李煥敏，李新民，孫丹，韓耀巍，孫婷，律揚，陳鴻祥

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381)

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)為特征的異質(zhì)性疾病，臨床以反復(fù)發(fā)作的喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀為主要表現(xiàn)，常在夜間和/或凌晨發(fā)作或加劇。調(diào)查顯示，1990—2015年哮喘的患病率增加12.6%，占據(jù)1.1%的全球疾病負擔[1]。哮喘的治療主要通過吸入糖皮質(zhì)激素和β2受體激動劑[2]，二者雖對哮喘的急性發(fā)作具有重要控制作用，然而緩解期激素類藥物的長期使用，容易出現(xiàn)副作用，尤其影響兒童患者的生長發(fā)育。中醫(yī)藥治療哮喘經(jīng)驗豐富，很多證據(jù)表明其在治療哮喘時安全有效[3]，不僅可以緩解哮喘發(fā)作，還能從整體調(diào)節(jié)患者體質(zhì)，增強患者抗病能力，副作用小，故常被單獨或聯(lián)合用于哮喘緩解期的治療。

《傷寒論》第18條記載“喘家作桂枝湯，加厚樸杏子佳”，指出桂枝加厚樸杏子湯可治療宿有喘病，又感風寒而見桂枝湯證者，或風寒表證誤用下劑后，表證未解而微喘者。方中厚樸驅(qū)除痰涎，疏利氣雍，杏仁定喘鎮(zhèn)咳，兩者相佐以下氣逆，常被臨床醫(yī)家應(yīng)用于哮喘及咳嗽伴喘息發(fā)作等疾病的治療[4-5]?，F(xiàn)代研究表明，厚樸的有效成分厚樸酚能降低哮喘小鼠VEGF的表達，延緩氣道重構(gòu)的發(fā)生[6]；杏仁的有效成份苦杏仁苷能有效減輕支氣管哮喘小鼠氣管黏膜下層炎性細胞浸潤[7]。厚樸、杏仁在治療哮喘時常配伍應(yīng)用，現(xiàn)代藥理學(xué)雖然對其在治療哮喘中的有效成分有一定研究，但其協(xié)同治療的作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性的研究策略與中藥在治療疾病方面的多成分、多途徑、多靶點的作用原理十分契合。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對厚樸、杏仁配伍應(yīng)用在治療哮喘中的作用途徑和機制進行研究和探討，以期為日后進一步實驗研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 中藥化學(xué)成分作用靶標及哮喘疾病相關(guān)靶標篩選

本研究中厚樸、杏仁的化學(xué)成分及靶標信息來自于中藥分子機制生物信息學(xué)分析平臺BATMAN-TCM[8](http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)。將收集整理后的靶點導(dǎo)入Uniprot數(shù)據(jù)庫[9](https://www.uniprot.org/)列表并限定物種為人，所有靶基因名稱校正為官方名稱(official gene symbol)，并剔除沒有靶點的活性成分。疾病靶標信息來源于PALM-IST數(shù)據(jù)庫[10](http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/)。

1.2 韋恩分析及潛在靶標信息篩選

應(yīng)用Draw Venn Diagram在線工具[11](http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對厚樸-杏仁(Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum)藥物靶標與哮喘疾病靶標進行韋恩分析。

1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

采用string數(shù)據(jù)庫[12](https://string-db.org/cgi/input.pl)對收集到的藥物靶標構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network, PPI network)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，設(shè)定最小相互作用得分(interaction score)>0.4進行操作，隱藏離散靶點。利用Cytoscape v3.5.1軟件的在線工具Network Analyzer進行可視化參數(shù)設(shè)置，通過cetiscape 2.2插件進行連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)分析，篩選關(guān)鍵靶標信息。

1.4 基因功能和通路富集分析

利用DAVID (the database for annotation, visualization and integrated discovery)數(shù)據(jù)庫[13](https://david.ncifcrf.gov/)和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+cluepedia插件對藥物關(guān)鍵靶標進行GO(gene notology)生物功能富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 厚樸-杏仁藥物靶標與疾病靶標檢測結(jié)果

