楊仁義，劉利娟，康蕾，顏思陽(yáng)，譚惠中，傅馨瑩，尹倩，周德生

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的活血榮絡(luò)方對(duì)腦梗死血管新生作用機(jī)制研究

楊仁義1，劉利娟2，康蕾1，顏思陽(yáng)1，譚惠中1，傅馨瑩1，尹倩1，周德生2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究活血榮絡(luò)方在腦梗死血管新生中的作用及其機(jī)制。通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）收集活血榮絡(luò)方的主要活性成分并進(jìn)行初步篩選，采用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)主要活性成分靶點(diǎn)，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)腦梗死血管新生作用靶點(diǎn)，二者取交集得出共同靶點(diǎn)。采用String數(shù)據(jù)庫(kù)及Cytoscape軟件Network analyzer功能構(gòu)建共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合Cytoscape軟件對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析。收集并篩選出活血榮絡(luò)方422個(gè)活性成分、1028個(gè)靶點(diǎn)，腦梗死血管新生169個(gè)靶點(diǎn)，共同靶點(diǎn)42個(gè)，其中IL6、TNF、AKT1、CASP3相互作用最明顯，主要調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、蛋白磷酸化、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖等生物過(guò)程及HIF-1信號(hào)通路、癌癥途徑、TNF信號(hào)通路、能量代謝途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等?；钛獦s絡(luò)方在腦梗死血管新生中體現(xiàn)了多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，有助于進(jìn)一步詮釋活血榮絡(luò)方的藥理學(xué)作用機(jī)制。

活血榮絡(luò)方；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；腦梗死；血管新生

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心與美國(guó)健康測(cè)量和評(píng)價(jià)研究所的合作調(diào)查研究顯示，在282類致死原因中，中風(fēng)是2017年中國(guó)人十大死亡原因之一[1]。缺血性中風(fēng)（腦梗死）以風(fēng)、火、痰、血、氣、虛為因，病性屬本虛標(biāo)實(shí)，以肝腎陰虛為本，以瘀、痰為標(biāo)。肝腎虧虛，氣血津液不足，致脈絡(luò)失養(yǎng)，血行不暢，瘀血阻滯于內(nèi)，發(fā)為中風(fēng)，故而陰虛血瘀阻滯腦絡(luò)是腦梗死的關(guān)鍵病機(jī)之一。中醫(yī)學(xué)根據(jù)“血管”形態(tài)及功能將其表述為“脈”“血脈”“血絡(luò)”“脈絡(luò)”等?！堆C論》有“然又非去瘀是一事，生新另是一事也。蓋瘀血去則新血已生，新血生而瘀血自去，其間初無(wú)間隔”，指出血管內(nèi)“祛瘀”與“新生”共存，瘀去則“生血”“生脈”。吳以嶺等[2]提出“營(yíng)衛(wèi)承制調(diào)平”理論之“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”，認(rèn)為缺血區(qū)微血管結(jié)構(gòu)及功能保護(hù)本質(zhì)是“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)”的自穩(wěn)態(tài)，故而陰虛血瘀阻滯腦絡(luò)致瘀塞失養(yǎng)在治療上祛瘀新生并存，調(diào)節(jié)“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)”自穩(wěn)態(tài)環(huán)節(jié)可使腦絡(luò)血管新生。

