李秋燕 夏志楊 熊小敏

隨著成分輸血技術(shù)的不斷提高,機(jī)采血小板由于質(zhì)量較純、采集量較大,得到了較快的發(fā)展和推廣,在臨床應(yīng)用中極大地降低了輸血傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)也減少了同種免疫反應(yīng)的發(fā)生,更加便于血小板配型工作的順利開展。但是隨著血小板需求量的不斷增加,即使血小板儲(chǔ)存技術(shù)得到了較大的提高,相關(guān)設(shè)備也更加先進(jìn),血小板的儲(chǔ)存時(shí)間也進(jìn)一步延長(zhǎng),但是有研究表明,血小板的儲(chǔ)存時(shí)間會(huì)對(duì)其代謝功能產(chǎn)生一定的影響［1］,本研究對(duì)30例單采血小板儲(chǔ)存時(shí)間與其代謝功能之間的相關(guān)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察,結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：血小板保存袋和CS3000plus血細(xì)胞分離機(jī)均為Baxter International 生產(chǎn)。流式細(xì)胞儀FACSSalibur 為Becton,Dickinson and Company 生產(chǎn),保存箱則采用美國(guó)Helmer Scientific 血小板恒溫振蕩保存箱。試劑：ACD-2 抗凝劑,血小板洗滌劑由上海市血液中心生產(chǎn)；CD41FITC、MouselgG-1FITC、CD62-PFITC 等由Beckman Couiter 生產(chǎn)。

1.2 樣本 本次選用的血小板樣本來(lái)自于30例健康自愿獻(xiàn)血者,根據(jù)血站的具體操作流程,通過(guò)采用CS3000plus 血細(xì)胞分離儀對(duì)單采血小板進(jìn)行了分離,得到了30 袋濃縮血小板懸液,每袋懸液的含量為1 個(gè)治療量,每個(gè)治療量中含有大約(2.5～3)×1011的血小板含量。將以上血小板放置在溫度設(shè)定為22℃的Helmer Scientific 血小板恒溫振蕩保存箱中進(jìn)行儲(chǔ)存,水平振搖后,保存8 d。

1.3 測(cè)定方法 ①通過(guò)預(yù)試驗(yàn)對(duì)本次研究所采用的血?dú)夥治鰞x進(jìn)行定標(biāo)檢測(cè),要求在預(yù)試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)分析儀進(jìn)行保養(yǎng)和定標(biāo),每日測(cè)定參數(shù)值,以保證儀器的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,并適當(dāng)調(diào)整相關(guān)的工作參數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)熟悉掌握分析儀的具體操作流程,并針對(duì)實(shí)驗(yàn)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題預(yù)先設(shè)計(jì)解決方案。一旦出現(xiàn)超出檢測(cè)范圍的情況,應(yīng)對(duì)pH 值和乳酸含量進(jìn)行補(bǔ)償,適當(dāng)調(diào)整斜率［2］。②對(duì)預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)分析,改進(jìn)預(yù)實(shí)驗(yàn)中影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相關(guān)步驟。采用新的專用試劑盒,防止在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中中途更換試劑盒而導(dǎo)致誤差增大,同時(shí)每周應(yīng)進(jìn)行1 次穩(wěn)定性測(cè)試。③采用封口機(jī)每次從劑量為20 ml 的血小板中提取1 ml 的血小板樣品,提取時(shí)應(yīng)注意要在生物安全柜中進(jìn)行。采用血?dú)夥治鰞x分別在血小板儲(chǔ)存4 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 以及8 d 時(shí)對(duì)其各項(xiàng)血?dú)庵笜?biāo)進(jìn)行檢測(cè),在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)注意盡可能的減少樣品和空氣的直接接觸時(shí)間,以確保檢測(cè)值的真實(shí)性和可靠性。若檢測(cè)出的數(shù)值超出檢測(cè)范圍,需要及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)償,并調(diào)整斜率,調(diào)整完成之后進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。在測(cè)定期間要注意做好儀器的保養(yǎng)工作,確保儀器的正常穩(wěn)定運(yùn)行。

