張喜康，趙宇慧，劉 軍，李佩佩，馬 露，王 聰，王麗萍，劉敦華*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021）

枸杞（Lycium）屬于茄科（Solanaceae）枸杞屬（LyciumL.）的落葉灌木植物[1]，研究表明枸杞具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，除了可以正常食用之外，在中藥中的使用時(shí)間長達(dá)幾個(gè)世紀(jì)，屬于中國傳統(tǒng)藥食同源的食物[2-3]。其中寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）是唯一被載入《中國藥典》的品種[4]。枸杞中含有多種生物活性成分，主要有多糖、類胡蘿卜素、類黃酮、甜菜堿等[5]，其中最主要的活性物質(zhì)為枸杞多糖，是一種水溶性、以—O—連接的高分子糖蛋白[6]，大量研究表明，枸杞多糖可以補(bǔ)充腎臟和肝臟的陰虛[7-8]，抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等[9-11]，還參與免疫調(diào)節(jié)[12]、神經(jīng)保護(hù)、輻射防護(hù)[13]等。

近年來，國內(nèi)對枸杞多糖的研究多集中于測定枸杞干果粗多糖的含量、組成及解釋生理藥理功能和對枸杞粗多糖的活性評價(jià)，同時(shí)也取得了一定的成果。但關(guān)于枸杞在不同生長期的多糖動(dòng)態(tài)研究最近幾年才有所增多，有關(guān)枸杞不同成熟期的枸杞多糖系統(tǒng)的理化特性和結(jié)構(gòu)分析鮮見報(bào)道。房想[14]將不同生長期和成熟期的枸杞果實(shí)，即青果、黃果、頭茬果、普通夏果和秋果進(jìn)行干制后，對多糖進(jìn)行提取、純化，并測定含量和其單糖組成，結(jié)果顯示各個(gè)時(shí)期的多糖含量都是呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。朱彩平[15]對干燥的枸杞成熟果實(shí)的結(jié)構(gòu)和生物活性進(jìn)行了分析和評價(jià)，結(jié)果表明枸杞多糖中含有—COOH、—OH、—NH2，糖鏈中含有吡喃糖，有較長的側(cè)鏈和分支，不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，且呈松散的碎片聚集狀態(tài)。

本研究將枸杞整個(gè)發(fā)育成熟期分為5 個(gè)階段，即幼果期、青果期、黃變初期、黃變后期、盛果期，所用枸杞樣品分別是采集這5 個(gè)階段的枸杞鮮果，經(jīng)過多糖提取、除蛋白、純化得到提取率高且變化穩(wěn)定的酸性多糖，再通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、傅里葉紅外光譜儀、綜合熱力分析儀和掃描電子顯微鏡，分別測定各時(shí)期枸杞多糖的分子質(zhì)量、單糖組成、糖鏈結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)。旨在為研究不同生長期枸杞多糖更深層次的生理特性以及超微結(jié)構(gòu)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從寧夏銀川市西夏區(qū)同心北街枸杞種植園采摘5 a生寧杞1號(hào)枸杞，從開花到成熟，根據(jù)枸杞的生理生長變化共分為5 個(gè)階段進(jìn)行標(biāo)記采樣，分別是幼果期（7 d）、青果期（14 d）、黃變初期（21 d）、黃變后期（28 d）、紅果期（35 d）。田間收集的樣品迅速放到液氮中，送回實(shí)驗(yàn)室立即貯存至超低溫冰箱備用，樣品如圖1所示。

圖1 不同生長時(shí)期的枸杞Fig. 1 L. barbarum fruit at different growth stages

半乳糖醛酸（純度≥97%） 廣州市樂試生物科技有限公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BGZ-146電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；JDG-0.2T真空冷凍干燥機(jī) 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；BT-50EA蠕動(dòng)泵 重慶杰恒蠕動(dòng)泵有限公司；TH-300梯度混合器、BSZ-100自動(dòng)部份收集器 上海青浦滬西儀器廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；GCMS-QP2010 GC-MS聯(lián)用儀、LC-20A HPLC儀、RID-20A熒光檢測器 日本島津公司；JSM-7500F場發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社；SETARAM SETSYS16綜合熱分析儀 法國塞塔拉姆公司；Spectrum Two傅里葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；AR1500ex流變儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖理化測定