活血榮絡(luò)方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合缺血性中風(fēng)陰虛血瘀阻滯腦絡(luò)病機(jī)制定的協(xié)定方，具有養(yǎng)陰生津、活血養(yǎng)血、舒筋活絡(luò)通脈功效，由雞血藤、石楠藤、生地黃、玄參、黃精、乳香、沒藥、川芎按6∶6∶3∶2∶3∶2∶2∶2比例組成。方中雞血藤、石楠藤為君，兩者相須為用，加強(qiáng)活血補(bǔ)血、舒筋活絡(luò)之功；生地黃、玄參、黃精為臣，養(yǎng)陰補(bǔ)血、滋脾胃、益精補(bǔ)髓，可除寒熱、調(diào)氣機(jī)，助君藥活血補(bǔ)血，又可補(bǔ)腎益脾養(yǎng)真陰，標(biāo)本兼治；乳香、沒藥最善活絡(luò)通經(jīng)、化瘀止痛，可加強(qiáng)君藥活血之力，并使氣機(jī)暢達(dá)，為佐；川芎氣頗芳烈，而味不甚厚，以氣用事，升發(fā)之力殊猛，能上達(dá)頭目，直透巔頂，又質(zhì)不堅(jiān)、多空竅，故可旁行肢節(jié)、貫通脈絡(luò)、透達(dá)腠理、開泄肌膚，為血中之氣藥，上下內(nèi)外無(wú)所不達(dá)，可引諸藥直達(dá)病所，為使藥。諸藥合用，可養(yǎng)陰活血、化瘀通絡(luò)，標(biāo)本兼治，氣血兼調(diào)，對(duì)缺血性中風(fēng)陰虛血瘀證頗為有效。

為進(jìn)一步揭示活血榮絡(luò)方在腦梗死血管新生中的作用機(jī)制，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討活血榮絡(luò)方中君藥之一雞血藤、臣藥之一黃精、佐藥之一乳香及使藥川芎共同促進(jìn)腦梗死血管新生的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，為進(jìn)一步開發(fā)活血榮絡(luò)方并揭示其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分收集與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[3]收集活血榮絡(luò)方中雞血藤、黃精、乳香、川芎的主要化學(xué)成分。根據(jù)人體對(duì)藥物吸收、分布、代謝及排泄/毒性的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[4]，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）[5]≥30%、類藥性（drug likeness，DL）[6]≥0.18、血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥-0.3為篩選條件[7]，初步篩選出方中具有較高活性的化合物。

1.2 作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與共同靶點(diǎn)篩選

通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）[8]及ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. chemspider.com/）[9]收集和校對(duì)活血榮絡(luò)方候選化合物名稱，將化合物成分信息以3D結(jié)構(gòu)保存為SDF或MOL格式。將各候選化合物輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction. ch/）[10]對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并將物種設(shè)定為智人（Homo sapiens），剔除無(wú)化學(xué)結(jié)構(gòu)、靶點(diǎn)化合物，并利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot. org/）[11]對(duì)靶點(diǎn)名稱規(guī)范化。

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards. org/），以“Brain Ischemia（MeSH）”AND“Angiogenesis”為檢索詞，收集腦梗死血管新生的作用靶點(diǎn)，以Score≥30為限定條件進(jìn)行篩選[12]。

通過(guò)Bioinformatics Gent（http://bioinformatics. psb.ugent.be/beg）中Van de Peer Lab取交集，獲得活血榮絡(luò)方活性成分與腦梗死血管新生的共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.3 共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db. org/）[13]，選擇Multiple Protein，限定物種為Homo sapiens，設(shè)定最低要求互動(dòng)分?jǐn)?shù)為中度信度0.400[14]，得到蛋白相互作用（PPI）相關(guān)信息。將PPI相關(guān)信息中的Node1、Node2、Combined score值導(dǎo)入Cytoscape3.7.1進(jìn)行可視化，并利用Network analyzer功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)Degree值對(duì)共有靶點(diǎn)進(jìn)行篩選分析。

1.4 共同靶點(diǎn)GO富集分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）[15]對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析。共同靶點(diǎn)以“OFFICIAL GENE SYMBOL”格式導(dǎo)入，設(shè)定“Background”為“Homo sapiens”，＜0.05，分別導(dǎo)出細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）進(jìn)行GO分析。對(duì)值取負(fù)對(duì)數(shù)，值越小，-lgP值越大，表明富集程度越大。

1.5 共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，基本設(shè)置同“1.4”項(xiàng)。對(duì)排名前20的通路與其涉及靶點(diǎn)構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，將導(dǎo)出的KEGG通路相關(guān)信息中“Term”“Genes”“-lgP”值導(dǎo)入Cytoscape3.7.1進(jìn)行可視化，導(dǎo)出Degree值。

