朱惠云 宋英曉 孔祥毓 杜奕奇

海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433

AP并發(fā)急性肺損傷(acute lung injury, ALI)發(fā)病急驟，病情兇險，病死率居高不下，占AP總體病死率的70%[1-2]。外泌體是細(xì)胞分泌的一種微小囊泡，可包裹蛋白質(zhì)或RNA等生物信息分子，參與體內(nèi)重要的物質(zhì)運(yùn)輸。既往動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，miR-216a在AP大鼠血漿中顯著高表達(dá)，或可作為AP的標(biāo)志物[3]，但目前尚無miR-216a與AP并發(fā)ALI相關(guān)的研究。內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變是ALI發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[4]，本研究旨在檢測miR-216a在AP并發(fā)ALI患者血漿及其外泌體中的表達(dá)水平，以具有干細(xì)胞潛能的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)作為體外內(nèi)皮細(xì)胞模型，檢測miR-216a對內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響，從而了解miR-216a參與AP并發(fā)ALI發(fā)生的具體機(jī)制。

材料與方法

一、研究對象

收集2015年12月至2016年3月間海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科收治的40例AP患者，按是否并發(fā)ALI將患者分為AP并發(fā)ALI組(AP-ALI組，13例)和AP不并發(fā)ALI組(AP組，27例)。以8 名健康志愿者作為對照組。AP診斷符合2012年亞特蘭大AP診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。ALI的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在如AP等高危因素；(2)起病急驟，出現(xiàn)呼吸頻率加快伴或不伴呼吸窘迫；(3)低氧血癥，動脈血氧分壓(PaO2)/吸氧濃度(FiO2)≤300 mmHg (1 mm Hg=0.133 kPa)；(4)X線檢查可見雙肺浸潤影；(5)肺毛細(xì)血管楔壓≤18 mmHg，除外心源性肺水腫[5]。本研究獲醫(yī)院倫理委員會審批(CHEC2015-067)，所有患者及志愿者均簽署相關(guān)知情同意書。

二、血漿及其外泌體的采集和RNA的抽提

收集AP患者入院24 h內(nèi)的新鮮外周血3～5 ml于EDTA抗凝管中，輕輕混均后置1 000 g離心10 min。收集上層血漿，-80℃凍存。健康志愿者血漿采集方法同上。使用TRI Reagent BD(Ambion，美國)抽提血漿RNA。采用外泌體抽提試劑盒(QIAGEN，德國)提取血漿中的外泌體，按照試劑盒說明書操作。取2 μl提取的外泌體樣本滴于經(jīng)過親水化處理的載網(wǎng)上，干燥后用甲酸鈾染色1min，吸干并置于烤燈下烘烤10min后置電鏡觀察和鑒定。同上法抽提外泌體RNA。

三、miR-216a檢測

采用RT-PCR法檢測血漿及外泌體miR-216a的表達(dá)。使用TaqManTMmicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher，美國)先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再使用TaqManTM通用PCR主混合料在LightCycler 480熱循環(huán)機(jī) (Roche，德國)上進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以miR-39(QIAGEN，德國)作為外源性參照。miR-216a引物序列為3′UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA-5′，PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s；60℃、60 s，40個循環(huán)。通過PCR儀自帶軟件獲取Ct值，將45-Ct=45-(CtmiR-216a-CtmiR-39)作為描述miR-216a相對表達(dá)量的參數(shù)。CtmiR-216a-CtmiR-39值>45的樣本統(tǒng)一按45進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

四、內(nèi)皮細(xì)胞通透性的測量

HUVEC細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，復(fù)蘇后置于10%胎牛血清、雙抗、碳源的DMEM高糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)、傳代。使用Lipofectamine?2000(Thermo Fisher，美國)將anti-miR-216a轉(zhuǎn)染入HUVEC細(xì)胞，構(gòu)建miR-216a低表達(dá)細(xì)胞株。

將AP-ALI患者的血漿外泌體分別與HUVEC(AP-ALI-HUVEC組)、miR-216a低表達(dá)HUVEC(AP-ALI-anti-miR-216a HUVEC組)共培養(yǎng)24 h，以未處理的HUVEC細(xì)胞作為對照組。取對數(shù)生長期內(nèi)皮細(xì)胞，以每孔0.2×104個細(xì)胞接種至Transwell細(xì)胞小室(Corning costar，美國)上室，下室加培養(yǎng)液，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度接近100%時，將Millicell ERS-2上皮伏特歐姆計(jì)的電極片短端浸入上室內(nèi)部培養(yǎng)液內(nèi)，長端浸入下室培養(yǎng)基內(nèi)，且與培養(yǎng)板成90°垂直，讀取并記錄跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(trans-endothelium electrical resistant, TEER)，電阻值低表示內(nèi)皮細(xì)胞的通透性高。每組設(shè)置2個小室，每個小室重復(fù)測3次，取均值。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、臨床基本信息