1.4 觀察指標(biāo) 分析比較不同儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)血小板的pH 值和乳酸水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng),pH 值含量在儲(chǔ)存4 h～1 d 呈上升趨勢(shì),而在之后的幾天pH 值呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降趨勢(shì),儲(chǔ)存4 h 的pH 值(7.25±0.03)高于儲(chǔ)存8 d 的(6.70±0.41),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而乳酸含量則呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢(shì),儲(chǔ)存4 h 乳酸含量(1.95±0.46)mmol/L低于儲(chǔ)存8 d的(30.05±8.05)mmol/L,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)血小板的pH 值和乳酸水平比較(±s,n=30)

表1 不同儲(chǔ)存時(shí)間點(diǎn)血小板的pH 值和乳酸水平比較(±s,n=30)

注：與8 d 比較,aP＜0.05

3 討論

血小板是人體血液中重要的細(xì)胞成分,具有粘附、聚集和釋放細(xì)胞因子等重要生理功能,在止血過(guò)程中,血小板具有不可替代性,因此血小板在臨床止血以及血小板治療中具有重要價(jià)值［3］。隨著惡性腫瘤治療技術(shù)的不斷發(fā)展,化療、放療、骨髓移植等方法在臨床中的應(yīng)用不斷增多,由此所導(dǎo)致的患者出現(xiàn)血小板減少癥的情況也越來(lái)越多,再加上很多血液系統(tǒng)疾病引起的血小板減少現(xiàn)象,使得臨床治療中對(duì)血小板的需求量逐年增加［4］。但是現(xiàn)階段血小板的保存時(shí)間一般僅能達(dá)到5 d 左右,使得血小板的臨床應(yīng)用受到了極大的限制,而且在長(zhǎng)時(shí)間的保存過(guò)程中,血小板的質(zhì)量也會(huì)出現(xiàn)一定程度的損傷,使得其形態(tài)和功能會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變,因此探討血小板的儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)其代謝功能產(chǎn)生的影響具有重要的研究?jī)r(jià)值［5］。

我國(guó)在成分輸血方面已經(jīng)逐漸克服了技術(shù)難關(guān),血小板輸注已經(jīng)能夠有效應(yīng)用于腫瘤手術(shù)、血液系統(tǒng)疾病、外科手術(shù)中。血小板輸注在臨床中的治療效果成為醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注的問(wèn)題,而且隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步,要求血小板輸注有更高的質(zhì)量。目前,血站針對(duì)血小板的質(zhì)量檢測(cè)更加偏重于血小板含量,我國(guó)就全血和成分血的質(zhì)量要求作出相關(guān)規(guī)定說(shuō)明,其中要求針對(duì)單采血小板的合格標(biāo)準(zhǔn)要求血小板含量在2.5×1011/L 及以上,白細(xì)胞混入量要求在5.0×108/L 及以下,紅細(xì)胞混入量要求在8.0×109/L 及以下。事實(shí)上,血小板計(jì)數(shù)不會(huì)受到時(shí)間和存儲(chǔ)溫度的變化影響發(fā)生改變,經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)血小板進(jìn)行檢測(cè)時(shí),血小板的表現(xiàn)形式為顆粒狀,以此血小板計(jì)數(shù)的影響因素僅包含血小板的大小和形狀,無(wú)法與血小板功能特性取得關(guān)聯(lián)。所以,僅對(duì)單采血小板計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)是不夠的,需要同時(shí)檢測(cè)血小板功能。血小板的代謝率很高,需要較高的能量作為支撐,有氧代謝為其提供了大部分的能量,靜息狀態(tài)下的代謝率是骨骼肌細(xì)胞的600%。缺氧狀態(tài)下,糖酵解成為血小板的轉(zhuǎn)化途徑,最終生成腺苷三磷酸,這樣血小板中的乳酸含量會(huì)迅速上升。