2 結(jié)果

2.1 活血榮絡(luò)方活性成分

通過(guò)TCMSP共收集活血榮絡(luò)方化合物422個(gè)，其中雞血藤68個(gè)、黃精38個(gè)、乳香127個(gè)、川芎189個(gè)。篩選出符合條件的化合物35個(gè)，其中雞血藤14個(gè)、黃精7個(gè)、乳香8個(gè)、川芎6個(gè)，將其作為候選化合物，見表1。

表1 活血榮絡(luò)方中候選化合物基本信息

歸屬藥物MOL ID化合物名稱OB/%BBBDL 雞血藤M(fèi)OL000296hederagenin36.910.960.75 MOL000033(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]- 2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol36.231.090.78 MOL000358beta-sitosterol36.910.990.75 MOL000392formononetin69.670.020.21 MOL000449stigmasterol43.831.000.76 MOL0004688-o-Methylreyusi70.320.020.27 MOL0004693-Hydroxystigmast-5-en-7-one40.930.450.78 MOL000483(Z)-3-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]acrylamide118.35-0.270.26 MOL000491augelicin37.500.300.66 MOL000493campesterol37.580.930.71 MOL000497licochalcone a40.79-0.210.29 MOL000500vestitol74.660.300.21 MOL000506lupinidine61.891.700.21 MOL000507psi-Baptigenin70.12-0.270.31 黃精MOL001792DFV32.76-0.290.18 MOL004941(2R)-7-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)chroman-4-one71.12-0.250.18 MOL002714baicalein33.52-0.050.21 MOL0063314',5-dihydroxyflavone48.55-0.030.19 MOL000546diosgenin80.880.270.81 MOL000359sitosterol36.910.870.75 MOL000358beta-sitosterol36.910.990.75 乳香MOL001215tirucallol42.121.070.75 MOL001241O-acetyl-α-boswellic acid42.730.410.70 MOL0012433alpha-Hydroxy-olean-12-en-24-oic-acid39.320.200.75 MOL001255boswellic acid39.550.240.75 MOL0012633-oxo-tirucallic,acid42.86-0.060.81 MOL001265acetyl-alpha-boswellic acid42.730.280.70 MOL001272incensole45.591.200.22 MOL001295phyllocladene33.402.100.27 川芎MOL001494mandenol42.001.140.19 MOL002135myricanone40.60-0.080.51 MOL002140perlolyrine65.950.150.27 MOL002151senkyunone47.660.500.24 MOL002157wallichilide42.310.730.71 MOL000359sitosterol36.910.870.75

2.2 活血榮絡(luò)方作用靶點(diǎn)

剔除無(wú)化學(xué)結(jié)構(gòu)及無(wú)靶點(diǎn)化合物（MOL000033、MOL000483、MOL000491、MOL004941、MOL001241、MOL001295、MOL002140），得到活血榮絡(luò)方候選化合物共1028個(gè)靶點(diǎn)，其中雞血藤303個(gè)、黃精240個(gè)、乳香171個(gè)、川芎314個(gè)。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集并篩選到腦梗死血管新生靶點(diǎn)169個(gè)。取交集后獲得活血榮絡(luò)方候選化合物與腦梗死血管新生的共同靶點(diǎn)共42個(gè)，韋恩圖見圖1，具體靶點(diǎn)見表2。

注：Disease.腦梗死血管新生；JXT.雞血藤；HJ.黃精；RX.乳香；CX.川芎

表2 活血榮絡(luò)方候選化合物與腦梗死血管新生共同靶點(diǎn)

