田林　李昊璁　李江鵬　王大偉　李寧　宋英　劉曉輝

摘要 日照時長是調(diào)控季節(jié)性繁殖動物性腺功能的重要因子。長期處于繁殖抑制光周期相位中的動物，往往出現(xiàn)性腺功能恢復的現(xiàn)象，被稱為“光周期不應性”。布氏田鼠是嚴格的季節(jié)性繁殖鼠類，但是其光周期不應現(xiàn)象是否存在仍不明確。本研究對比了室內(nèi)秋季出生的雄鼠在長光照（16 h）、短光照（8 h）和自然光照條件下的體重、睪丸、儲精囊的重量，及糞便睪酮含量變化。結(jié)果表明，與長光照組相比，自然光照組和短光照組雄鼠性腺重量和睪酮含量在6周齡時被顯著抑制，而在6～24周齡增長迅速，至24周齡（春分左右）達到長光照組水平。這些結(jié)果說明，短光照可以顯著抑制雄性布氏田鼠性腺發(fā)育，但布氏田鼠存在光周期不應機制，在春季繁殖期到來前恢復性腺活性。

關(guān)鍵詞 布氏田鼠; 光周期; 光周期不應性; 性腺發(fā)育

中圖分類號：

S 443.3

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019279

A preliminary study on the photorefractoriness in male Brandts voles Lasiopodomys brandtii

TIAN Lin1， LI Haocong2， LI Jiangpeng2， WANG Dawei1*， LI Ning1， SONG Ying1， LIU Xiaohui1*

（1. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

2. Beijing No.5 High School， Beijing 100007， China）

Abstract

Photorefractoriness is characterized as the state of gonadal development that is insensitive to inhibitory photoperiods and triggers gonadal recrudescence in mammals. To study the photorefractoriness in Brandts voles （Lasiopodomys brandtii）， we analyzed the variations in the body weight， gonadal weight and testosterone level in feces along with the postnatal development of new-born males under long-day light （LD， 16 h light）， short-day light （SD， 8 h light） and natural photoperiod conditions from autumn to the following spring. Our results showed that the gonadal development of SD males was inhibited at the 6th postnatal week compared with that of LD males. The gonadal developmental rate of SD males was the highest during 6-24 postnatal weeks compared with the two other groups. SD males displayed a similar status as males under LD and natural photoperiod conditions around the vernal equinox （24 weeks）. These results indicate the existence of photorefractoriness in Brandts voles， which is an important mechanism for regulating individual reproductive states before the onset of LD condition in early spring.

Key words

Brandts voles; photoperiodism; photorefractoriness; gonadal development

光周期現(xiàn)象（photoperiodism）是指日照時長調(diào)節(jié)有機體產(chǎn)生季節(jié)性變化的現(xiàn)象，從單細胞藍藻到哺乳動物中的所有門類均有發(fā)生[1]。例如，植物開花、鳥類換羽與遷徙、動物的季節(jié)性繁殖等許多生理和行為現(xiàn)象都隨著日照時長而發(fā)生著變化。動物的季節(jié)性繁殖是一種典型的光周期現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為其繁殖過程被限制在每年特定時期出現(xiàn)[2-3]。對許多生活在高緯度地區(qū)的鼠類而言，春夏季（長光照，白晝>12 h）往往處于繁殖期，而秋冬季（短光照，白晝<12 h）則繁殖活性受到抑制[3-4]。而且，室內(nèi)光照控制試驗也證明，日照時長的長短可以調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖鼠類的繁殖活性。例如，短光照條件可抑制敘利亞倉鼠Mesocricetus auratus和黑線毛足鼠Phodopus sungorus的性腺功能，導致性腺萎縮，精子發(fā)育停止，甚至完全不育，而長光照則可使性腺恢復[2， 5-6]。因此，光周期是調(diào)節(jié)動物季節(jié)性繁殖最重要的環(huán)境因子之一[1-3，5-6]。

但是，動物對光周期的反應并不是一成不變的，在一些季節(jié)性繁殖的動物中還存在著光周期不應現(xiàn)象（photorefractoriness）。這是指動物長期處于繁殖抑制的光周期相位中時，其性腺活性從抑制狀態(tài)重新恢復的現(xiàn)象[7-10]。在自然狀態(tài)下，經(jīng)歷過秋冬季非繁殖期的性腺萎縮后，北方鼠類在冬末春初開始繁殖，這意味著其性腺恢復是在短光照相位中完成的[7-8];室內(nèi)光照控制試驗也表明，連續(xù)10周短光照處理后，雄性倉鼠睪丸從抑制狀態(tài)開始恢復，至28周時完全恢復正常功能[11]。光周期不應性的生態(tài)意義在于，鼠類在春季來臨之前可以提前恢復繁殖功能，為即將到來的繁殖期提前準備[12-13]。