枸杞多糖的提取參考文獻(xiàn)[16]并稍作修改。Sevag法[17]脫蛋白，苯酚-硫酸法[18]測定枸杞多糖質(zhì)量濃度，樣品溶液中枸杞粗多糖含量按下式計(jì)算：

式中：ρ為多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；d為稀釋倍數(shù)；V為溶液體積/mL；m為原料干物質(zhì)/g。

硫酸-咔唑法[19]測定枸杞多糖中半乳糖醛酸含量，Bradford法[20]測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 枸杞多糖的分離與純化

DEAE-650M柱層析[21]對脫蛋白多糖進(jìn)行分離，苯酚-硫酸法在490 nm和紫外分光光度法在280 nm波長處隔管測定多糖溶液的吸光度，繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線合并同一色譜峰洗脫液，脫鹽后冷凍干燥，得到初步純化后產(chǎn)品。

用葡聚糖凝膠色譜柱[22]對枸杞多糖進(jìn)一步純化。苯酚-硫酸法在490 nm波長處測定多糖溶液的吸光度，繪制洗脫曲線。合并同一色譜峰洗脫液，冷凍干燥。

1.3.3 不同生長期枸杞多糖結(jié)構(gòu)分析

1.3.3.1 多糖分子質(zhì)量測定

將各單糖標(biāo)準(zhǔn)品分別配成0.01 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，枸杞多糖配成0.01 g/mL樣品溶液待用。色譜條件：流動(dòng)相是水，流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，色譜柱為Shodex 804HQ（300 mm×7.8 mm），柱溫30 ℃，Shodex RI-20A折光檢測器。

1.3.3.2 單糖組成分析

根據(jù)得到的多糖水解物[23]，采用三甲基硅烷化法衍生化單糖[24]，進(jìn)行GC-MS[25]鑒定。

GC條件：HP-5 MS氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣量0.3 μL，分流比30∶1，延遲時(shí)間3 min，進(jìn)口溫度230 ℃，檢測器溫度240 ℃，色譜柱采用程序升溫，起始溫度130 ℃，以3 ℃/min速率升至180 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。

1.3.3.3 傅里葉紅外光譜分析

枸杞多糖樣品用KBr壓片，在4 000～400 cm－1區(qū)間內(nèi)進(jìn)行掃描[26]。

1.3.3.4 熱重分析

用綜合熱分析儀測定，加熱速率100 ℃/min，測試范圍30～800 ℃，得到微分掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）、熱重分析（thermogravimetric，TG）曲線[27]。

1.3.3.5 多糖掃描電子顯微鏡的測定

取多糖樣品粘于樣品臺(tái)上，置于離子濺射儀中鍍一層導(dǎo)電金膜后，采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察[28]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖的理化性質(zhì)

2.1.1 枸杞不同生長期粗多糖含量測定結(jié)果

表1 枸杞在不同生長期粗多糖含量Table 1 Polysaccharide contents of L. barbarum fruit at different growth stages

由表1可知，在枸杞整個(gè)發(fā)育成熟過程中各個(gè)時(shí)期的粗多糖含量由大到小依次為21 d＞35 d＞14 d＞28 d＞7 d，變化范圍為34%～42%，整體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。7 d的糖含量最低，與其他各時(shí)期均有顯著差異（P＜0.05），7 ～21 d的粗多糖含量一直持續(xù)緩慢增加，并在第21天達(dá)到峰值，在這之后又開始逐漸降低，且降低的幅度大于增加的幅度，生長期為28 d的粗多糖含量甚至接近7 d，到成熟期時(shí)又出現(xiàn)上升的趨勢，含量僅次于積累高峰期，差異性也表明，21 d和35 d的粗多糖含量與其他3 個(gè)時(shí)期有極顯著差異（P＜0.01）。出現(xiàn)這種趨勢的原因是幼果期枸杞質(zhì)體中的多糖以淀粉形式存在，淀粉在枸杞整個(gè)發(fā)育成熟過程中的變化趨勢是先增加后降低，第14天時(shí)到達(dá)峰值，之后淀粉酶活性逐漸增強(qiáng)，淀粉顆粒大幅降解[29]，果實(shí)內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，但己糖逐漸被合成，所以枸杞多糖含量增幅較小，到達(dá)色變初期時(shí)，主要以能量代謝和糖代謝為主，所以此階段大量糖類物質(zhì)積累，多糖含量達(dá)到峰值，色變后期果實(shí)顏色葉綠素降解，類胡蘿卜素和花青素積累，糖作為色素合成的前期原料被大幅降解，因此多糖含量降低，隨后果實(shí)內(nèi)各種代謝產(chǎn)物被合成，轉(zhuǎn)化酶活性增強(qiáng)，將光合作用產(chǎn)生的蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖[30]，因此在成熟期時(shí)枸杞多糖含量又出現(xiàn)上升趨勢。

