金賽燕 章惠萍 任寧寧

杭州市腫瘤醫(yī)院檢驗科，杭州 310002

微小RNA(microRNA, miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細胞中非編碼的長19～24 nt的單鏈小分子RNA。目前研究表明，多種miRNA參于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，可作為腫瘤治療的有效靶點。miRNA-21(miR-21)是一類原癌基因，在多種腫瘤組織中均有表達，其表達升高與胰腺癌患者的不良預(yù)后以及化療抵抗密切相關(guān)[1-2]。程序性細胞死亡因子4(programmed cell death factor 4，PDCD4)屬于一種腫瘤抑制基因，是重要的抗腫瘤治療靶點。報道顯示，PDCD4參與細胞凋亡，調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可作為腫瘤抑制劑治療惡性腫瘤[3]。Benjamind等[4]研究結(jié)果顯示，向卵母細胞注射miR-21模擬物可降低PDCD4表達，但miR-21對胰腺癌細胞PDCD4表達的影響少有報道。本研究旨在觀察miR-21對胰腺癌PANC1細胞侵襲、遷移及凋亡的影響，探討其分子機制，為胰腺癌臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

人胰腺癌PANC1細胞系購自杭州仟諾生物科技有限公司。MTT、Transwell試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司?？沽姿崦负蛷埩Φ鞍淄椿?phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、survivin、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9一抗和二抗均購自美國Proteintech公司，抗PDCD4一抗購自美國Invitrogen公司。

二、方法

1．重組質(zhì)粒構(gòu)建及細胞分組：miR-21序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司根據(jù)質(zhì)粒特點進行引物設(shè)計，引入SacⅠ酶切位點。miR-21引物序列：正向引物5′-AGCTCAAAAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3′，反向引物5′-CACCTAGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTTTG-3′。正反鏈混合后加退火緩沖液置95℃反應(yīng)4 min，冷卻至室溫，形成雙鏈。同時制備靶向miR-21的小干擾RNA(siRNA-miR-21)。采用Eco31Ⅰ酶切將雙鏈miR-21及siRNA-miR-21分別插入質(zhì)粒pGenesil-1，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，平皿接種培養(yǎng)24 h后挑選單克隆菌落，接種于含30 μg/ml Kana的LB培養(yǎng)液，置37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取少量大腸桿菌懸液抽提重組質(zhì)粒，使用SacⅠ酶切法鑒定重組質(zhì)粒是否成功。重組質(zhì)粒鑒定由大連寶生物工程有限公司完成。

人胰腺癌PANC1細胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞，待培養(yǎng)至70%融合狀態(tài)時用無血清DMEM培養(yǎng)過夜。采用脂質(zhì)體2000將插入miR-21及siRNA-miR-21的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染PANC1細胞，建立miR-21過表達細胞株(過表達組)和miR-21沉默細胞株(沉默組)，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組為空白組，按LipofectamineTM2000說明書操作。采用qRT-PCR法鑒定各組細胞miR-21的表達量。

2．細胞增殖檢測：采用MTT法檢測細胞增殖。取各組對數(shù)生長期PANC1細胞接種于96孔板，每孔2 000個細胞，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每組每時間點設(shè)6個復(fù)孔，培養(yǎng)到時間點時向孔中加入20 μl 5 mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO，振蕩5 min，上酶聯(lián)檢測儀測各孔波長490 nm處的值(A490值)。根據(jù)公式計算細胞增殖率。不同時間點增殖率=(不同時間點的A490值-0 h的A490值)/0 h的A490值×100%。實驗重復(fù)6次，取均值。

3．細胞凋亡檢測：采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。取各組對數(shù)生長期PANC1細胞，用不含四乙酸二氨基乙烷的0.25%胰酶消化5 min，用PBS洗滌、離心、重懸2次，用300目細胞過濾網(wǎng)過濾細胞，采用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒進行標記染色，避光孵育15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復(fù)6次，取均值。