布氏田鼠Lasiopodomys brandtii是一種嚴格季節(jié)性繁殖的鼠類，其繁殖期一般在早春（2月-3月）至秋季（8月-9月）[14]。前期研究表明，野生布氏田鼠的性腺重量具有顯著的季節(jié)差異，夏季為秋季的20倍以上[15]，性腺重量與糞便睪酮的高峰出現(xiàn)在全年日照時長最長的6月份[16]。室內(nèi)試驗表明，長光照下幼鼠性腺發(fā)育迅速，而短光照則起到顯著抑制作用[17]。這說明，布氏田鼠性腺發(fā)育對光周期長短非常敏感，但是對于其光周期不應現(xiàn)象目前尚無研究報道。因此，本研究以長期馴化的、仍保持季節(jié)性繁殖特征的布氏田鼠室內(nèi)種群為研究對象，以秋季自然光照下出生的雄鼠為對照，比較長光照（16 h白晝）和短光照（8 h白晝）兩種處理條件對雄鼠性腺發(fā)育的影響，并探討長期處于短光照處理中的雄鼠是否存在光周期不應現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用鼠來自中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所室內(nèi)長期飼養(yǎng)種群。建群親本于2007年捕自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟東烏珠穆沁旗（115°58′E，45°33′N），在室內(nèi)繁殖已超過10代。自然光照下飼養(yǎng)，以鋸末做墊料，溫度為（20±3）℃，相對濕度（50±20）%。所用飼料為成兔配合飼料（北京市房山希望飼料有限責任公司），食物和飲水保持充足供應。

1.2 光周期處理與試驗流程

試驗時期為2017年9月1日至2018年3月18日。2017年9月1日開始配對，1周后分別移入3個光周期中進行處理。光周期設置為：

1）長光照組（long-day light，LD），每天16 h光照，起始于上午4：00;

2）短光照組（short-day light，SD），每天8 h光照，光照起始時間上午8：00;

3）自然光照組（natural day light，ND），為北京地區(qū)自然光周期，日照時長為正余弦函數(shù)波動;試驗開始和結(jié)束均為12 h左右，最低點為9 h 20 min（冬至）（圖1）。

每組供試雄鼠來源于至少5對不同親本。在6周齡（初冬，11月6日-17日）、12周齡（冬至附近，12月18日-29日）、24周齡（春分附近，3月12日-23日）解剖，記錄體重、睪丸和儲精囊重量。同時，每窩選取1只雄鼠用于進行睪酮長期監(jiān)測，剪毛標記后在6、12、14、16、18、22、24周齡收集糞便，于-20℃保存至激素提取。發(fā)育增長率計算公式如下：

增長率=（監(jiān)測值-起始值）/起始值×100%。

1.3 激素提取及測定

糞便激素提取參照Wang等的方法[18]。首先，將糞便樣本在-40℃下真空凍干處理24 h以去除水分，每個樣本稱取100 mg±5 mg，放入5 mL收集管中，加入直徑4 mm鋼珠和1 mL蒸餾水，用組織破碎儀進行破碎（20 Hz，2 min）。然后，加入乙酸乙酯2 mL，經(jīng)漩渦振蕩10 s、超聲波處理3 min、搖床振蕩30 min（4℃，200 r/min），取出放入冰箱4℃靜置30 min后，用漩渦振蕩儀混勻后高速離心3 min（10 000 r/min）。最后，吸取1 mL上清液，過夜風干后置于-80℃保存至檢測。檢測前，向離心管中加入1 mL PBS溶液復溶，使用碘[125I]睪酮放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所）測定睪酮，符合批內(nèi)變異<10%，批間變異<15%。

睪酮含量=（睪酮濃度×1 mL）/糞便重量。

1.4 統(tǒng)計方法

使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。生理指標（體重、睪丸和儲精囊）重量采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行多重比較，兩點間差異性分析采用獨立樣本t檢驗。睪酮組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗數(shù)據(jù)，兩點間差異性分析采用非參數(shù)檢驗Mann-Whitney檢驗。顯著性水平設為P<0.05，極顯著水平設為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 長短光照對雄性布氏田鼠體重和性腺發(fā)育的影響