通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對厚樸、杏仁的化合物和靶標信息進行檢索，設(shè)置篩選標準Score cutoff大于等于40，P≤0.05，剔除不含靶標的化合物，分別找到厚樸、杏仁的化合物38個、16個；靶標353個、186個。剔除3個共有化合物及104個共有靶標，共收集到化合物51個(見表1)，靶標435個。通過PALM-IST數(shù)據(jù)庫對疾病的靶標信息進行檢索，以“asthma”作為搜索的關(guān)鍵詞，篩選標準為 No. of article大于10，共找到疾病相關(guān)靶標415個。

表1 厚樸-杏仁治療哮喘的藥物有效成分基本信息Table 1 Basic information of effective ingredients of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.2 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標篩選

將厚樸-杏仁靶點與疾病靶點信息輸入在線工具Draw Venn Diagram進行Venn分析，如圖1所示，其中兩組靶標重疊部分共有33個靶標，得到厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標，并用Uniprot數(shù)據(jù)庫校正靶標名稱和基因ID，如表2所示。

圖1 厚樸-杏仁靶標與疾病靶標venn分析Fig.1 Target of Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination and disease target by the Venn analysis

表2 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標Table 2 Potential targets for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

續(xù)表2

2.3 厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過string數(shù)據(jù)庫，對上述33個厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標進行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中“TYRP1”為離散靶點，以下分析中隱去。采用Cytoscape v3.5.1軟件的在線工具Network Analyzer進行可視化參數(shù)設(shè)置，通過cetiscape 2.2插件選取連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closeness)并選擇“for Undirected Networks”進行分析，篩選出厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標14個，分別為ADRB2、CAT、ESR1、F2、IL13、IL1B、INS、MAPK1、PLG、PPARG、TLR4、TNF、TRPV1、VCAM1，如圖2所示。圖中靶標節(jié)點按degree值進行大小和顏色調(diào)節(jié)，節(jié)點越大顏色越深，表示degree值越高，其中黃色圓點為離散程度較大的靶標。degree值最高的靶標為腫瘤壞死因子(TNF)，Ying等[14]研究表明，哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中的TNF mRNA增加，提示TNF在哮喘的發(fā)病機制中起作用。

圖2 厚樸-杏仁治療哮喘潛在靶標PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.2 PPI network construction of the potential target for the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.4 化合物-潛在靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape v3.5.1軟件對藥物有效成分和厚樸-杏仁治療哮喘的潛在靶標進行化合物-潛在靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，如圖3所示。網(wǎng)絡(luò)圖中紅色圓形代表化合物，黃色橢圓形代表藥物潛在靶點，一個節(jié)點的度(degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點相連的路線的條數(shù)，藍色線條代表化合物與靶點之間的網(wǎng)絡(luò)，紫色線條代表基因與基因之間的網(wǎng)絡(luò)?；衔镏谢ㄉ南┧?arachidic acid，AA)有最多的潛在靶標(10個)，研究表明，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物半胱氨酸白三烯(cysteinyl leukotrienes，Cys LTs)和脂氧酸(lipoxins，LXs)的不平衡狀態(tài)在哮喘慢性炎癥狀態(tài)中起重要作用。

圖3 化合物-潛在靶標網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The compound-potential target network

2.5 厚樸-杏仁治療哮喘關(guān)鍵靶標GO生物功能分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+cluepedia插件對厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標進行GO功能分析，其中GO基因功能分析包括生物學(xué)過程(biological process，BP)、細胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3部分，并從P<0.05的分析結(jié)果中篩選信息。

2.5.1 厚樸-杏仁治療哮喘的生物學(xué)過程

厚樸-杏仁治療哮喘的生物學(xué)過程(biological process，BP)主要涉及應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控、先天性免疫反應(yīng)調(diào)控、防御反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)、刺激反應(yīng)、凝血止血調(diào)節(jié)、自我內(nèi)穩(wěn)定、活性氧代謝過程、細胞死亡調(diào)控、細胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞通訊、創(chuàng)傷修復(fù)、趨化因子產(chǎn)生、蛋白質(zhì)代謝過程等生物過程，如表3所示。

表3 厚樸-杏仁治療哮喘的生物學(xué)過程Table 3 Biological process of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.2 厚樸-杏仁治療哮喘的細胞定位

厚樸-杏仁治療哮喘的細胞定位(cellular component，CC)主要涉及胞外區(qū)及細胞外空隙，具體如表4所示。

表4 厚樸-杏仁治療哮喘的細胞定位Table 4 Cellular component of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.5.3 厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能

厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能(molecular function，MF)主要涉及信號傳感器活性、信號受體活性、受體活性、分子傳感器活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性，配體活化的序列特異性DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合等，如表5所示。

表5 厚樸-杏仁治療哮喘的分子功能Table 5 Molecular function of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

2.6 厚樸-杏仁治療哮喘關(guān)鍵靶標KEGG信號通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫和Cytoscape v3.5.1軟件的ClueGO+Cluepedia插件對厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標進行KEGG信號通路富集分析，并從P<0.05的分析結(jié)果中篩選信息。

厚樸-杏仁治療哮喘的關(guān)鍵靶標主要涉及NF-κB信號通路、IL-17信號通路、FcεRI信號通路、Toll受體信號通路及FoxO信號通路等，如表6所示。

表6 厚樸-杏仁治療哮喘關(guān)鍵靶標KEGG信號通路Table 6 The KEGG signaling pathway of the key target of the Magnolia Officinalis Cortex-Armeniacae Semen Amarum combination in the treatment of asthma

3 討論

哮喘是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，涉及多種細胞及細胞組分，臨床表現(xiàn)以氣道的慢性炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)為特征。盡管糖皮質(zhì)激素和β2受體激動劑可有效控制哮喘癥狀，但長期使用容易出現(xiàn)副作用，因此仍缺乏治療哮喘的有效方法。目前，在亞洲使用了數(shù)千年的傳統(tǒng)中藥開始在西方醫(yī)療保障中作為一種補充和替代醫(yī)學(xué)的方式發(fā)揮作用，并且越來越多的證據(jù)表明中醫(yī)藥治療哮喘的科學(xué)性[15]。哮喘之名出自《丹溪心法·喘論》，屬于中醫(yī)“哮證”“喘證”范疇，其病機為宿痰伏于肺，復(fù)感外邪引動，使痰阻氣道、肺氣上逆而致痰鳴如吼，氣息喘促。厚樸-杏仁入藥歷史悠久，清朝汪昂《本草備藥》中云：“厚樸，苦降能瀉實滿，辛溫能散濕滿；杏仁，瀉肺、解肌、潤燥、下氣”，兩者配伍應(yīng)用“瀉肺平喘，以降氣逆”。本研究的GO基因功能和KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，厚樸-杏仁配伍可通過調(diào)節(jié)多種靶點、生物學(xué)途徑和信號通路，在哮喘的氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)等方面發(fā)揮治療作用。

3.1 厚樸-杏仁治療哮喘具有調(diào)節(jié)多靶點、多途徑的潛在作用

(1)調(diào)控炎癥反應(yīng)

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-13(IL-13)和白介素1β(IL1β)是引起哮喘氣道炎癥的重要介質(zhì)。研究顯示，TNF-α能夠增強IL-23調(diào)節(jié)的Th2和Th17細胞免疫應(yīng)答[16]，IL-13能夠刺激B細胞的增殖、分化及IgE的合成，與肥大細胞、嗜酸性細胞相互作用，誘發(fā)哮喘的急性發(fā)作[17]，IL1β參與嗜酸性粒細胞的炎癥過程[18]。這些介質(zhì)協(xié)同作用于氣道，引起多種炎癥細胞的募集活化，促進氣道黏液產(chǎn)生和平滑肌收縮，引起氣道重塑和氣道高反應(yīng)。

(2)調(diào)控活性氧代謝

氧化應(yīng)激損傷參與哮喘的發(fā)生發(fā)展過程，能夠上調(diào)Th2細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，增加哮喘的嚴重程度，促進氣道高反應(yīng)和氣道重塑。過氧化氫酶(CAT)是一種重要的抗氧化酶，其遺傳變異可通過促進細胞對抗活性氧，影響哮喘的發(fā)生過程[19]。

(3)調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是機體普遍表達的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，幾乎涉及哮喘炎癥網(wǎng)絡(luò)的所有方面，MAPK信號激活后能夠加速細胞外信號傳到細胞核內(nèi)，促進炎性細胞因子生成，從而導(dǎo)致氣道炎癥[20]。