4．細胞侵襲能力檢測：采用Transwell試劑盒檢測細胞侵襲能力。于Transwell小室的聚碳酸酯膜表面加入50 μl基底膜基質(zhì)，待其凝固。取各組對數(shù)生長期PANC1細胞，用胰酶消化、PBS清洗1～2次后以10 g/L的BSA重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×105個/ml。取150 μl細胞懸液加入到Transwell上室，下室加細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出小室的隔膜，輕輕擦去隔膜上表面未穿膜細胞，用乙醇固定隔膜5 min，行臺盼藍染色，置倒置顯微鏡下隨機選取5個200倍視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)。每組做6個Transwell小室，取均值。

5．細胞遷移能力檢測：采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。將各組對數(shù)生長期細胞接種到6孔板，培養(yǎng)到細胞融合達到90%時，使用100 μl的槍頭垂直于孔板底部劃出3條直線，間隔0.5 cm，用PBS緩沖液清洗2～3次，加含0.5%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，置倒置顯微鏡下對劃痕前后的相應(yīng)區(qū)域拍照。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次。使用Image J軟件計算各組細胞遷移24 h后覆蓋的劃痕面積。

6．細胞PDCD4、PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達量檢測：取各組對數(shù)生長期PANC1細胞，胰酶消化、洗滌，制備成細胞懸液，采用酶聯(lián)免疫法檢測細胞PDCD4表達量，按試劑盒說明書操作。辣根過氧化物酶標記的抗PDCD 4抗體工作濃度1∶1 000，最后加底物鄰苯二胺顯色，遮光保存20 min，加入2 mol/L H2SO40.05 ml終止反應(yīng)，上酶標儀上讀取各孔A450值，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)2次，取均值。

取各組對數(shù)生長期PANC1細胞，加入蛋白裂解液提取蛋白，采取BCA法定量蛋白后取50 μg樣品常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達量，以GAPDH為內(nèi)參。抗PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9一抗工作濃度1∶1 000，二抗工作濃度1∶5 000，最后用ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。使用軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示目的蛋白相對表達量。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組細胞miR-21表達量比較

空白組、過表達組和沉默組miR-21表達量分別為0.54±0.11、0.96±0.24和0.15±0.06，沉默組miR-21表達量低于空白組，過表達組miR-21表達量顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=40.297，P=0.000)，表明miR-21過表達組和miR-21沉默組細胞系構(gòu)建成功。

二、miR-21對胰腺癌細胞增殖的影響

除沉默組72 h時間點外，空白組、過表達組、沉默組細胞增殖率均隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加；同一培養(yǎng)時間點，過表達組細胞增殖率顯著高于空白組，沉默組顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)，表明miR-21增強癌細胞的增殖能力。

表1 3組PANC1細胞培養(yǎng)不同時間點增殖率比較

三、miR-21對胰腺癌細胞凋亡的影響

空白組、過表達組、沉默組細胞凋亡率均隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增高；同一培養(yǎng)時間點，過表達組細胞凋亡率顯著低于空白組，沉默組細胞凋亡率顯著高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，表2)，表明miR-21抑制癌細胞的凋亡。

圖1 空白組(1A)、過表達組(1B)、沉默組(1C)培養(yǎng)24 h的PANC1凋亡細胞

表2 3組PANC1細胞培養(yǎng)不同時間點凋亡率比較

四、miR-21轉(zhuǎn)染對胰腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響

空白組、過表達組、沉默組的穿膜細胞量分別為(212.4±32.5)、(508.8±50.7)、(50.9±10.6)個/200倍視野(圖2)；細胞遷移覆蓋面積分別為(75.6±12.1)、(118.8±20.2)、(48.8±9.5)mm2/200倍視野(圖3)。過表達組均顯著高于空白組，沉默組均顯著低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為259.640、327.970，P值均<0.05)，表明miR-21增強癌細胞的侵襲和遷移能力。

圖2 空白組(2A)、過表達組(2B)、沉默組(2C)的穿膜細胞數(shù)(臺盼藍染色， ×200)

圖3 空白組(3A)、過表達組(3B)、沉默組(3C)的細胞24 h遷移距離(×200)

五、miR-21對PDCD4、PTEN、VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

沉默組PDCD4、PTEN表達量顯著高于空白組，而VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表達量顯著低于空白組；過表達組PDCD4、PTEN表達量顯著低于空白組，而VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表達量顯著高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表3，圖4)，表明miR-21的表達與PDCD4、PTEN呈負相關(guān)，而與VEGF、survivin、MMP-2、MMP-9表達呈正相關(guān)。