2.1.2 糖醛酸含量測定結(jié)果

表2 枸杞不同生長期糖醛酸含量Table 2 Uronic acid contents of L. barbarum fruit at different growth stages

糖醛酸是糖苷配基結(jié)合的糖醛酸苷形式或聚糖醛酸的形式成為果膠、半纖維素等細(xì)胞壁的主要成分，因此它的含量與果實(shí)質(zhì)地有緊密的聯(lián)系。由表2可知，枸杞不同生長期糖醛酸質(zhì)量濃度由高到低依次為14 d＞7 d＞21 d＞28 d＞35 d，變化范圍為3.0～5.5 mg/mL，整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。7～14 d糖醛酸含量緩慢增長，在第14天達(dá)到頂峰，之后又緩慢下降，21 d后出現(xiàn)快速下降的趨勢且色變初期之前的3 個(gè)階段與之后到成熟的兩個(gè)階段存在極顯著差異。青果期時(shí)，細(xì)胞間的黏著作用主要靠果膠維持，因此糖醛酸的含量會(huì)在第14天達(dá)到峰值，之后，隨著果實(shí)逐漸成熟，果膠脫酯降解，胞間膠黏作用降低，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)崩塌，果實(shí)軟化，導(dǎo)致糖醛酸含量急劇下降[31]。

2.1.3 蛋白含量測定結(jié)果

表3 枸杞不同生長期蛋白含量Table 3 Protein contents of L. barbarum fruit at different growth stages

由表3可知，不同生長期的枸杞可溶性蛋白含量從大到小依次為28 d＞35 d＞21 d＞14 d＞7 d，增長趨勢與多糖和糖醛酸含量一致，只是蛋白含量在第28天達(dá)到峰值，之前一直是緩慢增加，達(dá)到峰值后降低。研究表明隨著枸杞果實(shí)成熟，基質(zhì)聚糖會(huì)發(fā)生解聚，而擴(kuò)展蛋白會(huì)使解聚速率增加，從而加速果實(shí)軟化，同時(shí)，輔助蛋白作為在生物質(zhì)處理中潛在的輔助蛋白質(zhì)膨脹素，通過降低纖維素的結(jié)晶度，也能促進(jìn)果實(shí)軟化，因此蛋白含量在第28天達(dá)到最高，之后又降低[32]。

2.2 枸杞多糖的分離與純化

2.2.1 枸杞多糖的離子交換柱層析分離

圖2 DEAE-650M柱層析洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of polysaccharides from L. barbarum fruit at different growth stages by DEAE-650M column chromatography

分別用0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，以管數(shù)為橫坐標(biāo)、以吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，分別在280、490 nm波長處測其中蛋白質(zhì)、多糖的洗脫情況，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，經(jīng)該柱層析分離蛋白和多糖均可得到3 個(gè)峰，說明它們均由3 種不同的組分構(gòu)成，分別命名為1、2、3，其中多糖的峰形較蛋白對稱良好，蛋白的洗脫峰不是特別明顯，但依然可以看出5 個(gè)時(shí)期的蛋白和多糖幾乎在相同的位置出現(xiàn)峰，且峰的形狀相似，由此也可驗(yàn)證前面的枸杞多糖是一種蛋白聚糖，也說明采用的梯度洗脫液能較好分離枸杞多糖。同時(shí)根據(jù)洗脫時(shí)的離子強(qiáng)度可知，40 管以前出現(xiàn)的組分1為中性多糖，以后出現(xiàn)的兩種多糖組分2、3均為酸性多糖。

