基于全基因序列的中國北方3省(區(qū))馬鈴薯Y病毒遺傳多樣性分析

馬俊豐　李小宇　張春雨　周雪平　王永志

摘要 本研究以馬鈴薯Y病毒（PVY）全基因組為基礎，分析吉林、黑龍江和內蒙古3?。▍^(qū)）PVY群體遺傳多樣性和群體分化，并評估突變、重組、選擇等遺傳力所起的作用。根據已報道的PVY全基因序列保守區(qū)設計4對引物，采用片段重疊法對來自內蒙古和吉林的24個PVY分離物全基因序列進行測定，并聯(lián)合NCBI中已登錄的9個黑龍江分離物全基因組序列進行遺傳多樣性參數(shù)評估、群體分化檢驗和分子變異等分析。結果顯示，我國北方3?。▍^(qū)）PVY群體遺傳多樣性高，其中內蒙古和黑龍江PVY群體遺傳多樣性高于吉林群體，并且3個群體之間呈現(xiàn)一定程度的遺傳分化。分子變異分析發(fā)現(xiàn)在PVY基因組中存在1 786個變異位點，表明我國北方3?。▍^(qū)）PVY群體變異程度較高，并且這種高變異度有85.54%來自各個馬鈴薯種植區(qū)內PVY個體的遺傳變異。重組分析和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，我國北方3?。▍^(qū)）PVY群體中重組株系占比高達90.3%，并具有明顯的株系多樣性，表明PVY重組株系已成為我國北方3?。▍^(qū)）馬鈴薯種植區(qū)的流行株系。選擇壓力分析顯示，使用FEL和IFEL法分別檢測出501個和315個凈化壓力選擇位點，這表明3?。▍^(qū)）PVY群體受凈化選擇壓力為主。以上結果表明，中國北方3?。▍^(qū)）PVY群體遺傳多樣性高，突變、重組和自然選擇都對遺傳多樣性和群體分化存在一定影響。

關鍵詞 馬鈴薯Y病毒（PVY）; 遺傳多樣性; 基因組序列

中圖分類號：

S 432.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019571

Genetic diversity analysis of Potato virus Y in three provinces of north China based on the full genomic sequences

MA Junfeng1， LI Xiaoyu1， ZHANG Chunyu1， ZHOU Xueping2， WANG Yongzhi1， 2*

（1. Institute of Plant Protection， Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China;

2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Complete genome sequences of Potato virus Y （PVY） from three provinces （Jilin， Heilongjiang and Inner Mongolia） of north China were used to investigate its genetic diversity and population differentiation. Meanwhile， the effects of mutations， recombination and selection on population genetic dynamics were evaluated. The complete genomes of 24 PVY isolates from Jilin and Inner Mongolia were amplified and sequenced using 4 pairs of primers designed according to the conserved regions of the reported PVY isolates， and were then combined with complete genome sequences of 9 Heilongjiang isolates for estimation of genetic variation， population differentiation， molecular variation， etc. The genetic diversity of the PVY populations in the three provinces was high. Furthermore， the genetic diversities of PVY isolates from Heilongjiang and Inner Mongolia were higher than that of PVY from Jilin and there was a certain degree of genetic differentiation among the three populations. Analysis of molecular variation revealed that there were 1 786 mutation sites in PVY genomes， which indicated that the degree of variation in PVY populations in the three provinces was high; 85.54% of the variation was from individuals of different potato planting areas. Recombination and phylogenetic analysis showed that 90.3% strains were recombinant and there was obvious strain diversity in the PVY populations， indicating that the recombinant strains had become the epidemic strain in the potato cropping regions of the three provinces. Totally 501 and 315 purifying selection sites were detected by using FEL and IFEL methods， respectively， suggesting that the PVY populations in the three provinces were mainly affected by purifying selection pressure. In summary， the PVY populations in the three provinces of northern China had high genetic diversity， and mutations， recombination and selection all contributed to the genetic diversity and population differentiation.