3組雄鼠體重發(fā)育（圖2a）呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，在6～24周內(nèi)均呈現(xiàn)顯著增加（One-way ANOVA，LD：df=2，F(xiàn)=6.060，P=0.011;SD：df=2，F(xiàn)=11.120，P=0.001;ND：df=2，F(xiàn)=18.829，P<0.001）。組內(nèi)發(fā)育分析表明，3組雄鼠在24周齡時體重均顯著高于6周齡和12周齡（LSD，P<0.05），這說明體重的增加主要發(fā)生在12～24周齡。3個光照處理組間分析表明，僅在6周齡時ND組顯著低于LD組（P=0.013），LD組和SD組間、ND組與SD組間并無顯著差異，這說明長短光照并不是影響雄鼠體重發(fā)育的關(guān)鍵因子。

睪丸發(fā)育（圖2b）在3組間表現(xiàn)出很大差異。在6～24周內(nèi)，LD組雄鼠睪丸重量無顯著變化（df=2，F(xiàn)=0.060，P=0.942），而SD組和ND組雄鼠則出現(xiàn)顯著增加（SD：df=2，F(xiàn)=6.462，P=0.008;ND：df=2，F(xiàn)=4.488，P=0.023）。組內(nèi)發(fā)育分析表明，LD組雄鼠睪丸重量在6周齡達到穩(wěn)定水平;SD組雄鼠睪丸重量在12周齡和24周齡之間差異顯著（P=0.047），而ND組雄鼠睪丸重量在6周齡和24周齡之間差異顯著（P=0.009）;這說明SD處理雄鼠的睪丸生長在12周齡之前緩慢，快速增長主要集中在12～24周齡內(nèi)，而ND組則呈現(xiàn)出較為平緩的增長趨勢。組間比較表明，LD組在6周齡睪丸即達到穩(wěn)定水平，且在3組中處于最高水平;SD組和ND組在6周齡時顯著低于長光照組，而12周齡和24周齡3組雄鼠間差異不顯著。這些結(jié)果說明，長光照下雄鼠睪丸在6周齡進入發(fā)育穩(wěn)定期，而短光照處理對雄鼠睪丸發(fā)育的抑制作用主要在6周齡之前，6～12周齡抑制作用減弱，而12～24周齡抑制作用不顯著。

儲精囊發(fā)育（圖2c）與睪丸重量類似，在3組間表現(xiàn)出很大差異。在6～24周內(nèi)，LD組雄鼠儲精囊重量無顯著變化（df=2，F(xiàn)=2.455，P=0.118），而SD組和ND組雄鼠則出現(xiàn)顯著增加（SD： df=2，F(xiàn)=8.382，P=0.003;ND： df=2，F(xiàn)=7.241，P=0.004）。組間發(fā)育比較表明，LD組雄鼠儲精囊重量雖未表現(xiàn)出顯著差異，但是6周齡時平均重量僅為12和24周齡的一半;SD組和ND組儲精囊重量趨勢一致，在6周齡和12周齡間均無顯著差異，而24周齡則出現(xiàn)顯著升高（P<0.05）。組間處理比較表明，LD組雄鼠儲精囊重量在6周齡和12周齡顯著高于SD組和ND組，在24周齡差異不顯著，SD組和LD組始終無顯著差異。這些結(jié)果說明，儲精囊發(fā)育要慢于睪丸，長光照雄鼠儲精囊發(fā)育在12周齡前完成，而短光照處理對雄鼠儲精囊發(fā)育的抑制作用可達12周齡，在12～24周齡之間失效。

發(fā)育增速以各自光周期條件下6周齡為初始值進行分析（圖3）。結(jié)果表明，在6～12周齡內(nèi)，3組雄鼠在體重、睪丸和儲精囊的發(fā)育增速無顯著差異（One-way ANOVA，體重：df=2，F(xiàn)=0.621，P=0.551;睪丸：df=2，F(xiàn)=2.060，P=0.162;儲精囊：df=2，F(xiàn)=1.317，P=0.297）。在12～24周齡內(nèi)，在體重上，SD組最高，LD組最低，SD組增速顯著高于LD組（t test：df=16，t=2.284，P=0.036）;在睪丸和儲精囊上，SD組增速顯著高于ND組（睪丸：df=11.018，t=3.376，P=0.006;儲精囊：df=9.507，t=4.117，P=0.002）和LD組（睪丸：df=9.619，t=4.773，P=0.001;儲精囊：df=9.011，t=4.717，P=0.001），LD組和ND組無顯著差異。