2.2.2 枸杞多糖的凝膠柱層析分離

圖3 組分2的凝膠柱層析Fig. 3 Elution curves of component 2 by gel column chromatography

枸杞多糖是一種酸性雜多糖，由于組分3的提取率相對較低，結(jié)構(gòu)分析效果差，且在枸杞整個(gè)發(fā)育階段變化不穩(wěn)定，所以最后將組分2經(jīng)過濃縮，脫鹽，凍干后進(jìn)行凝膠層析柱純化（后面全是針對組分2展開實(shí)驗(yàn)），如圖3所示。發(fā)現(xiàn)流出的曲線均呈單一對稱峰，說明已純化為相對分子質(zhì)量均一的多糖組分。

2.3 多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 不同生長期枸杞多糖分子質(zhì)量測定結(jié)果

結(jié)果測得各時(shí)期的分子質(zhì)量依次為10.23、10.59、35.85、6.52 、6.43 kDa，大約分布在6～40 kDa之間，分子質(zhì)量隨枸杞生長發(fā)育總體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，起初從幼果期到青果期的增幅不大，到第21天，分子質(zhì)量激增，并達(dá)到最高值，之后又急劇下降。

2.3.2 不同生長期枸杞多糖單糖組成分析結(jié)果

將各單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。將多糖水解樣品和單糖混合標(biāo)準(zhǔn)硅烷化后進(jìn)行GC-MS測定，單糖組成結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同生長期枸杞多糖單糖組成物質(zhì)的量比Fig. 4 Monosaccharide composition of polysaccharides from L. barbarum fruit at different growth stages

由圖4可以看到，各個(gè)時(shí)期7 種單糖的分布和變化情況，第14天這7 種單糖含量整體最高，其次是7 d，然后是35、21 d，含量最少的是在第28天，但28 d以甘露糖為主，且含量與7 d的持平，其中阿拉伯糖在7、14、21 d和35 d時(shí)期均占最大的比例，總體來說甘露糖、葡萄糖和核糖在各個(gè)時(shí)期含量均較小，從整個(gè)生長周期看，各單糖在升高至第14天時(shí)出現(xiàn)下降情況，第28天時(shí)又升高，基本遵循升高-降低-再升高的趨勢。

2.3.3 不同生長期枸杞多糖傅里葉紅外光譜測定結(jié)果

圖5 不同生長期枸杞多糖傅里葉紅外光譜圖Fig. 5 Infrared spectra of L. barbarum polysaccharides at different growth stages

研究表明在3 600～500 cm－1處具有多糖的特征吸收峰，由圖5可以看出，各個(gè)時(shí)期多糖的分子結(jié)構(gòu)相似，均在3 422.16 cm－1處出現(xiàn)寬而強(qiáng)的—OH伸縮振動(dòng)吸收峰，是多糖分子上的—OH，也包括分子內(nèi)或分子間氫鍵，2 914.91、2 836.11 cm－1為—CH2—或—CH3的C—H伸縮振動(dòng)，1 740.35 cm－1處有一明顯吸收峰，是醛基，為糖上的乙酰基，1 630.07、1 586.04 cm－1為—COOH的C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 365.25 cm－1為C—H的變形振動(dòng)吸收峰，和C—H的伸縮振動(dòng)都是糖類物質(zhì)的特征吸收峰，1 140.35 cm－1為C—O—C醚鍵C—O的伸縮振動(dòng)，1 016.42 cm－1處的吸收峰為吡喃糖苷，895.76 cm－1處為U-D吡喃糖特征吸收峰，由此可知是該純化后的多糖為β-吡喃型的酸性多糖，這也驗(yàn)證了離子交換柱層析分離時(shí)根據(jù)離子強(qiáng)度判斷組分2為酸性多糖。

2.3.4 不同生長時(shí)期枸杞多糖的熱特性

圖6 枸杞不同生長期的多糖熱分析Fig. 6 Thermal analysis of L. barbarum polysaccharides at different growth stages

