)元能夠促進(jìn)動(dòng)物從麻醉狀態(tài)向覺(jué)醒狀態(tài)轉(zhuǎn)換，首次為VTA 核團(tuán)多巴胺神經(jīng)元參與全麻藥物誘導(dǎo)的麻醉效應(yīng)向覺(jué)醒過(guò)程轉(zhuǎn)換的作用機(jī)制提供了證據(jù)[31]。有研究報(bào)道利用光遺傳技術(shù)特異性激活小鼠VTA 區(qū)的谷氨酸能神經(jīng)元可以使覺(jué)醒期和REM 期延長(zhǎng)，產(chǎn)生促進(jìn)覺(jué)醒的作用；相反激活VTA 區(qū)GABA 能神經(jīng)元?jiǎng)t能維持長(zhǎng)時(shí)間的NREM 睡眠期，如果將這些神經(jīng)元損毀則能增加清醒期長(zhǎng)達(dá)4 個(gè)月[32]。VTA 核團(tuán)的神經(jīng)元種類復(fù)雜，可能通過(guò)投射到下游的伏隔核(nucleus accumbens，NAc)或下丘腦發(fā)揮調(diào)解睡眠的作用。

5 結(jié)語(yǔ)

光遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒的神經(jīng)核團(tuán)和環(huán)路研究中。光遺傳方法與傳統(tǒng)的電刺激方法相比，一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)就在于它可以對(duì)動(dòng)物進(jìn)行最小的干預(yù)、在特定的時(shí)間窗來(lái)激活神經(jīng)細(xì)胞活性，也可以減少睡眠狀態(tài)轉(zhuǎn)換的潛伏期并減小實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變異性，在科學(xué)性上更具有說(shuō)服力。在具體應(yīng)用時(shí)，也需要結(jié)合上述方法和其他生命、神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域前沿的多種方法如腦功能性MRI、化學(xué)遺傳學(xué)方法綜合應(yīng)用以達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。未?lái)需要繼續(xù)開(kāi)發(fā)創(chuàng)新光遺傳學(xué)技術(shù)以更加深入地研究睡眠覺(jué)醒的調(diào)節(jié)機(jī)制，幫助人類攻克失眠、嗜睡等臨床問(wèn)題，并對(duì)全身麻醉的機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。