2.2 長短光照對雄性布氏田鼠糞便睪酮水平的影響

3組光周期處理雄鼠糞便睪酮變化趨勢與睪丸和儲精囊結(jié)果相似（圖4）。在6～24周齡內(nèi)，LD組雄鼠睪酮保持較高水平，且無顯著波動（Kruskal-Wallis：χ2=7.247，df=6，P=0.299）;而SD組和ND組雄鼠睪酮含量均出現(xiàn)顯著增加（SD，χ2=20.312，df=6，P=0.002;ND，χ2=16.014，df=6，P=0.014）;但是ND組雄鼠呈現(xiàn)出緩慢增加的趨勢，而SD組雄鼠在6周齡后卻呈現(xiàn)出了快速升高，并持續(xù)保持較高水平的趨勢。組間分析表明，在6周齡時，LD組雄鼠睪酮水平顯著高于SD組（Mann-Whitney：U=10.000，Z=-2.003，P=0.045）和ND組（Mann-Whitney：U=11.000，Z=-2.061，P=0.039）;而12～16周齡內(nèi)，SD組雄鼠睪酮水平顯著升高，與LD組水平相當，顯著高于ND組（12周齡：U=7.000，Z=-2.932，P=0.003;16周齡：U=13.000，Z=-2.614，P=0.009）;在18～24周齡，3組雄鼠睪酮水平無顯著差異。

以6周齡為初始值的糞便睪酮水平增速結(jié)果表明，在6～24周齡內(nèi)，LD和SD組雄鼠睪酮增長率無顯著變化（Kruskal-Wallis：LD，χ2=5.657，df=5，P=0.341;SD，χ2=6.042，df=5，P=0.302）;ND組雄鼠睪酮增長率出現(xiàn)顯著變化（χ2=11.654，df=5，P=0.040）。組間分析表明，在6～12周齡內(nèi)，SD組雄鼠睪酮增速顯著高于LD組（Mann-Whitney：U=2.000，Z=-2.635，P=0.008）和ND組（Mann-Whitney：U=10.000，Z=-2.666，P=0.008）;在12～24周內(nèi)，SD組睪酮增速均高于LD組和ND組，在14～16周內(nèi)SD組睪酮增速顯著高于LD和ND組（Mann-Whitney：U=6.000，Z=-2.475，P=0.013）和ND組（Mann-Whitney：U=14.000，Z=-2.531，P=0.011），在16～18周內(nèi)SD組睪酮增速顯著高于LD組（Mann-Whitney：U=5.000，Z=-2.593，P=0.010）（圖4b）。

以上結(jié)果表明，與LD組相比，SD組與ND組睪酮水平在0～6周齡處于受抑制狀態(tài)，LD組從6周齡睪酮水平進入穩(wěn)定期。6～12周齡期間，與ND組相比，SD組睪酮水平迅速提高，指示在這一時期SD組具有更高的繁殖活躍狀態(tài)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對布氏田鼠雄鼠性腺重量和糞便睪酮水平的監(jiān)測，對比分析了長光照、短光照和秋季自然光照對雄鼠出生后性腺發(fā)育模式的影響。結(jié)果表明，與長光照相比，短光照和秋季自然光照在6周齡前對雄鼠性腺起到明顯抑制作用;6周齡后，兩短光照組的抑制作用逐漸消失，而恒定短光照組呈現(xiàn)出更強的加速發(fā)育現(xiàn)象;至春季24周齡時，3種光照條件下雄鼠性腺均可達到性成熟狀態(tài)，由這些結(jié)果可以得出兩點結(jié)論：（1）光周期可以調(diào)控布氏田鼠出生后的性腺發(fā)育模式，呈現(xiàn)出長光照刺激、短光照抑制的特點;（2）長期（10周以上）的短光照處理不能持續(xù)抑制雄鼠的性腺活性，而呈現(xiàn)出對短光照不響應的特性。

