殷夢舟，劉 瑩，張莉佳，王 益，黃 文*

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

茯苓皮為多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos(Schw.)Wolf）干燥的菌核外皮，2015版《中國藥典》中記載其味甘、淡、平，歸肺、脾、腎經(jīng)，有利水消腫的功效[1]，是一種常見的利尿中藥。茯苓皮作為茯苓加工過程的副產(chǎn)物，其利用率很低，甚至被作為下腳料廢棄。研究表明，茯苓皮與茯苓菌核中的成分存在顯著差異，茯苓多糖主要存在于茯苓菌核中，而三萜酸類化合物主要存在于茯苓皮中[2-4]。目前從茯苓皮中已經(jīng)分離出超過40 種三萜酸[5-6]。近年來的藥理研究表明，茯苓三萜酸類化合物藥理作用廣泛，具有抗腫瘤[7-9]、抗炎[10-11]、保肝[12]、利尿[13-14]等生理活性。

天然產(chǎn)物是新藥先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的重要資源之一[15]，而制備色譜技術(shù)是從天然產(chǎn)物中獲得大量高純度單體必不可少的方法，是對化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息和生化性質(zhì)研究的基礎(chǔ)。經(jīng)過100多年的發(fā)展，分離色譜技術(shù)已經(jīng)從薄層色譜、常壓柱色譜逐步發(fā)展到高壓柱色譜、逆流色譜等，成為了科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐中分離復(fù)雜組分的一種重要技術(shù)手段[16-17]。以茯苓皮三萜為例，三萜類化合物在茯苓皮中種類眾多，結(jié)構(gòu)相近，分離純化較為困難。胥秀英等[18]采用兩次硅膠柱層析，制備高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）純化的方法從茯苓皮中分離鑒定得到乙酰茯苓酸和豬苓酸C。楊丹等[19]使用硅膠柱色譜分兩步從茯苓皮的正丁醇萃取部位分離鑒定出9 種三萜類化合物。上述方法雖然可以實(shí)現(xiàn)茯苓皮中三萜類化合物的分離，但存在過程繁瑣，得率不高，溶劑消耗量大的缺點(diǎn)。

逆流色譜是由Ito等[20]在20世紀(jì)70年代早期發(fā)明一種基于液-液分配的色譜方法，它為分離純化方法提供了一種新的方法模式。與傳統(tǒng)以固體為載體的分離方法相比，逆流色譜克服了固體載體不可逆吸附的缺點(diǎn)，因此，樣品回收率得到很大提升。除此之外，逆流色譜還具有溶劑消耗少，對樣品顆粒度接受能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[21]。高速逆流色譜是由逆流色譜發(fā)展而來，與逆流色譜相比，其在分辨率、分離時間和樣品加載能力上都有了很大提升，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化。本實(shí)驗(yàn)利用高速逆流色譜技術(shù)，根據(jù)目標(biāo)化合物篩選所需溶劑系統(tǒng)，并對分離過程的流速、上樣量參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化以制備茯苓皮三萜酸類物質(zhì)，進(jìn)一步采用液相色譜、質(zhì)譜以及核磁共振對三萜類化合物進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果將為茯苓皮中三萜酸的高效制備提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓皮采自湖北咸寧；正丁醇、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、磷酸（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾科技有限公司；水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HPLC儀、超高液相色譜-離子淌度四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀、e2695二極管陣列檢測器 美國Waters公司；TBE-300C型高速逆流色譜儀 中國上海同田生化技術(shù)有限公司；AVANCE III HD 600 MHz核磁共振儀 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 茯苓皮乙酸乙酯萃取物的制備

茯苓皮洗凈烘干，用中藥粉碎機(jī)粉碎，稱取一定量茯苓皮粉于提取瓶中，按液料比30∶1（mL/g）加入正丁醇-水（3∶1，V/V）溶液于60 ℃回流提取1 h，過濾除去濾渣，分離濾液取正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到紅棕色浸膏。浸膏用蒸餾水懸浮，加入乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，低溫烘干得到乙酸乙酯萃取物，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HPLC測定條件

取一定量茯苓皮乙酸乙酯萃取物和高速逆流色譜分離樣品溶于色譜甲醇中，經(jīng)0.45 μm針頭過濾器過濾后進(jìn)行HPLC分析，采用面積歸一法確定化合物的純度。

