楊鯨蓉 吳健 葉仕新

[摘要] 目的 研究miR-21/PDCD4/AP-1對食管癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響。 方法 瞬時轉(zhuǎn)染食管鱗癌細胞為實驗對象，分組方法為單轉(zhuǎn)染組：空白對照組、miR-21 mimic陰性對照（miR-21 mimic NC）組、miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor NC組、miR-21 inhibitor組、siRNA NC組、PDCD4 siRNA組、c-Jun siRNA組;共轉(zhuǎn)染組：miR-21 inhibitor NC+siRNA NC組、miR-21 inhibitor+siRNA NC組、miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組。分別運用CCK-8、Transwell遷移和侵襲檢測miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路對食管癌EC9706細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后2 d起，miR-21 mimic組EC9706細胞的增殖能力明顯高于空白對照組、miR-21 mimic NC組、miR-21 inhibitor NC組和miR-21 inhibitor組（P < 0.05）。miR-21 mimic組穿過小室的細胞計數(shù)多于空白對照組和miR-21 mimic NC組（P < 0.05）;miR-21 inhibitor組穿過小室的細胞計數(shù)少于miR-21 inhibitor NC組（P < 0.05）。miR-21 mimic組穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)多于空白對照組和miR-21 mimic NC組（P < 0.05）;miR-21 inhibitor組穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)少于miR-21 inhibitor NC組（P < 0.05）。轉(zhuǎn)染后2 d起，PDCD4 siRNA組EC9706細胞的增殖能力高于空白對照組和siRNA NC組（P < 0.05）。PDCD4 siRNA組穿過小室的細胞計數(shù)、穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)多于空白對照組和siRNA NC組（P < 0.05）。miR-21 inhibitor+siRNA NC組EC9706細胞的增殖能力低于miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組和miR-21 inhibitor NC+siRNA NC組（P < 0.05）。miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組穿過小室的細胞計數(shù)、穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)多于miR-21 inhibitor+siRNA NC組（P < 0.05）。c-Jun siRNA組EC9706細胞的增殖能力低于空白對照組和siRNA NC組（P < 0.05）。c-Jun siRNA組穿過小室的細胞計數(shù)、穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)均少于siRNA NC組（P < 0.05）。 結(jié)論 miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路可調(diào)控食管癌細胞的生長和侵襲，該環(huán)路為阻止的侵襲、轉(zhuǎn)移提供新的治療策略。

[關(guān)鍵詞] miR-21;PDCD4;AP-1;食管癌

[中圖分類號] R735.1 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（b）-0004-06

[Abstract] Objective To study the effect of miR-21/PDCD4/AP-1 on the proliferation， invasion and migration of esophageal cancer cells. Methods Transient transfection of esophageal squamous cell carcinoma cells was used as experimental object. The single transfection group： blank control group， miR-21 mimics negative control （miR-21 mimic NC） group， miR-21 mimic group， miR-21 inhibitor NC group， miR-21 inhibitor group， siRNA NC group， PDCD4 siRNA group， c-Jun siRNA group. Cotransfection group： miR-21 inhibitor NC + siRNA NC group， miR-21 inhibitor + siRNA NC group， miR-21 inhibitor + siRNA NC group inhibitor + PDCD4 siRNA group. CCK-8， Transwell migration and invasion were used to detect the effect of miR-21/PDCD4/AP-1 feedback loop on the proliferation， migration and invasion of EC9706 cells. Results From the 2nd day after transfection， the proliferation ability of EC9706 cells in miR-21 mimic group was significantly higher than that in blank control group， miR-21 mimic NC group， miR-21 inhibitor NC group and miR-21 inhibitor group （P < 0.05）. The number of cells passing through the chamber in miR-21 mimic group was more than that in blank control group and miR-21 mimic NC group （P < 0.05）; the number of cells passing through the chamber in miR-21 inhibitor group was less than that in miR-21 inhibitor NC group （P < 0.05）. The number of invasive cells penetrating Matrigel in miR-21 mimic group was more than that in blank control group and miR-21 mimic NC group （P < 0.05）; the number of invasive cells penetrating Matrigel in miR-21 inhibitor group was less than that in miR-21 inhibitor NC group （P < 0.05）. From the 2nd day after transfection， the proliferation ability of EC9706 cells in PDCD4 siRNA group was higher than that in blank control group and siRNA NC group （P < 0.05）. The number of cells passing through the chamber and invading cells passing through Matrigel in PDCD4 siRNA group was higher than that in blank control group and siRNA NC group （P < 0.05）. The proliferation ability of EC9706 cells in miR-21 inhibitor + siRNA NC group was lower than that in miR-21 inhibitor + PDCD4 siRNA group and miR-21 inhibitor NC + siRNA NC group （P < 0.05）. The number of cells passing through the chamber and the number of cells penetrating Matrigel in miR-21 inhibitor + PDCD4 siRNA group was more than that in miR-21 inhibitor + siRNA NC group （P < 0.05）. The proliferation ability of EC9706 cells in c-Jun siRNA group was lower than that in blank control group and siRNA NC group （P < 0.05）. The number of cells passing through the chamber and the number of invasive cells passing through Matrigel in c-Jun siRNA group was less than that in siRNA NC group （P < 0.05）. Conclusion miR-21/PDCD4/AP-1 feedback loop can regulate the growth and invasion of esophageal cancer cells， which provides a new therapeutic strategy for preventing invasion and metastasis.