在我國(guó)關(guān)于全血和成分血質(zhì)量要求規(guī)定中指出,常溫條件下單采血小板的保存時(shí)間可以在5 d,對(duì)于血小板保存時(shí)間做出規(guī)定的原因是血小板在常規(guī)狀態(tài)下保存其功能和形態(tài)可能會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變,也就是所謂的血小板保存損傷。其中的機(jī)制并不是可以簡(jiǎn)單闡述的,主要包括保存體系會(huì)消耗大量的代謝能量和血小板體外活化引起的。血小板代謝分為能量代謝、花生四烯酸代謝、脂質(zhì)代謝等,此次針對(duì)血小板代謝指標(biāo)發(fā)生的改變是以血小板能量代謝作為重點(diǎn)研究方向。血小板是在無(wú)氧狀態(tài)下儲(chǔ)存的,期間會(huì)以糖酵解作為途徑發(fā)生改變,讓乳酸大規(guī)模聚集在一起,在此期間血小板膜會(huì)釋放出乳酸脫氫酶,血小板的pH 值無(wú)法繼續(xù)維持穩(wěn)定會(huì)有所下降,血小板代謝損傷會(huì)影響血小板輸注的治療效果,因此需要經(jīng)過(guò)一些特殊處理方法,比如改良保存技術(shù)或者可以加入保護(hù)劑避免代謝損傷的發(fā)生。有相關(guān)研究指出,血小板保存液中的血漿成分無(wú)法更好的保護(hù)血小板,可以使用人工制備的血小板保護(hù)液來(lái)替代,以此讓血小板代謝損傷率更低。比如,血小板儲(chǔ)存過(guò)程中如果使用不含葡萄糖的保護(hù)液,糖酵解反應(yīng)便不會(huì)發(fā)生,乳酸的產(chǎn)生量會(huì)顯著降低；也可以在血小板儲(chǔ)存時(shí)使用含葡萄糖和具備緩沖能力的保護(hù)液,也會(huì)讓乳酸反應(yīng)顯著降低。所以,血小板在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生的代謝功能損傷、對(duì)血小板輸注治療效果的影響或者血小板保護(hù)液,上述內(nèi)容的研究最終與血小板存儲(chǔ)時(shí)間對(duì)血小板代謝和功能的影響相關(guān)聯(lián),有重要的研究意義。

本文實(shí)驗(yàn)研究顯示,隨著血小板儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng),pH 值含量在儲(chǔ)存4 h～1 d 呈上升趨勢(shì),而在之后的幾天pH 值呈現(xiàn)穩(wěn)定的下降趨勢(shì),儲(chǔ)存4 h 的pH 值高于8 d,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而乳酸含量則呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢(shì),儲(chǔ)存4 h 乳酸含量低于8 d,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。分析原因可能是由于血小板本身的代謝過(guò)程所導(dǎo)致的,血小板代謝過(guò)程主要分為兩種,一種是無(wú)氧代謝,一種則是有氧代謝［6］。其中無(wú)氧代謝主要是指糖酵解,在這過(guò)程中葡萄糖不斷的被消耗,而乳酸則不斷產(chǎn)生；有氧代謝則是三羧酸循環(huán),最終會(huì)產(chǎn)生一定量的CO2,使得pH 值不斷的發(fā)生改變。因此,隨著儲(chǔ)存時(shí)間的不斷延長(zhǎng),血小板pH 值出現(xiàn)下降現(xiàn)象可能是由于血小板在代謝初期氧氣充足,再加上保存袋所具有的通氣性能較好,因此在血小板保存之初透出的CO2大于產(chǎn)生的CO2含量,也就是說(shuō)血小板丟失了自身所含有的CO2,才會(huì)出現(xiàn)短暫的pH值上升現(xiàn)象,而隨著儲(chǔ)存時(shí)間的不斷延長(zhǎng),CO2逸出量與代謝生成量達(dá)到平衡繼而超出,pH 值才會(huì)逐漸的降低。本次研究通過(guò)檢測(cè)血小板的代謝指標(biāo),能夠從代謝功能上反映出血小板儲(chǔ)存質(zhì)量是否良好,希望能夠?yàn)槲磥?lái)血小板體外質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建提供一定的參考價(jià)值。

綜上所述,通過(guò)對(duì)不同儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)單采血小板的pH 值和乳酸含量進(jìn)行檢測(cè),能夠根據(jù)這兩種代謝數(shù)值更好的對(duì)血小板的儲(chǔ)存質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),探討血小板保存時(shí)間和條件,為提高血小板的儲(chǔ)存質(zhì)量提供參考依據(jù)。