項(xiàng)目個(gè)數(shù)靶點(diǎn) CX Disease HJ JXT RX5HMGCR、NOS2、PPARG、PTGS2、ACHE CX Disease HJ JXT2JAK2、MMP9 CX Disease HJ RX1MMP2 Disease HJ JXT5XDH、PIK3CA、ADORA1、PDGFRB、APP Disease HJ JXT RX1MAPK1 CX Disease HJ3KDR、BCL2、PARP1 Disease RX1PSEN1 CX Disease RX3HIF1A、F2、AGTR1 Disease JXT6PON1、TNF、F3、LIMK1、IL6、CASP3 Disease HJ7TTR、NTRK2、MAPT、MTOR、AKT1、IL1B、REN CX Disease7FLT1、TEK、ICAM1、KNG1、SELE、STAT3、SLC2A1 CX Disease JXT1BRAF

注：Disease.腦梗死血管新生；JXT.雞血藤；HJ.黃精；RX.乳香；CX.川芎

2.3 共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

共同靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。根據(jù)Degree值設(shè)定節(jié)點(diǎn)大小。Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大；Combine score值越大，邊線顏色越深且越粗。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有40個(gè)靶點(diǎn)（HMGCR、PON1無(wú)相互作用），包含41個(gè)節(jié)點(diǎn)、352條邊。靶點(diǎn)的Degree值見表3，其中IL6（Degree＝35）、TNF（Degree＝34）、AKT1（Degree＝33）、CASP3（Degree＝32）。表明活血榮絡(luò)方可能通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)在腦梗死血管新生中發(fā)揮作用。

表3 活血榮絡(luò)方候選化合物與腦梗死血管新生共同靶點(diǎn)蛋白Degree值

靶點(diǎn)Degree 靶點(diǎn)Degree 靶點(diǎn)Degree 靶點(diǎn)Degree IL635 MMP223 FLT117 PARP111 TNF34 MTOR22 REN17 PSEN110 AKT133 APP22 SELE17 NTRK28 CASP332 ICAM122 KNG116 MAPT8 PTGS227 HIF1A21 NOS215 BCL27 MAPK126 F219 F314 TTR7 MMP926 PPARG19 PDGFRB13 ADORA17 STAT325 PIK3CA18 TEK12 BRAF5 IL1B25 AGTR118 SLC2A112 XDH3 KDR23 JAK217 ACHE12 LIMK11

2.4 共同靶點(diǎn)GO富集分析結(jié)果

42個(gè)共同靶點(diǎn)GO富集分析得到198個(gè)BP、26個(gè)CC、27個(gè)MF，對(duì)值取負(fù)對(duì)數(shù)，-lgP值越大表明富集程度越大，富集程度居前10位的條目見圖3。分析結(jié)果顯示，共同靶點(diǎn)主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)膜，細(xì)胞質(zhì)等細(xì)胞成分中，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合、ATP結(jié)合、生長(zhǎng)因子結(jié)合等方式，參與一氧化氮生物合成、蛋白質(zhì)磷酸化、平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控、PI3K信號(hào)傳導(dǎo)、肽基絲氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、激活參與凋亡過(guò)程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性等生物進(jìn)程。

2.5 共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

42個(gè)共同靶點(diǎn)KEGG富集分析得到83個(gè)信號(hào)通路，靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖見圖4。富集程度前20位的通路見表4。共同靶點(diǎn)參與的關(guān)鍵通路為HIF-1信號(hào)通路、癌癥途徑、TNF信號(hào)通路、能量代謝途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等。

圖3 活血榮絡(luò)方候選化合物與腦梗死血管新生共同靶點(diǎn)GO富集分析

注：菱形代表信號(hào)通路，長(zhǎng)方形代表共同靶點(diǎn)

表4 活血榮絡(luò)方候選化合物與腦梗死血管新生共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

信號(hào)通路-lgP 信號(hào)通路-lgP HIF-1 signaling pathway11.58 PI3K-Akt signaling pathway4.82 Pathways in cancer11.08 mTOR signaling pathway4.78 TNF signaling pathway 9.63 Chagas disease （American trypanosomiasis）4.65 Proteoglycans in cancer 8.11 Colorectal cancer4.64 Hepatitis B 5.94 Insulin resistance4.55 Central carbon metabolism in cancer 5.88 Glioma4.54 Toxoplasmosis 5.65 Renal cell carcinoma4.51 Tuberculosis 5.29 African trypanosomiasis4.49 Prostate cancer 5.07 Adipocytokine signaling pathway4.38 Acute myeloid leukemia 4.86 Leishmaniasis4.35