光周期是季節(jié)性繁殖動物感知季節(jié)變化最重要的環(huán)境信號。許多研究表明，調(diào)整光周期長短可以調(diào)控許多小型鼠類的繁殖狀態(tài)，使之呈現(xiàn)出“夏季”繁殖活躍或“冬季”繁殖抑制的現(xiàn)象[3，12]。倉鼠類是研究光周期反應很好的模式動物：敘利亞倉鼠和西伯利亞倉鼠均呈現(xiàn)出長光照保持性腺活躍，而短光照抑制性腺功能的現(xiàn)象[2]。劉偉等對比長光照（14 h白晝）和短光照（10 h白晝）條件下出生的布氏田鼠發(fā)現(xiàn)，在60日齡時，長光照雄鼠的睪丸、附睪及儲精囊指數(shù)均顯著高于短光照雄鼠[19]。這一點在本研究同樣被證實：在出生后至12周齡（84日齡），短光照處理顯著抑制了雄鼠的睪丸和儲精囊發(fā)育，說明光周期在布氏田鼠出生后的性腺發(fā)育調(diào)控中具有重要作用，而且進一步說明了光周期對布氏田鼠性腺發(fā)育的影響效果可以持續(xù)更長（12周齡）。本研究所用的長短光周期比劉偉等采用的更長或更短，這可能是導致本研究中光周期效果更強的因素之一。

本研究的另一個結(jié)果是布氏田鼠中存在短光照不應現(xiàn)象。其表現(xiàn)為在12周至24周的短光照處理期間內(nèi)，雄鼠性腺發(fā)育不再受短光照抑制，至24周已恢復到與長光照相似水平。倉鼠類的光周期反應和短光照不應性主要在成年個體中表現(xiàn)。例如，雄性敘利亞倉鼠在短光照的0～10周內(nèi)性腺萎縮，但在28周恢復至與長光照（16 h白晝）下相似水平[14];雄性西伯利亞倉鼠則在短光照中16周后性腺開始恢復，至24周恢復至長光照水平[20]。我們之前在布氏田鼠成年鼠中未發(fā)現(xiàn)明顯的對長短光周期的響應（實驗室觀察，未發(fā)表數(shù)據(jù)），但是新生鼠卻對長短光照反應明顯，短光照處理可以顯著抑制其性腺發(fā)育至12周齡[17]。本研究則進一步發(fā)現(xiàn)了新生鼠性腺重量在12周齡后對短光照出現(xiàn)不應性反應，而睪酮水平則表明在6周齡～12周齡不應性已經(jīng)出現(xiàn)在激素水平。短光照不應性在固定短光照和自然漸變短光照中均可出現(xiàn)，固定短光照的睪酮水平要高于漸變短光照組，這可能是由于其早期抑制作用更強，而不應性表現(xiàn)更強所致[21]。短光照不應性的生態(tài)意義可能是為了保證季節(jié)性繁殖的動物在春季來臨前提前調(diào)整好自身的生理狀態(tài)，為繁殖做準備。在自然種群中，鼠類的繁殖行為和生理啟動的早晚受到諸多環(huán)境的影響，性腺功能恢復不僅與光周期相關(guān)，還與參與繁殖鼠的年齡結(jié)構(gòu)、貯草種類（營養(yǎng)狀況），甚至小地形微環(huán)境（雪被厚度、坡向等）有關(guān)[14，22-23]。

最新研究表明，鼠類光周期不應性的神經(jīng)內(nèi)分泌機制可能是垂體和下丘腦對長期短光照的響應模式改變導致，光響應基因發(fā)生了顯著改變。對于光周期信號響應，垂體中的促甲狀腺激素（TSH，thyroid stimulating hormone）和下丘腦第三腦室室管膜細胞中的2型和3型脫碘酶（DIO2和DIO3）非常敏感，被認為是解析和傳遞季節(jié)信號的關(guān)鍵物質(zhì)[2]。TSH和DIO2對性腺功能的活化和維持起促進作用，而DIO3則可能起到負向調(diào)節(jié)作用。Milesi等報道，在短光照不應性出現(xiàn)期間，雄性西伯利亞倉鼠的下丘腦中Dio3基因表達量的持續(xù)下降，下丘腦Dio2基因和垂體TSHβ（TSH的β亞基）基因的表達量持續(xù)上升[20]。我們對布氏田鼠野外種群的研究也表明，下丘腦Dio2和Dio3基因與光周期的自然變化和雄鼠的睪丸大小表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性，可能在其性腺的季節(jié)性變化中起到關(guān)鍵作用[16]。因此，垂體和下丘腦中的關(guān)鍵基因可能在布氏田鼠的光周期不應現(xiàn)象中起到關(guān)鍵性的調(diào)控作用。下一步應對光周期不應期間布氏田鼠的下丘腦基因進行檢測，以明確其神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控的分子機制。

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