[Key words] miR-21; PDCD4; AP-1; Esophageal cancer

食管癌是高發(fā)惡性腫瘤之一，其5年生存率低，為10%～30%。由于食管癌預后差，亟需尋找新的有效的治療方案。近年來，miRNA和食管癌關(guān)系的研究日益深入[1-2]。miR-21作為一種癌基因，參與腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移等多種生物學行為。其中，miR-21可通過PI3K/Akt/mTOR、TGF-β、PI3K/Akt/FOXO1等多條途徑直接調(diào)控PDCD4[3-4]。PDCD4也可通過調(diào)節(jié)AP-1和p21、抑制p53活性等方式抑制腫瘤細胞生長。而miR-21存在轉(zhuǎn)錄因子AP-1的靶點，活化的AP-1可通過啟動子區(qū)結(jié)合而激活miR-21轉(zhuǎn)錄。因此，miR-21/PDCD4/AP-1形成了反饋環(huán)路[5]。目前，miR-21/PDCD4/AP-1在食管癌細胞惡性生物表型中的作用和作用機制均不明確。因此，本研究應用CCK-8、Transwell遷移及侵襲實驗初步探討miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路對食管癌EC9706細胞增殖、侵襲和遷移的影響，為食管鱗狀細胞癌發(fā)病機制的研究和診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞

食管癌EC9706細胞為聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院實驗室保存。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺OptiClean1300（Healforce公司）;TDZ4A-WS低速離心機（湖南湘儀公司）;IX73倒置顯微鏡（Olympus）;160iCO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）;BCD-160TMPQ冰箱（海爾公司）;DW-86W108-80冰箱（捷盛）;CX31-32RFL熒光顯微鏡（Olympus公司）;DMEM細胞培養(yǎng)基、胰酶（Invitrogen公司）;胎牛血清（杭州四季青公司）;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin 2000購自Invitrogen公司;miR-21 inhibitor、miR-21 mimic、miR-21 mimic negative control（NC）、PDCD4 siRNA、c-Jun siRNA、siRNA NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

食管癌細胞EC9706于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640（Gibco）培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)。每隔2 d用0.3%胰酶進行消化和傳代，待細胞生長至對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

細胞轉(zhuǎn)染前1 d在6孔培養(yǎng)板中接種適當數(shù)量的細胞，按Lipofectin 2000說明書進行操作。分組方法為單轉(zhuǎn)染組：空白對照組、miR-21 mimic陰性對照（miR-21 mimic NC）組、miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor NC組、miR-21 inhibitor組、siRNA NC組、PDCD4 siRNA組、c-Jun siRNA組;共轉(zhuǎn)染組：miR-21 inhibitor NC+siRNA NC組、miR-21 inhibitor+siRNA NC組、miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，6～8 h后換液，72 h后檢測細胞增殖、遷移和侵襲能力改變。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖活性

將對數(shù)生長期經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的各組食管癌EC9706細胞接種于96孔板，每孔5000個細胞/100 μL，并將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染1、2、3、4、5 d后，按CCK-8說明書操作方法加入100 μL含10% CCK-8的培養(yǎng)基，并設置不含細胞的培養(yǎng)基對照組，每組設置3個復孔。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育培養(yǎng)板1～4 h。用酶標儀測定吸光度（450 nm處）。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移能力