Key words

Potato virus Y（PVY）; genetic diversity; genome sequence

馬鈴薯病毒是危害馬鈴薯的主要病原物之一，已有報道顯示，世界范圍內能夠侵染馬鈴薯的病毒至少有53種，其中10種已在我國被發(fā)現(xiàn)[1]。在我國已經發(fā)現(xiàn)的10種病毒中，馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）發(fā)生范圍最廣，造成經濟損失最為嚴重。近些年在我國多個馬鈴薯種植區(qū)檢測到PVY[2-7]。PVY侵染馬鈴薯可引起葉脈壞死、葉面黃化褪綠、塊莖環(huán)斑壞死等癥狀，導致馬鈴薯種質退化，產量降低，給馬鈴薯的生產造成嚴重損失[8-10]。

PVY是馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus代表成員，其病毒粒體呈彎曲線狀，每個病毒粒體包含一套完整的基因組。該基因組由正義單鏈RNA構成，長約9.7 kb，包含一個大的開放閱讀框（open reading frame， ORF），兩端含有非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs）?；蚪M翻譯時，開放閱讀框先編碼一個多聚蛋白（polyprotein），隨后再通過自身編碼的3個蛋白酶將多聚蛋白切割加工為P1、HC-Pro、P3等10個成熟蛋白[11]。除此之外，PVY基因組內還有一個通過移碼翻譯產生的蛋白——PIPO，該蛋白與P3蛋白的N′端以P3N-PIPO融合形式存在[12]。最終，PVY基因組通過這兩種方式生成11個成熟的多功能蛋白，使整個基因組呈現(xiàn)不同程度的遺傳多樣性。

近些年，PVY呈高變異、多株系發(fā)展趨勢，因此，PVY研究已不局限在分子檢測、株系鑒定、蛋白質功能驗證等方面[13-17]，遺傳變異及分子進化已成為新的研究方向。已有工作主要是選擇其中1～2個功能基因研究PVY的遺傳多樣性[18-20]，不能全面地反映PVY進化和遺傳機制。因此，本研究通過擴增、克隆等手段獲得吉林（JL）和內蒙古（NMG）PVY分離物全基因組序列24條，并聯(lián)合GenBank中已提交的9條黑龍江（HLJ）分離物的全基因組序列進行序列比對分析、遺傳多樣性參數(shù)評估及群體分化檢驗等一系列分析，旨在基于全基因組序列更為準確地探明我國北方3省（區(qū)）PVY群體遺傳多樣性及進化機制。該研究結果將有助于了解我國北方地區(qū)PVY的發(fā)生、流行及變異趨勢，為其有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 毒源

2017年—2018年從吉林、內蒙古馬鈴薯種植區(qū)，用隨機抽樣法采集帶有花葉、褪綠和壞死等典型病毒癥狀的馬鈴薯葉片。先采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢驗病毒，之后對病毒CP基因進行擴增，將確定為PVY分離物的葉片密封保存在-80℃超低溫冰箱中。

1.2 主要試劑

RNeasy Plant Mini Kit，QIAGEN公司;ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit，賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）;TaKaRa LA Taq、pMD18-T Vector Cloning Kit、DNA Marker，寶生物工程有限公司;AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，愛思進生物技術公司（Axygen）。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA提取及基因克隆

按照RNeasy Plant Mini Kit說明書，從感染PVY的馬鈴薯葉片中提取總RNA。以提取的葉片總RNA為模板，以OligodT為引物，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。根據GenBank中已提交的PVY不同分離物基因組序列的保守區(qū)，設計用于擴增PVY全基因序列的簡并引物和特異性引物（表1）。引物委托吉林省庫美生物科技有限公司合成。

PCR擴增采用50 μL反應體系：TaKaRa LATaq （5 U/L）0.5 μL、10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Plus）5 μL、dNTP mixture 5 μL、cDNA 1 μL、正、反向引物（10 μmol/L）各 1 μL、超純水36.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度視基因片段而定），72℃延伸若干分鐘（延伸時間按1 kb/min計算），共30個循環(huán);最后72℃再延伸10 min。

取4 μL PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。檢測后切取目的條帶，利用膠回收試劑盒進行純化，純化產物分別與pMD18-T載體連接，連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。經菌液PCR驗證后篩選出陽性克隆，隨機選取3～5個陽性克隆，委托吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，并通過測序峰圖及序列比對排除PCR過程中可能引起的突變。

1.3.2 序列處理

測序獲得的吉林和內蒙古PVY分離物各序列片段使用DNAMAN 6.0軟件進行拼接，并通過PVY參考序列（GenBank登錄號為NC_001616）進行校正。校正時先使用MEGA 6.0軟件中的Muscle程序對PVY全基因組序列進行多重比對，之后使用Muscle（codon）程序對PVY基因組編碼區(qū)進行比對，最后將編碼區(qū)翻譯為相應的氨基酸序列，進行人工校正，以確?；蚪M序列的準確性。試驗所用的黑龍江PVY分離物基因組序列均為NCBI中已登錄的序列（序列名稱及登錄號見圖1）。最終用于本試驗研究的PVY全基因組序列共33條。