3 討論

榮氣是氣、血、精、津、液、神、髓、膏等一切精微物質(zhì)的總稱。腦梗死之“榮氣虛滯”病機(jī)理論源于陰虛血瘀阻滯腦絡(luò)學(xué)說(shuō)，主要包括榮氣虛與榮氣滯兩方面[16]，表現(xiàn)為臟腑虧虛和內(nèi)生之邪?；跇s氣理論及腦梗死“榮氣虛滯”病機(jī)特征，虛中夾滯者當(dāng)以補(bǔ)虛為主，而榮氣虛主要包括精血、氣陰、津液的虧損，故治以滋補(bǔ)精血、養(yǎng)陰益氣、化生津液的柔藥為主；以滯為主者當(dāng)以通滯為要，榮氣滯主要表現(xiàn)為腦絡(luò)不通，治以行氣通絡(luò)，自古醫(yī)家多“以藤通絡(luò)”?；钛獦s絡(luò)法以滋陰活血為主，在滋陰基礎(chǔ)上結(jié)合臟腑病位聯(lián)合補(bǔ)氣、補(bǔ)血、補(bǔ)精等，活血基礎(chǔ)上配伍理氣、化痰、清熱、瀉實(shí)等，佐以開竅。根據(jù)臨床辨證情況，調(diào)整各種亞治法的組合方式及補(bǔ)瀉權(quán)重?；钛獦s絡(luò)方根據(jù)針對(duì)腦梗死“陰虛血瘀阻絡(luò)-榮氣虛滯”病機(jī)制定，具有養(yǎng)陰生津、活血養(yǎng)血、舒筋活絡(luò)通脈功效。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了多學(xué)科技術(shù)，可從整體角度揭示藥物、靶點(diǎn)、疾病之間的關(guān)系，為中藥作用靶點(diǎn)、途徑提供數(shù)據(jù)支撐，廣泛應(yīng)用于單味中藥、中藥藥對(duì)及中藥復(fù)方作用機(jī)制研究[17]。分子網(wǎng)絡(luò)相互作用即利用基因、蛋白質(zhì)、RNA、DNA等生物分子，以網(wǎng)絡(luò)形式構(gòu)建整體的生命體，并通過(guò)其相互作用完成機(jī)體生命過(guò)程。中醫(yī)學(xué)整體觀念強(qiáng)調(diào)人體自身整體性及內(nèi)外環(huán)境整體性，將局部病變與整體病變統(tǒng)一起來(lái)，與分子網(wǎng)絡(luò)相互作用對(duì)疾病診治思想不謀而合。分子網(wǎng)絡(luò)相互作用的穩(wěn)態(tài)是機(jī)體健康的物質(zhì)基礎(chǔ)，單個(gè)或多個(gè)生物分子結(jié)構(gòu)功能失調(diào)，使整體處于失衡狀態(tài)，從而導(dǎo)致機(jī)體疾病的發(fā)生[18]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從分子網(wǎng)絡(luò)相互作用角度，結(jié)合中醫(yī)學(xué)整體觀念的特點(diǎn)，挖掘活血榮絡(luò)方的活性成分，探討其對(duì)腦梗死血管新生的作用機(jī)制，為臨床使用提供依據(jù)。