HPLC檢測條件：InertSustainTMAQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為水（含0.05%磷酸），流動相B為甲醇；梯度洗脫：0～15 min，30%～25% A、70%～75% B；15～25 min，25%～21% A、75%～79% B；25～40 min，21%～10% A、79%～90% B；40～65 min，10% A、90% B。流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長242 nm，進(jìn)樣量10 μL；紫外光譜掃描范圍210～400 nm。

1.3.3 高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇

1.3.3.1 溶劑系統(tǒng)的確定

根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)，參考高速逆流色譜分離三萜類化合物溶劑系統(tǒng)的相關(guān)報道[22-23]，選擇不同比例的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察溶劑系統(tǒng)的分層時間、對目標(biāo)物質(zhì)的分配系數(shù)確定用于高速逆流色譜的溶劑系統(tǒng)。

1.3.3.2 溶劑系統(tǒng)上下相分層時間的測定

室溫下分別取上下相各5 mL于具塞試管中，將其倒轉(zhuǎn)5 次，使上下兩相充分混合后垂直置于桌面靜置分層，測定其兩相界面清晰的時間，重復(fù)測定3 次取平均值。

1.3.3.3 溶劑系統(tǒng)分配系數(shù)K的測定

取等體積充分平衡的溶劑系統(tǒng)上下相，加入少量茯苓皮乙酸乙酯萃取物，充分振蕩使樣品完全溶解在溶劑系統(tǒng)中；平衡后分離兩相，分別減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干溶劑，溶解在甲醇中通過HPLC分析。分配系數(shù)K值定義為目標(biāo)化合物在上相中的色譜峰面積（S上）與目標(biāo)化合物在下相中的色譜峰面積（S下）比，即K=S上/S下。

1.3.4 高速逆流色譜分離條件的確定

在高速逆流色譜分離過程中，溫度、主機(jī)轉(zhuǎn)速、進(jìn)樣量、流速等分離條件對化合物的分離效率均有影響。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，保持高速逆流色譜主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速800 r/min，根據(jù)在波長242 nm處采集分離圖譜進(jìn)一步考察流速（2、3、4 mL/min）和進(jìn)樣量（50、100、150 mg）對分離效率的影響，確定分離條件。

1.3.5 高速逆流色譜法分離制備茯苓皮中三萜類化合物

按一定比例配制正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水組成的兩相溶劑系統(tǒng)，在分液漏斗中充分振搖混合后靜置，分離出上下兩相，上相作為固定相，下相作為流動相，兩相超聲脫氣15 min，冷卻至室溫待用。以30 mL/min的流速將固定相泵入主機(jī)中，待出口流出20～50 mL液體后，啟動主機(jī)正轉(zhuǎn)，調(diào)整轉(zhuǎn)速為800 r/min，將檢測器波長設(shè)置為242 nm，同時開始以流速4 mL/min泵入流動相，待流動相流出主機(jī)，記錄流出的固定相體積，保留率按下式計算：

取一定量茯苓皮乙酸乙酯萃取物溶解于10 mL下相中，設(shè)定分離流速，待基線穩(wěn)定后由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，打開色譜工作站采集數(shù)據(jù)，收集各分離組分。

1.3.6 化合物鑒定

通過超高效液相色譜-離子淌度四極桿飛行時間質(zhì)譜、核磁共振氫譜（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）和核磁共振碳譜（13C nuclear magnetic resonance，13C NMR）對高速逆流色譜分離得到的化合物進(jìn)行鑒定。

超高效液相色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為水，流動相B為甲醇；梯度洗脫：0～7 min，44%～23% A、5 6%～7 7% B；7～1 4 m i n，2 3%～1 5% A、77%～85% B；14～24 min，15% A、85% B。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流速0.3 mL/min。

質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量600 L/h，毛細(xì)管電壓2.4 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z10～1 000，根據(jù)一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜得到化合物母離子和其他碎片離子的信息[24]。

核磁共振的樣品溶劑為氘代甲醇，譜圖數(shù)據(jù)采用Meatrenove 14.0進(jìn)行分析處理。通過上述數(shù)據(jù)與相關(guān)報道進(jìn)行比對，確定化合物的結(jié)構(gòu)，化合物的結(jié)構(gòu)式通過ChemDraw 16.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析

圖1 茯苓皮乙酸乙酯萃取物的HHPPLLCC圖Fig. 1 HPLC chromatogram of the EtOAc-soluble fraction of Poriae Cutis

由圖1可以看出，茯苓皮乙酸乙酯萃取物的化學(xué)成分比較復(fù)雜，為了方便后續(xù)溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化，選擇峰面積較大的5 個峰作為分離純化的目標(biāo)化合物，其保留時間分別為33.46、34.76、36.34、52.73、56.51 min。