1.3.3 遺傳多樣性參數(shù)評估及群體分化檢驗

使用DnaSP 5.10軟件計算遺傳多樣性參數(shù)：多態(tài)性位點數(shù)目（segregating sits， S）、單倍型數(shù)目（number of haplotypes， h）、單倍型多樣性（haplotype diversity， Hd）、核苷酸差異平均數(shù)（average number of nucleotide differences， k）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity， Pi）。使用Arlequin 3.5軟件計算群體分化系數(shù)（fixation index， Fst）并根據Fst值的大小判斷群體間分化程度。當00.25時，群體嚴重分化。群體間遺傳分化顯著水平采用Kst、Z、Snn[21-22]3種獨立統(tǒng)計方法進行檢驗，并通過排列檢驗法（1 000 permutations）進行判斷。

1.3.4 PVY基因組的分子變異

以PVY全基因組序列為分子標記，利用Arlequin 3.5軟件進行不同群體的分子變異分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。使用DnaSP 5.10軟件進行變異位點分析。在網站http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/上進行序列一致性分析。

1.3.5 PVY基因組的重組

以PVYO株系分離物Oz（EF026074）和PVYN株系分離物Mont（AY884983）作為親本，使用SimPlot 3.5軟件進行重組分析。同時在網站（http：∥www.datamonkey.org）使用遺傳算法中的重組檢測法（genetic algorithm recombination detection，GARD）[23]進行重組位點檢測及可靠性評估。

1.3.6 壓力分析

使用在線網站（http：∥www.datamonkey.org），基于密碼子，通過IFEL（internal branches fixed-effects likelihood）、FEL（fixed effects likelihood）、MEME（mixed effects model of evolution）3種不同方法，對PVY基因組進行壓力檢測及統(tǒng)計檢驗。壓力選擇方向根據非同義核苷酸替換速率（dN）與同義核苷酸替換速率（dS）比值（ω=dN/dS）大小進行判斷。當ω>1且群體差異顯著時，說明基因組受到正向選擇（positive selection）作用;當0<ω<1時，說明基因組受到凈化選擇（purifying selection）作用;當ω=1時，基因組不受壓力選擇[24]。

1.3.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用最大似然法（maximum likelihood， ML）基于全基因組序列編碼區(qū)（coding sequence， CDs）核苷酸序列構建PVY系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹前，使用MAFFT軟件對建樹的33條PVY編碼區(qū)核苷酸序列進行多重比對，并使用DAMBE軟件檢測核苷酸替換是否飽和，之后利用MEGA 6.0軟件選擇最優(yōu)化的核苷酸替換模型，并參照BIC（Bayesian information criterion）標準設置相應參數(shù)，最后通過1 000次自舉（bootstrap）抽樣來對各分支節(jié)點的置信值進行評估。

2 結果與分析

2.1 全基因組序列特征

本研究共獲得24個PVY分離物全基因組序列（9 698 nt或9 699 nt），5′非編碼區(qū)長度為184 nt或185 nt，3′非編碼區(qū)長度為328 nt，編碼區(qū)長度為9 186 nt;其中在編碼區(qū)部分，大開放閱讀框對應的多聚蛋白編碼序列長度為9 186 nt，編碼一個包含3 061個氨基酸殘基的多聚蛋白;小開放閱讀框對應的蛋白PIPO編碼序列長度為195 nt或228 nt，并通過移碼翻譯編碼一個包含65或76個氨基酸殘基的蛋白PIPO（表2）。

2.2 遺傳多樣性參數(shù)評估及群體分化檢驗

PVY基因組遺傳多樣性參數(shù)如表3所示：3個群體的多態(tài)性位點數(shù)目（S）表現(xiàn)出一定差異，其中黑龍江和內蒙古群體S值相對較大，多態(tài)性位點數(shù)目分別為1 232個和1 229個，吉林群體相對較小，多態(tài)性位點數(shù)目為807個;核苷酸差異平均數(shù)（k）方面，黑龍江和內蒙古群體k值較大，分別為491.361和526.933，吉林群體k值較小為249.659;單倍型多樣性（Hd）方面，3個群體Hd值均為1，大于0.5，且33個分離物中共發(fā)現(xiàn)33種單倍型（h），未出現(xiàn)兩條完全一致的序列，各個群體均表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性;核苷酸多樣性方面（Pi），3個群體的Pi值分別為0.050 61、0.025 72、0.054 29，均大于0.005，表明3個群體均具有較高的核苷酸多樣性。以上數(shù)據表明我國北方3省（區(qū)）PVY群體遺傳多樣性高，且黑龍江和內蒙古PVY群體遺傳多樣性高于吉林群體。