(4)調(diào)控受體活性

本研究的關(guān)鍵靶標中多種受體參與哮喘的發(fā)生。β2腎上腺素能受體(ADRB2)是G蛋白偶聯(lián)腎上腺素受體家族成員之一，其基因的多態(tài)性與哮喘的易感性、哮喘惡化等方面具有相關(guān)性[21]。雌激素受體(ESR1)可能會導(dǎo)致哮喘患者的肺功能下降，尤其女性哮喘患者在月經(jīng)期會出現(xiàn)哮喘癥狀加重[22]。胰島素(INS)抵抗在肥胖相關(guān)的哮喘急性發(fā)作中起作用，可能與胰島素信號受損，影響葡萄糖的攝入，從而影響抵抗細菌感染的氣道代謝屏障有關(guān)[23]。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)是一種涉及多種細胞過程的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)、炎癥、細胞因子表達和組織重塑[24]。瞬時受體潛在陽離子通道亞家族V成員1(TRPV1)是調(diào)節(jié)CD4+細胞的激活和炎癥特性重要介質(zhì)，TRPV1抑制劑可減輕IL-13誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道上皮損傷，從而降低哮喘特征[25-26]。激活的Toll樣受體4(TLR4)可以直接或間接影響調(diào)節(jié)性T細胞的功能，從而影響Th1/Th2失衡，其基因多態(tài)性與哮喘的嚴重程度有關(guān)[27]。

(5)調(diào)控凝血止血功能

氣道的慢性炎癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞損傷，激活血小板和凝血因子，導(dǎo)致凝血功能紊亂。IL-6和較小程度的TNF-α介導(dǎo)的全身性炎癥狀態(tài)，可以驅(qū)動血漿中凝血酶原激活片段F1+2(F2)產(chǎn)生增強[28]。纖溶酶原(PLG)在炎性細胞遷移中起關(guān)鍵作用，參與哮喘早期支氣管周圍區(qū)域的膠原沉積和黏液化生，與組織重塑有關(guān)[29]。

3.2 厚樸-杏仁治療哮喘具有調(diào)節(jié)多通路的潛在作用

(1)厚樸-杏仁具有調(diào)節(jié)FcεRI和NF-κB信號通路的潛在作用

肥大細胞介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng)可導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，抗原與IgE介導(dǎo)的FcεRI復(fù)合物交聯(lián)激活肥大細胞，釋放過敏介質(zhì)及產(chǎn)生各種細胞因子(TNF-α、IL-1β等)，觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)[30〗。NF-κB是FcεRI信號級聯(lián)反應(yīng)中的一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，涉及多種炎癥反應(yīng)，通過調(diào)節(jié)細胞因子、趨化因子和細胞黏附分子的表達在氣道病理學(xué)中起重要作用[31]。

(2)厚樸-杏仁具有調(diào)節(jié)Toll受體和IL-17信號通路的潛在作用

Toll樣受體是介導(dǎo)免疫系統(tǒng)識別病原體的受體家族，病原體通過Toll樣受體激活氣道上皮的先天性免疫反應(yīng)，并誘發(fā)氣道炎癥，從而導(dǎo)致哮喘急性加重。IL-17在哮喘小鼠模型中高表達，參與哮喘的氣道炎癥和氧化應(yīng)激過程[32]。研究表明，IL-17A和TLR3通過TLR3/TRIF介導(dǎo)的NF-κB/IRF3激活，協(xié)同誘導(dǎo)上皮細胞中促炎因子和趨化因子的表達[33]。

(3)厚樸-杏仁可能具有調(diào)節(jié)FoxO信號通路的潛在作用

FoxO是一類對氧化還原敏感的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞周期調(diào)控、凋亡、氧化應(yīng)激抵抗等生物學(xué)過程，但目前有關(guān)其在哮喘作用中的研究較少，可能與哮喘的氧化應(yīng)激損傷相關(guān)。

氣道的慢性炎癥是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的關(guān)鍵，這種慢性炎癥對氣道的損害進一步引起氣道高反應(yīng)和氣道重塑，以上靶點和通路在哮喘氣道炎癥發(fā)病機制中起重要作用，也是厚樸-杏仁發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵。因此，厚樸-杏仁治療哮喘具有多靶點、多途徑、多通路的潛在作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在一定程度上揭示了中醫(yī)藥治療哮喘的科學(xué)內(nèi)涵，但尚缺乏實驗驗證，可作為進一步實驗研究的依據(jù)。