2.2 高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇

高速逆流色譜的應(yīng)用中溶劑系統(tǒng)的選擇對于樣品中不同組分的分離具有決定性的作用，不同的溶劑系統(tǒng)由于極性、密度、黏度的不同都會對化合物的溶解性、分配能力產(chǎn)生影響。所選的溶劑系統(tǒng)應(yīng)滿足以下要求[25]：樣品可以穩(wěn)定的溶解在溶劑系統(tǒng)中；溶劑體系能形成穩(wěn)定的上下兩相，且體積比合適；溶劑系統(tǒng)能對目標(biāo)化合物提供合適的分配系數(shù)；固定相在兩相平衡中有較高的保留率?？紤]到目標(biāo)化合物的極性，按照1.3.3節(jié)方法分別測定3 種溶劑系統(tǒng)兩相分層時間以及對峰1～5五種化合物的分配系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1 茯苓皮提取物在不同溶劑體系中的分配系數(shù)Table 1 Partition coeffificients ( ) of the extract of Poriae Cutis in different two-phase solvent systems

在高速逆流色譜分離中，要獲得好的分離效果和較高的分離效率，一般要求溶劑系統(tǒng)的分層時間較短（小于30 s），固定相保留率在40%以上，溶劑系統(tǒng)對目標(biāo)化合物的分配系數(shù)在0.5～2之間比較合適[26]。由表1可知，3 種溶劑系統(tǒng)的分層時間都少于30 s。溶劑系統(tǒng)A對化合物1和3的分配系數(shù)小，而對化合物4和5的分配系數(shù)又過大，表明這些目標(biāo)化合物在溶劑系統(tǒng)中在某一相中溶解性較好，這不利于這些化合物的分離。C溶劑系統(tǒng)對化合物4和5的分配系數(shù)較大，使其較好地溶解在固定相中，分離時間長，不利于其分離。因此綜合考慮以上因素，選擇溶劑系統(tǒng)B作為本實(shí)驗(yàn)的高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)。

2.3 高速逆流色譜操作條件的選擇

在高速逆流色譜分離過程中，除溶劑系統(tǒng)外，分離條件也直接影響分離結(jié)果。在高速逆流色譜主機(jī)正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速800 r/min時，分別在不同流速（2、3、4 mL/min）和不同進(jìn)樣量（50、100、150 mg）條件下采集分離過程中波長242 nm處的色譜圖。比較分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加分離過程的流速可以縮短分離所需時間，當(dāng)流速達(dá)到4 mL/min時，峰III和峰IV的分離度較低，分離過程中可能會相互影響使分離得到的化合物純度不高，因此分離流速選擇3 mL/min。除此之外，進(jìn)樣量的增加使得各分離峰的峰面積增大，當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到150 mg時，出峰時間接近的峰III和峰IV相互重合，無法分離。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用高速逆流色譜分離操作條件進(jìn)樣量100 mg、流速3 mL/min，分離圖譜如圖2所示。

圖2 茯苓皮乙酸乙酯萃取物高速逆流色譜圖Fig. 2 HSCCC chromatograms of the EtOAc-soluble fraction of Poriae Cutis

2.4 高速逆流色譜分離結(jié)果

圖3 峰III（a）、峰IV（b）組分的HHPPLLCC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of eluate fractions III (a) and IV (b)

采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶6∶4∶2，V/V）的溶劑系統(tǒng)，按照優(yōu)化的分離操作條件進(jìn)行高速逆流色譜分離，平衡過程共流出固定相150 mL，該型儀器的總柱體積為300 mL，按1.3.5節(jié)方法計算保固定相保留率為50%。將峰I～I(xiàn)V對應(yīng)的組分進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果表明峰I和峰II的雜質(zhì)較多，三萜含量較少，沒有進(jìn)一步分析價值。峰III和峰IV三萜的純度較高，其保留時間和純度分別為：峰III，33.23 min，90%；峰IV，36.20 min，92%（圖3）。由對應(yīng)插圖可知，2 個色譜峰均在波長242 nm處有最大吸收，符合三萜類化合物的紫外吸收特征。

2.5 結(jié)構(gòu)表征

將高速逆流色譜分離得到的2 個組分進(jìn)行冷凍干燥后，得1號化合物5.2 mg（峰III）和2號化合物20.5 mg（峰IV）。經(jīng)超高液相色譜-離子淌度四極桿飛行時間質(zhì)譜、1H NMR和13C NMR鑒定1號化合物為茯苓酸B，2號化合物為茯苓酸A，如表2、3和圖4所示。