以PVY基因組為分子標記，黑龍江和吉林PVY群體之間Fst值為0.051 71，Z統(tǒng)計顯著，Kst和Snn值統(tǒng)計不顯著，表明在黑龍江和吉林種植區(qū)的PVY群體間呈現(xiàn)中度分化但差異不顯著;黑龍江和內蒙古，群體之間Fst值為0.072 52，Z、Kst和Snn統(tǒng)計均不顯著，表明黑龍江和內蒙古種植區(qū)的PVY群體呈現(xiàn)中度分化，但差異不顯著;吉林和內蒙古群體之間Fst值為0.233 52，Kst統(tǒng)計顯著，Z統(tǒng)計極顯著，Snn統(tǒng)計不顯著，表明吉林和內蒙古種植區(qū)的PVY群體呈現(xiàn)高度分化且差異顯著（表4）。

2.3 分子變異分析

全基因組序列一致性比對分析結果顯示，本研究獲得的24個分離物之間核苷酸一致性為90.3%～99.0%，氨基酸一致性為99.0%～100%，進一步與NCBI中已登錄的9個黑龍江PVY分離物比對發(fā)現(xiàn)，核苷酸一致性在89.3%～99.5%之間，氨基酸一致性在98.6%～100%之間。綜上所述，本次研究3個群體之間核苷酸一致性為89.3%～99.5%，氨基酸一致性為98.6%～100%。

突變位點分析發(fā)現(xiàn)，3個群體PVY全基因組多態(tài)性位點（polymorphic sites）共1 786個，其中單一變異位點（singleton variable sites）450個，簡約信息位點（parsimony informative sites）1 336個，表明PVY基因組存在較高程度的變異。

以PVY基因組為基礎，AMOVA分析結果如表5所示，14.46%的變異來自群體間，85.54%的變異來自群體內，因此不同種植區(qū)PVY群體之間的遺傳變異主要來自各個種植區(qū)內PVY個體的遺傳變異。

2.4 重組分析

使用Simplot軟件分析發(fā)現(xiàn)，33個PVY分離物中有30個檢測到潛在重組信號，約占分離物總數(shù)的90.3%，并且所有檢測到的重組分離物均為N×O重組類型。吉林和黑龍江PVY群體分離物均存在重組，而內蒙古PVY群體存在3個O株系非重組分離物。進一步通過GARD程序確認，3個群體存在4個或5個重組位點，每個重組位點都具有較高的模型支持率，且KH檢驗均達到顯著水平（表6）。

2.5 選擇壓力分析

PVY全基因組選擇壓力分析顯示（表7），使用FEL、IFEL、MEME 3種檢測方法均檢測到大量選擇壓力位點，在3個群體中利用FEL和IFEL法分別檢測出501個和315個凈化選擇位點，但僅檢測出9個和12個正向選擇位點;使用MEME法檢測出43個正向選擇位點。而以上3種方法共同檢測出6個正向選擇位點，且這些位點均顯著（表8）。以上結果表明盡管PVY基因組受凈化選擇壓力為主，但基因組中也存在個別密碼子位點受到強烈的正向選擇壓力。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

建樹序列多重比對后長度為9 186 nt，根據MEGA 6.0軟件的BIC標準，建樹序列最合適的核苷酸替換模型為GTR+I+G。ML法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。從圖中可以看出3?。▍^(qū)）PVY分離物并未以地區(qū)為標準相聚成簇，因此北方3省（區(qū)）PVY分離物在系統(tǒng)發(fā)育關系上與地理分布無顯著聯(lián)系。根據Chang等[25]的研究結果，以PVY基因組編碼區(qū)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，相同株系的分離物會相聚成簇，表現(xiàn)出明顯的株系特異性，因此，本研究中33個PVY分離物是以不同株系類型為標準相聚成簇，由此可以看出北方3?。▍^(qū)）的PVY群體具有較為明顯的株系多樣性。

3 討論

遺傳多樣性是體現(xiàn)病原物群體對環(huán)境適應力的一項重要指標，是突變、基因重組、基因流（基因遷移）、隨機漂變和自然選擇5種遺傳力長期相互作用的結果。遺傳多樣性直接影響著病原物群體的進化潛力。高遺傳多樣性的病原物具有更強的生存和進化優(yōu)勢，能更快適應新的寄主和生存環(huán)境[26]。開展病原物遺傳多樣性及群體分化研究有助于了解植物病原物的發(fā)生規(guī)律，流行機制，并為相關病害的監(jiān)測及防控提供理論依據。