如圖6所示，結(jié)合TG和DSC曲線可知，各個(gè)時(shí)期多糖均在390～500 ℃之間有一次大的質(zhì)量損失，在此溫度范圍之前和之后各個(gè)時(shí)期又略有不同，7、14、28、35 d多糖均在50～65 ℃之間有一次小的質(zhì)量損失，21 d多糖變化不明顯，這可能與實(shí)驗(yàn)過程中的操作有關(guān)系，這次質(zhì)量損失主要是水分的損失，其中7 d多糖在500 ℃以后也有質(zhì)量損失，21、28、35 d多糖在700 ℃以后都有較大的質(zhì)量損失，這主要是多糖結(jié)構(gòu)開始變化造成的損失。各個(gè)時(shí)期的放熱峰均集中在200～500 ℃之間，對應(yīng)的失重曲線均有較大變化，其中7 d多糖在500 ℃以后還有一個(gè)放熱峰，35 d多糖在700 ℃以后也存在一個(gè)放熱峰，吸熱峰大多集中在300～400 ℃之間，但7、14、28、35 d多糖均在60 ℃左右多一個(gè)吸熱峰，14、21、28、35 d多糖又在700 ℃以后還有吸熱峰。由此可知各個(gè)時(shí)期多糖的熱特性存在差異，但隨著枸杞不斷成熟，多糖開始降解，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這與前面的結(jié)論一致。

2.3.5 不同生長時(shí)期枸杞多糖掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果由圖7可知，多糖結(jié)構(gòu)在各個(gè)時(shí)期不同，隨著枸杞生長發(fā)育不斷變化，由最初的致密片層逐步變化至松散山峰狀直至完全崩塌。第7天時(shí)多糖的片層比較完整、致密，表面有卷曲狀，放大之后，多糖結(jié)構(gòu)呈卷曲狀緊緊的纏繞在一起，卷曲中間都有孔狀結(jié)構(gòu)，但表面平整，說明這個(gè)時(shí)期多糖結(jié)構(gòu)還很完整，第14天時(shí)多糖片狀表面出現(xiàn)大小不一的孔狀，高倍鏡下呈現(xiàn)的是一圓柱狀，表面致密，卷中孔狀縮小，即多糖結(jié)構(gòu)的分子間作用力逐漸增強(qiáng)，第21天時(shí)，明顯看到片層狀開始瓦解，形成的圓柱狀表面孔隙變大，開始松散，第28天時(shí)，表面片層結(jié)構(gòu)已消失，瓦解成山峰狀，高倍鏡下，表面結(jié)構(gòu)極其松散，柱狀結(jié)構(gòu)開始逐漸消失，到第35天時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)一步裂解，以小小的片狀聚集體存在。

圖7 不同生長時(shí)期枸杞多糖掃描電子顯微鏡Fig. 7 Scanning electron microscopy images of L. barbarum polysaccharides at different growth stages

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過傳統(tǒng)水提法、Sevag法提取各生長時(shí)期多糖并脫蛋白后測定粗多糖含量、糖醛酸含量及可溶性蛋白含量，結(jié)果表明它們都呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢，并采用離子交換柱對枸杞多糖進(jìn)行分離，最終各時(shí)期均得到3 種多糖，且都為蛋白聚糖，其中選取提取率高變化穩(wěn)定的酸性多糖2進(jìn)行凝膠層析柱純化，結(jié)果顯示均為單一對稱峰，分離良好。

HPLC結(jié)果顯示不同生長時(shí)期枸杞多糖均為小分子多糖，GC-MS結(jié)果顯示枸杞多糖主要由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖組成。傅里葉紅外光譜結(jié)果表明純化的枸杞多糖是β-吡喃型的酸性多糖。熱分析得知各個(gè)生長期的多糖熱特性相似又各有差異，整體可看作是有2 次質(zhì)量損失，先是水分脫出造成的，然后是多糖結(jié)構(gòu)裂解。掃描電子顯微鏡觀察多糖結(jié)構(gòu)在各個(gè)時(shí)期不同，由最初的致密片層逐步變化至松散山峰狀直至完全崩塌。這為將來研究枸杞多糖更深層次的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)提供理論參考價(jià)值。