表2 化合物1的H NMR和13C NMR化學(xué)位移Table 2 H NMR and 13C NMR chemical shifts of compound 1

表3 化合物2的H NMR和13C NMR化學(xué)位移Table 3 H NMR and 13C NMR chemical shifts of compound 2

化合物1：白色無定型粉末（甲醇）?；衔镌谧贤夤庾V中的最大吸收波長為242 nm，ESI-MSm/z：483 [M－H]－，409 [M－CH3CH2COOH]－。如表2所示，1H NMR譜中δH 1.50、1.58、0.99、0.93、1.50、1.68為6 個甲基單峰質(zhì)子，δH 4.67、4.76為環(huán)外雙鍵質(zhì)子，δH 5.17、5.21為環(huán)內(nèi)雙鍵質(zhì)子，推測該化合物具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，δH 4.54為與羥基相連的碳原子上的質(zhì)子信號。13C NMR譜中共顯示30 個碳信號，δC 178.3、180.0為2 個羧基所在位置的碳信號，δC 119.0、120.7和142.3、138.3分別為2 個烯屬的次甲基和2 個烯屬季碳的共振信號，結(jié)合1H NMR譜信息推測該化合物為3,4-開環(huán)-羊毛甾-7,9(11)-二烯型三萜。綜合上述分析，與相關(guān)文獻(xiàn)[27-28]對照，鑒定化合物1為茯苓酸B。

圖4 茯苓酸A和茯苓酸B的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Chemical structure of poricoic acid A and poricoic acid B

化合物2：白色無定型粉末（甲醇）?；衔镌谧贤夤庾V中的最大吸收波長為242 nm，ESI-MS m/z：497 [M－H]－，423 [M－CH3CH2COOH]－。如表3所示，其數(shù)據(jù)與化合物1極為相似，推測化合物2與化合物1具有相同的骨架類型。13C NMR譜中數(shù)據(jù)與化合物1相比，δC 25 132.6向高場移至33.6，δC 24 124.9向低場移至155.3，同時由化合物2中δC 31 106.7推測其環(huán)外的雙鍵類型由化合物1中的24（25）型雙鍵變成24（31）型的雙鍵。以上數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)報道[29-30]對照基本一致，故鑒定化合物2為茯苓酸A。

3 結(jié) 論

茯苓皮作為茯苓加工的副產(chǎn)物，其中的活性成分三萜類化合物的總含量達(dá)到1.58%[31]，因此開發(fā)利用茯苓皮中的三萜類化合物具有重要意義。茯苓三萜分離制備的傳統(tǒng)方法主要依靠柱色譜、薄層色譜等方法相結(jié)合進(jìn)行反復(fù)的分離純化，鑒于這些方法存在步驟復(fù)雜，溶劑消耗量大，得率較低的缺點(diǎn)，有研究者采用高速逆流色譜技術(shù)分離茯苓中的三萜類化合物。王艷等[32]以大孔樹脂初分后茯苓皮乙醇提取物為樣品，利用高速逆流色譜在5 h內(nèi)分離得到了純度為98%的茯苓酸A；Dong Hongjing等[33]采用酸堿萃取的方法將茯苓醇提物分為兩部分進(jìn)行高速逆流色譜分離，分別在5 h和7 h內(nèi)共分離得到純度為80.1%到96.4%的6 種三萜酸組分。綜上，有關(guān)于高速逆流色譜分離茯苓皮中三萜類化合物的報道較少，尚缺少溶劑系統(tǒng)篩選、分離條件優(yōu)化以提高分離效率的報道。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高速逆流色譜從茯苓皮中分離出了2 種三萜類化合物茯苓酸A和茯苓酸B。高速逆流色譜的溶劑系統(tǒng)為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3∶6∶4∶2，V/V），分離條件為主機(jī)正轉(zhuǎn)、轉(zhuǎn)速800 r/min、進(jìn)樣量100 mg、流速3 mL/min，在3 h內(nèi)即完成分離。經(jīng)質(zhì)譜和核磁鑒定2 種組分分別為茯苓酸A和茯苓酸B，其純度分別達(dá)到92%和90%。本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速有效分離制備茯苓皮中茯苓酸A和茯苓酸B的高速逆流色譜方法，為進(jìn)一步研究茯苓中的化學(xué)成分、藥理活性及其有效成分的加工利用提供一定的理論基礎(chǔ)。