本研究通過(guò)對(duì)活血榮絡(luò)方中君藥雞血藤、臣藥黃精、佐藥乳香、使藥川芎的活性成分進(jìn)行收集、篩選，得到422個(gè)活性成分，部分活性成分已被證實(shí)在腦缺血再灌注損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用，芒柄花素（formononetin）能通過(guò)下調(diào)腦缺血/再灌注大鼠Bax/Bcl-2比值及上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[19]。黃芩素（baicalein）在缺血性腦損傷中可調(diào)控PTEN/Akt通路保護(hù)受損神經(jīng)元[20]。進(jìn)一步對(duì)活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，得出1028個(gè)對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，體現(xiàn)了活血榮絡(luò)方的整體協(xié)同作用機(jī)制。同時(shí)，基于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到腦梗死血管新生的169個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，利用韋恩圖交叉篩選出活血榮絡(luò)方與腦梗死血管新生的42個(gè)共同作用靶點(diǎn)。前期研究顯示活血榮絡(luò)方能通過(guò)腫瘤壞死因子（TNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、JAK2、STAT3、白細(xì)胞介素（IL）-1β、Caveolin-1、乙酰膽堿酯酶、膽堿轉(zhuǎn)移酶等靶點(diǎn)在腦梗死血管新生中發(fā)揮作用[21-24]。腦梗死血管新生實(shí)驗(yàn)表明，IL-6能介導(dǎo)負(fù)免疫調(diào)節(jié)促神經(jīng)血管生成[25]。活血榮絡(luò)方中單藥具有多成分、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，與腦梗死血管新生靶點(diǎn)的重疊程度較大，從微觀角度證實(shí)活血榮絡(luò)方可能通過(guò)共有靶點(diǎn)在腦梗死血管新生中發(fā)揮作用。

共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)表明，活血榮絡(luò)方的靶蛋白與腦梗死血管新生靶蛋白具有復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系?；钛獦s絡(luò)方主要通過(guò)炎癥因子、腫瘤壞死因子、趨化因子、轉(zhuǎn)錄因子、多種酶等物質(zhì)之間相互作用，從而在腦梗死血管新生中發(fā)揮作用，與前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[23-24，26]相吻合。腦缺血再灌注損傷后趨化因子CXCL12在CXCR4/CXCR7受體單元中發(fā)揮作用[27]，從而促進(jìn)血管新生。因此，這些靶點(diǎn)共同作用、相互調(diào)節(jié)可能是活血榮絡(luò)方發(fā)揮其治療作用的機(jī)制。

GO富集分析結(jié)果表明，活血榮絡(luò)方的作用靶點(diǎn)分布在多種細(xì)胞組分中，能多靶點(diǎn)、多結(jié)構(gòu)、多形式地參與生物進(jìn)程，涉及氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、蛋白磷酸化、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖等。這些生物進(jìn)程在一定程度上能夠促進(jìn)腦梗死血管新生作用[28]。Ma等[29]研究表明，曲克蘆丁和腦蛋白水解物注射液（TCHI）通過(guò)氧化應(yīng)激途徑并促進(jìn)血管生成減輕腦缺血損傷。Gu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Intelectin-1在腦梗死血管新生細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用，通過(guò)Akt-eNOS信號(hào)通路，使Akt蛋白磷酸化，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能及血管新生。腦梗死發(fā)生時(shí)，血液供應(yīng)障礙致腦組織缺血缺氧，在低氧狀態(tài)下，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)上調(diào)[31]，通過(guò)多種途徑保護(hù)血管內(nèi)皮，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生，改善大腦微循環(huán)，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立，從而改善缺血區(qū)域炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終起到神經(jīng)保護(hù)作用。因此，活血榮絡(luò)方可能通過(guò)多靶點(diǎn)、多形式地參與多種生物學(xué)進(jìn)程，在腦梗死血管新生中起到保護(hù)作用。