AP-ALI組與AP組患者的性別比、年齡、病因、血淀粉酶水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但AP-ALI組患者血肌酐和尿素氮水平顯著高于AP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 40例急性胰腺炎患者一般資料

二、對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿miR-216a水平

對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿miR-216a水平分別為5.37±1.54、11.08±1.60、14.45±1.64，AP-ALI組顯著高于AP組，AP組又顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.15、9.11，P值均<0.01)。

三、對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿外泌體 miR-216a水平

電鏡下觀察血漿外泌體為大小50～90 nm的杯狀膜泡(圖1)。對照組、AP組、AP-ALI組患者血漿外泌體中miR-216a水平分別為5.01±0.79、10.86±1.31、14.03±1.58，AP-ALI組顯著高于AP組，AP組又顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.25、7.98，P值均<0.01)。

圖1 AP-ALI患者血漿外泌體的形態(tài)(透視電鏡，×10 000倍)

四、miR-216a增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性

以對照組的電阻值為1，AP-ALI-HUVEC組、AP-ALI-anti-miR-216a HUVEC組的電阻比值分別為0.74±0.04、1.02±0.08，AP-ALI-HUVEC組顯著低于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.73、5.21，P值均<0.05)，提示AP-ALI患者血漿外泌體通過運(yùn)輸miR-216a增加HUVEC通透性。

討 論

AP合并ALI的診斷通常基于臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查技術(shù)，目前尚缺乏能夠早期高效預(yù)判AP合并ALI的標(biāo)志物[6-8]。miR-216a與各種疾病特別是胰腺相關(guān)疾病密切相關(guān)[9-13]。與正常胰腺組織相比，miR-216a在胰腺導(dǎo)管腺癌中下調(diào)200倍以上，在慢性胰腺炎中miR-216a表達(dá)無明顯變化，在胰腺星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞時miR-216a表達(dá)下調(diào)[14]。此外，miR-216a還與胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞遷移、侵襲、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)。本課題組既往研究結(jié)果顯示，miR-216a可作為AP大鼠的標(biāo)志物，其靈敏度和特異度均高于血清淀粉酶[3]。本研究結(jié)果表明，AP-ALI組患者血漿miR-216a水平顯著高于AP組，AP組血漿miR-216a水平又顯著高于健康志愿者。為進(jìn)一步探討miR-216a以何種形式存在于血漿中，本研究抽提血漿中的外泌體并檢測miR-216a的表達(dá)水平，結(jié)果顯示AP-ALI組患者血漿外泌體內(nèi)miR-216a水平顯著高于AP組，AP組血漿外泌體miR-216a水平又顯著高于健康志愿者，間接提示miR-216a以外泌體形式存在于血漿中。

內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變是ALI發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。TEER是衡量內(nèi)皮細(xì)胞通透性的常用指標(biāo)。有研究報(bào)道m(xù)iR-216a可能是急性呼吸窘迫綜合征的一個保護(hù)因素，可通過JAK2/STAT3/NF-κB通路緩解脂多糖誘導(dǎo)的炎性損傷[15]。但在miR-216a與AP的相關(guān)研究中認(rèn)為，miR-216a是AP發(fā)生發(fā)展的危險因素。miR-216a可通過靶向作用于PTEN和smad7，調(diào)節(jié)PI3K/AKT/TGF-β通路，誘導(dǎo)AP的發(fā)生[16]。細(xì)胞間緊密連接蛋白(如ZO-1、Occludin等)的表達(dá)改變可直接影響細(xì)胞通透性[17]。為探討miR-216a是否參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，本研究以HUVEC細(xì)胞作為研究對象，將anti-miR-216a 轉(zhuǎn)染入HUVEC細(xì)胞，與AP-ALI患者血漿外泌體共培養(yǎng)。另將未轉(zhuǎn)染anti-miR-216a的HUVEC細(xì)胞與AP-ALI患者血漿外泌體共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與AP-ALI患者血漿外泌體共培養(yǎng)后的HUVEC細(xì)胞通透性顯著高于對照組，而與AP-ALI患者血漿外泌體共培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染anti-miR-216a的HUVEC細(xì)胞通透性與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明miR-216a可增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，可能與肺損傷的發(fā)生相關(guān)。miR-216a是否通過改變緊密連接蛋白的表達(dá)增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性，及其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突