將Transwell小室置入24孔板中，聚碳酸脂膜上層為無血清培養(yǎng)液，24孔板下室加入完全培養(yǎng)基作為趨化因子。照前述轉(zhuǎn)染方法將EC9706細胞行單轉(zhuǎn)染和共同轉(zhuǎn)染，然后制備細胞懸液。每組3個樣本。37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48 h。取出上室，輕輕擦去上室內(nèi)面，取膜后使用95%乙醇固定，然后依次清水浸洗、伊紅染色和清水浸洗，倒置晾干，用刀片將PC膜取下，封片，最后高倍倒置顯微鏡下每孔隨機選取3個視野拍照，并對穿過小室的細胞計數(shù)。

1.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力

照前述轉(zhuǎn)染方法將EC9706細胞行單轉(zhuǎn)染和共同轉(zhuǎn)染，收集各組細胞，PBS洗滌2次，用無血清培養(yǎng)液重懸;將密度為1×106/mL的各組細胞接種于上室，下室加入0.5 mL完全培養(yǎng)基。以PBS作為對照，每組設3個復孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用濕棉簽擦除上室內(nèi)側(cè)基質(zhì)膠和未穿過膜的細胞，室溫下多聚甲醇固定，結(jié)晶紫染色，清水浸洗后晾干，封片。高倍鏡下觀察穿過小室的細胞數(shù)量并拍照、計數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-21促進食管癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力

CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后2 d起，miR-21 mimic組EC9706細胞的增殖能力明顯高于空白對照組、miR-21 mimic NC組、miR-21 inhibitor NC組和miR-21 inhibitor組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖1A）。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，miR-21 mimic組穿過小室的細胞計數(shù)多于空白對照組和miR-21 mimic NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;miR-21 inhibitor組穿過小室的細胞計數(shù)少于miR-21 inhibitor NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖1B）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，miR-21 mimic組穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)多于空白對照組和miR-21 mimic NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;miR-21 inhibitor組穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)少于miR-21 inhibitor NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖1C）。Transwell遷移和侵襲實驗證實，高表達miR-21可以促進食管癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力;反之，低表達miR-21抑制其惡性生物表型能力。

2.2 PDCD4抑制食管癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力

CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后2 d起，PDCD4 siRNA組EC9706細胞的增殖能力高于空白對照組和siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖2A）。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，PDCD4 siRNA組穿過小室的細胞計數(shù)多于空白對照組和siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖2B）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，PDCD4 siRNA組穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)多于空白對照組和siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖2C）。Transwell遷移和侵襲實驗表明下調(diào)PDCD4可促進食管癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

2.3 PDCD4參與miR-21調(diào)節(jié)食管癌EC9706細胞增殖、遷移和侵襲的作用

轉(zhuǎn)染后2 d起，miR-21 inhibitor+siRNA NC組EC9706細胞的增殖能力低于miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組和miR-21 inhibitor NC+siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖3A）。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組穿過小室的細胞計數(shù)多于miR-21 inhibitor+siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖3B）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，miR-21 inhibitor+PDCD4 siRNA組穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)多于miR-21 inhibitor+siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖3C）。Transwell遷移和侵襲實驗證實，雖然miR-21 inhibitor抑制了食管癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力，但在下調(diào)miR-21的同時下調(diào)PDCD4，可以逆轉(zhuǎn)miR-21 inhibitor引起的食管癌EC9706細胞增殖、遷移、侵襲能力的下降，提示miR-21參與調(diào)控食管癌細胞惡性表型可能是通過調(diào)控PDCD4的表達實現(xiàn)的。

2.4 AP-1促進食管癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力

轉(zhuǎn)染后4 d起，c-Jun siRNA組EC9706細胞的增殖能力低于空白對照組和siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖4A）。Transwell遷移侵襲實驗顯示，c-Jun siRNA組穿過小室的細胞計數(shù)、穿透Matrigel膠的侵襲細胞數(shù)均少于siRNA NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）（圖4B～C）。結(jié)果提示，沉默c-Jun可以抑制食管癌EC9706細胞的生物惡性表型。

3 討論

miR-21是一種常見的致癌基因，在包括肺癌、宮頸癌、腎癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)異常表達。miR-21的異常表達參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學行為，且與腫瘤患者的預后密切相關(guān)，對判斷腫瘤的惡性程度及患者預后具有一定的臨床參考價值[6-8]。miR-21可作用于多個與凋亡相關(guān)的靶基因，如PDCD4、Sprouty1、Sprouty2、PTEN、FasL、bcl-2、TIMP3、REC等[9-11]。其中，PDCD4是一種腫瘤抑制基因，PDCD4通過多個信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學行為[12]。