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，活血榮絡(luò)方的作用通路主要涉及HIF-1信號(hào)通路、癌癥途徑、TNF信號(hào)通路、能量代謝途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等。Liu等[32]發(fā)現(xiàn)，小檗堿能激活HIF-1/VEGF信號(hào)通路，在腦梗死血管新生中發(fā)揮作用。Xue等[33]通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，雙過(guò)氧化釩可上調(diào)HIF-1α/VEGF通路，抑制PTEN促進(jìn)Akt磷酸化，從而增強(qiáng)腦梗死血管新生作用。TNF在缺血組織中表達(dá)，并能促進(jìn)血管生成。Huang等[34]發(fā)現(xiàn)，腦梗死血管生成與TNF信號(hào)通路中TNFR1介導(dǎo)的α5β1和αVβ3整聯(lián)蛋白上調(diào)有關(guān)。PI3K-Akt信號(hào)通路是通過(guò)PI3K磷酸化下游蛋白介導(dǎo)下游反應(yīng)發(fā)揮作用的，Akt能介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，磷酸化的Akt（p-Akt）是促血管新生最強(qiáng)生物因子，主要通過(guò)激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶，從而增加血管通透性，促血管重塑及擴(kuò)張，使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、代謝，同時(shí)p-Akt能高表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）、VEGF等血管生成因子，促進(jìn)血管新生[35]。Chen等[36]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1通過(guò)PI3K/Akt/mTOR通路增加HIF-1α和VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腦梗死血管新生。

腦梗死發(fā)生時(shí)，低氧狀態(tài)能誘導(dǎo)HIF-1信號(hào)通路引起血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧簇增加，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，使能量代謝障礙，致蛋白質(zhì)磷酸化[37]，并且能通過(guò)TNF激活癌癥途徑，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)因子如IL-6等表達(dá)水平升高，同時(shí)TNF及IL-6等能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬。因此，活血榮絡(luò)方在腦梗死血管新生中起保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過(guò)HIF-1α/VEGF通路、TNF信號(hào)通路、PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控氧化應(yīng)激途徑、炎癥反應(yīng)、能量代謝途徑、細(xì)胞凋亡及自噬等程序性死亡模式、趨化因子途徑等共同發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析活血榮絡(luò)方在腦梗死血管新生中的作用，預(yù)測(cè)其活性成分及共同靶點(diǎn)，分析可能作用機(jī)制，初步揭示其在腦梗死血管新生中的保護(hù)作用及其作用機(jī)制，可為進(jìn)一步相關(guān)研究及開發(fā)提供依據(jù)。

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Study on Mechanism ofPrescription in Angiogenesis of Cerebral Infarction Based on Network Pharmacology

YANG Renyi1, LIU Lijuan2, KANG Lei1, YAN Siyang1, TAN Huizhong1, FU Xinying1, YIN Qian1, ZHOU Desheng2

To study the role and mechanism ofPrescription in angiogenesis of cerebral infarction by network pharmacology.The main active components ofPrescription were collected and screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). The Swiss Target Prediction database was used to predict the main active component targets, and the target of angiogenesis in cerebral infarction was predicted by GeneCards database, and the common targets were screened and integrated. A common target PPI network was constructed using String database and Cytoscape software Network analyzer function. GO and KEGG enrichment analysis were performed on the common target using DAVID database combined with Cytoscape software.Totally 422 active components ofPrescription, 1028 targets, 169 targets for angiogenesis in cerebral infarction, and 42 common targets were screened, among which IL6, TNF, AKT1 and CASP3 were most obviously interacted, mainly regulating oxidative stress, apoptosis, protein phosphorylation, endothelial cells and smooth muscle cell proliferation and other biological processes, and HIF-1 signaling pathway, cancer pathway, TNF signaling pathway, energy metabolism pathway, PI3K-Akt signaling pathway, and mTOR signaling pathway.Prescription demonstrates the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway in angiogenesis of cerebral infarction, which is helpful to further interpret the pharmacological mechanism ofPrescription.

Prescription; network pharmacology; cerebral infarction; angiogenesis

R277.733.3；R285.5

A

1005-5304(2020)08-0098-08

10.3969/j.issn.1005-5304.201907340

國(guó)家自然科學(xué)基金（81874463）；湖南省科技計(jì)劃（2017SK4005）；湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃（201824、2020045）；湖南省財(cái)政中醫(yī)藥項(xiàng)目（rsk-010-13[006-09]）

周德生，E-mail：2478020529@qq.com

（2019-07-22）

（2019-08-19；編輯：陳靜）