圖4 空白組(1)、過表達組(2)、沉默組(3)PANC1細胞相關(guān)蛋白的表達(蛋白質(zhì)免疫印跡法)

表3 3組PANC1細胞相關(guān)分子蛋白表達比較

討 論

miRNA能夠調(diào)控某一特定的基因或者蛋白，對細胞的增殖、凋亡以及分化產(chǎn)生影響，起到原癌基因、抑癌基因的效果，miRNA調(diào)控異常會促進腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移[5-6]。miR-21主要定位于跨膜蛋白基因編碼區(qū)域中，轉(zhuǎn)錄后對相關(guān)基因具有負調(diào)控作用。Wang等[7]報道，胰腺癌細胞促進腫瘤相關(guān)成纖維細胞miR-21表達，miR-21的過表達會加速癌細胞的侵襲，而沉默miR-21表達可抑制癌細胞的侵襲。Alemar等[8]指出，將抗miR-21的慢病毒質(zhì)粒注入胰腺癌細胞株中，能抑制胰腺癌細胞的增殖能力，且呈時間依賴性，其中下調(diào)miR-21能有效地抑制胰腺癌細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，沉默miR-21能抑制PANC1細胞增殖，與上述研究結(jié)果一致；同時沉默miR-21能促進胰腺癌PANC1細胞凋亡，抑制癌細胞的侵襲及遷移能力。

PDCD4通過抑癌基因途徑參與細胞凋亡過程，其抑癌機制為：(1)PDCD4是miR-21下游的一種靶基因，受miR-21負向調(diào)控。文獻報道，miR-21-5p可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制PDCD4的表達，從而促進胃癌細胞的增殖能力，誘導(dǎo)胃癌細胞對順鉑耐藥[9-10]。王子安等[11]報道，轉(zhuǎn)染miR-21-5p抑制劑至胃癌耐藥細胞，PDCD4基因的表達上調(diào)，對順鉑的敏感性顯著升高，表明miR-21-5p能促進腫瘤細胞的耐藥。(2)miR-21通過與PDCD4 mRNA的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，降解mRNA或抑制mRNA翻譯蛋白，參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[12]。本文研究結(jié)果顯示，沉默組PDCD4表達上調(diào)，進一步佐證了miR-21對PDCD4存在靶向負調(diào)控作用，與Abdulhussain等[13]研究一致。

VEGF能促進血管內(nèi)皮細胞增殖和毛細血管形成，提高微血管通透性，促進腫瘤發(fā)生和生長[14]。PTEN蛋白可抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，誘導(dǎo)細胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示，沉默組PTEN表達上調(diào)，VEGF、survivin表達下調(diào)，提示沉默miR-21能抑制survivin、VEGF表達，促進PTEN蛋白表達上調(diào)，miR-21可能通過抑制survivin對VEGF的正向調(diào)控，增強PTEN對VEGF的負向調(diào)節(jié)，進而抑制腫瘤血管產(chǎn)生，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[16]。MMPs在腫瘤惡變過程扮演重要角色，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中研究較為熱門的兩種蛋白。張小博等[17]研究認為，MMP-2酶原激活后又可激活MMP-9，促進正反饋回路形成，參與惡性腫瘤擴散。Luo等[18]、張淑紅[19]研究指出，PDCD4通過抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)基因VEGF、MMP-9的表達從而抑制肝癌細胞活力和遷徙及侵襲能力，促進肝癌細胞凋亡。本研究結(jié)果也顯示，沉默組PDCD4表達增高，而MMP-2、MMP-9表達相應(yīng)降低，提示沉默miR-21可通過增加PDCD4表達，抑制MMP-2、MMP-9表達而抑制胰腺癌細胞侵襲和遷移。

綜上所述，沉默miR-21能上調(diào)PDCD4表達，進而調(diào)控PTEN、VEGF、survivin、MMP-9、MMP-2表達，抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，促進癌細胞凋亡。PDCD4作為miR-21的調(diào)控因子，為胰腺癌靶向治療提供新的研究方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突