中國北方3省（區(qū)）PVY遺傳多樣性參數(shù)結果表明，黑龍江、吉林和內蒙古3?。▍^(qū)）PVY群體遺傳多樣性高，與前人研究結果一致，符合中國PVY群體遺傳多樣性高的特征[27-28]。3?。▍^(qū)）的馬鈴薯種植區(qū)存在一定程度的種薯調運，這會導致不同種植區(qū)間PVY群體的二次接觸，從而造成高遺傳多樣性。此外，種群內這種高遺傳多樣性的形成是一個長期過程，本次研究的3個?。▍^(qū)）PVY群體基因組單倍型多樣性（Hd）均大于0.5，核苷酸多樣性（Pi）均大于0.005，且兩兩種植區(qū)之間PVY群體呈現(xiàn)一定程度的群體分化，表明3?。▍^(qū)）PVY群體是由一個相對較大且穩(wěn)定的群體經過長期演化所形成的。

PVY具有高度變異性，而突變在PVY的遺傳變異過程中起到重要作用。PVY是RNA病毒，其依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRp）缺乏校正功能，會在復制過程中產生大量的點突變[29]，在所產生的突變中有利突變會被逐漸積累，而有害突變則在自然選擇過程中被逐漸淘汰，由此突變常被視作推動PVY進化的原始動力。本試驗基于PVY全基因序列發(fā)現(xiàn)了大量變異位點，表明我國北方3?。▍^(qū)）PVY群體存在較高程度的變異。AMOVA分析結果顯示3?。▍^(qū)）PVY群體之間的遺傳變異主要來自各個種植區(qū)內PVY個體的遺傳變異。在序列一致性方面，3個PVY群體之間的核苷酸一致性為89.3%～99.5%，符合同一種病毒全基因序列一致性不低于85.0%的標準[11]。

基因重組同樣是PVY遺傳變異的主要驅動力，在PVY群體中發(fā)揮著重要的作用。已經確認的重組位點主要集中在P1、HC-Pro/P3、VPg、NIb和CP基因區(qū)域[30-32]。本試驗3個PVY群體中均檢測出大量的重組分離物，并且3個PVY群體中都存在著多個重組位點，表明相較于基因突變，基因重組可能是PVY進化過程中更為重要的機制，因為重組產生的遺傳變異遠比僅由突變造成的變異更快、更頻繁[33]。常飛等在進行PVY群體遺傳分析時并未檢測到重組信號[28]，原因是選用的P3和PIPO基因位于PVY基因組的非重組區(qū)域，因此基于全基因序列的重組分析可以更準確的了解PVY群體的重組狀況。此外PVY N×O重組分離物的大量發(fā)現(xiàn)也表明此類型重組株系已成為北方3省（區(qū)）馬鈴薯種植區(qū)的主流株系。而PVY重組株系的頻繁發(fā)生可以歸納于以下兩點：一是重組分離物相較于非重組分離物有著更強的致病性;二是重組分離物兼具非重組分離物的適應性優(yōu)勢，可以快速適應環(huán)境變化，并發(fā)展為優(yōu)勢株系[10， 34]。因此，在生產上需密切關注重組株系的流行趨勢。

選擇壓力分析中，中國北方3省（區(qū)）PVY群體基因組凈化選擇位點遠高于正向選擇位點，表明PVY基因組中多數(shù)位點的突變是有害的，在進化過程中這些有害突變會被剔除，從而保證PVY各個基因發(fā)揮正常功能。而采用3種方法共同檢測到6個顯著的正向選擇壓力位點，表明PVY基因組中存在個別位點的突變是有利于該病毒生存競爭的，在遺傳進化過程中這些有利突變會被不斷積累。

CP和PIPO基因由于高度保守的特點，在進行Potyvirus病毒系統(tǒng)發(fā)育分析時，常被用以構建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]，但對于PVY等變異程度高，重組頻繁的病毒來說，單基因建樹不足以準確地反映同種病毒不同株系分離物之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，因此，以全基因組構建系統(tǒng)發(fā)育樹成為解決此類問題的有效方法[25，35]。本研究以我國北方3?。▍^(qū)）PVY分離物全基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，準確地反映出了PVY分離物的系統(tǒng)發(fā)育關系，為我國北方3?。▍^(qū)）PVY群體遺傳多樣性研究提供了準確數(shù)據。

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（責任編輯：田 喆）