目前，關(guān)于miR-21/PDCD4與食管癌生物學行為、機制及臨床相關(guān)性研究也有一些報道。miR-21在食管癌中高表達，可以負向調(diào)控PDCD4基因[13]。研究顯示，miR-21是通過與PDCD4基因3′UTR序列結(jié)合而下調(diào)蛋白翻譯[14]。張建東等[15]和Zhang等[16]研究表明，在Ⅱ期食管鱗癌術(shù)后患者中，腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病變長度與癌組織中miR-21的表達呈正相關(guān)。COX回歸模型發(fā)現(xiàn)，Ⅱ期食管鱗癌患者miR-21和PDCD4表達量均為影響患者PFS的因素，高表達miR-21提示預后較差，而高表達PDCD4提示預后較好。

PDCD4可通過一系列過程作用于AP-1，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，阻斷其介導的信號轉(zhuǎn)導通路，抑制腫瘤增殖。而miR-21又存在著AP-1的直接靶點，是AP-1的靶目標，調(diào)節(jié)器活化的AP-1可以上調(diào)miR-21轉(zhuǎn)錄。因此miR-21與AP-1構(gòu)成一個自我調(diào)節(jié)的環(huán)路，對腫瘤的增殖、侵襲進一步產(chǎn)生影響。而miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路對食管癌細胞的報道罕見。虞勇等[17]報道，在柯薩奇病毒B3感染大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞后，miR-21表達上調(diào)，miR-21與PDCD4、轉(zhuǎn)錄因子AP-1之間分別具有負向調(diào)控作用。Zhu等[18]報道，miR-21可通過miR-21-PDCD4-AP-1反饋環(huán)路調(diào)控其在肝癌細胞的生物學功能。Chang等[19]研究表明，牙齦卟啉單胞菌可能通過miR-21/PDCD4/AP-1負反饋信號通路調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1的表達來促進口腔鱗狀細胞癌的增殖。目前miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路對食管癌細胞的作用，國內(nèi)外尚鮮見報道。

本研究分別應用CCK-8、Transwell遷移和Transwell侵襲檢測miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路對食管癌EC9706細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。與空白對照組和NC組比較，外源性高表達miR-21可以促進食管癌EC9706細胞的增殖、遷移和侵襲能力;相反，下調(diào)miR-21表達則可抑制食管癌惡性表型。通過沉默PDCD4使PDCD4低表達，可以促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。遷移實驗中，與NC組比較，miR-21 inhibitor+siRNA細胞遷移至膜背面的細胞數(shù)明顯減少，但在下調(diào)miR-21的同時沉默PDCD4，可以逆轉(zhuǎn)miR-21 inhibitor引起的食管癌EC9706遷移的下降。同樣在侵襲實驗中，也得到類似的結(jié)果。說明通過沉默PDCD4可以逆轉(zhuǎn)外源性miR-21下調(diào)引起的食管癌EC9706細胞增殖、遷移和侵襲能力的下降，提示miR-21調(diào)控食管癌細胞惡性表型可能是通過調(diào)控PDCD4的表達來實現(xiàn)。外源性低表達c-Jun可以抑制食管癌EC9706細胞的遷移、侵襲能力。結(jié)果表明，miR-21在食管癌細胞中發(fā)揮“抑癌基因樣”作用，其可能通過miR-21/PDCD4/AP-1調(diào)控生物學作用。但其具體作用機制有待進一步研究。有研究表明，miR-21對PDCD4有直接調(diào)控作用，PDCD4通過干擾c-Jun和c-Fos的反式激活可以抑制AP-1的活性[20]。而PDCD4對c-Jun的抑制是通過抑制MAP4K1經(jīng)MAP2K1→TAK1→MKK4→JNK信號通路激活JNK，發(fā)揮作用。miR-21/PDCD4/AP-1調(diào)控食管癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制需進一步探索。

綜上所述，在食管癌中，miR-21、PDCD4與AP-1呈負相關(guān)，miR-21可能通過miR-21/PDCD4/AP-1反饋環(huán)路調(diào)控食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究為進一步了解食管癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制和為阻止食管癌生長、侵襲和轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點奠定了一定的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-02-28）