劉金星，李星辰，陳玉，盧海燕

（桂林醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西 桂林）

0 引言

結(jié)腸癌(Colorectal cancer,CRC)已成為最常見的消化道惡性腫瘤之一, 其發(fā)病率和死亡率均居全球前列，并呈上升趨勢, 在我國, 結(jié)腸癌死亡率已位于惡性腫瘤死亡率的第五位[1], 嚴(yán)重影響人類健康和正常生活,目前國際上針對此結(jié)腸癌的治療手段主要以手術(shù)為主的綜合治療，但效果不理想，有研究表明結(jié)腸癌病人5年生存率為65.1%[2]，仍未達(dá)到期望值，并且傳統(tǒng)治療手段花費(fèi)高，大部分家庭無力負(fù)擔(dān)。因此，探明藥物介導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，尋找一種高效低毒的藥物具有重要臨床意義?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明芒柄花素（formononetin)具有良好的抗腫瘤等作用[3]，本實(shí)驗(yàn)擬通過不同濃度的芒柄花素（0、50、75、100μmol /L）分別作用于結(jié)腸癌RKO細(xì)胞株，觀察結(jié)腸癌RKO細(xì)胞MMP1、VEGFA、PPP2R2A蛋白水平變化，探討芒柄花素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制，結(jié)果報(bào)告如下。

1 主要儀器和試劑

結(jié)腸癌RKO細(xì)胞(桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室），98%芒柄花素（方西安云悅生物科技有限公司），Eppendorf Centrifuge 5810離 心 機(jī),CDW-86L328超 低溫冰箱，Eppendorf 超凈臺，美國伯樂垂直電泳儀Mini-PROTEA，MMP1、VEGFA、PPP2R2A抗體（碧云天生物科技有 限 公 司），PageRuler prest Protein Ladder，5級 WESTAR SUPERNONV，-20度冰箱，伯樂超靈敏多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDoc Touch，塞默細(xì)胞培養(yǎng)箱。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用培養(yǎng)液將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為（2-5）×109cell/mL，將細(xì)胞置于含10% 胎牛血清（購自合肥博美生物公司）和1%青霉素的1640培養(yǎng)基后在含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代，以上均為無菌操作。

2.2 采用Western blot法檢測RKO細(xì)胞蛋白表達(dá)

用不同濃度芒柄花素處理RKO細(xì)胞48h，提取總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測樣品蛋白濃度，以 3: 1 體積比與SDS-PAGE上樣緩沖液混合，置于-80度冰箱保存，配制好SDS-PAGE凝膠后上樣，調(diào)濃縮膠電泳電壓為80V、1h，分離膠為 120 V、1.5h，電泳完成后轉(zhuǎn)膜 2h，常規(guī)操作后加入 MMP1、VEGFA、PPP2R2A抗體（抗體稀釋度1：500）4 ℃緩慢搖晃孵育過夜，用TBST溶液洗PVDF膜 5 min×3次，羊抗鼠二抗（抗體稀釋度1：400）室溫孵育1h，用TBST溶液洗PVDF膜 5 min×3次，使用化學(xué)發(fā)光液A、B按1：1的比例混合均勻后，均勻涂抹于PVDF膜上，放置于化學(xué)發(fā)光儀，使用凝膠分析系統(tǒng)記錄并保存結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

RKO細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（MMP1蛋白、VEGFA、PPP2R2A蛋白）的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，對照組、實(shí)驗(yàn)組50、75、100μmol /L芒柄花素RKO細(xì)胞MMP1蛋白表達(dá)水平為呈下調(diào)趨勢；VEGFA蛋白表達(dá)水平為同樣呈下調(diào)趨勢，PPP2R2A蛋白表達(dá)水平為呈上調(diào)趨勢。

芒柄花素對MMP1、VEGFA、PPP2R2A蛋白表達(dá)水平的影響（見下圖）Wester blot結(jié)果表明，與對照組相比實(shí)驗(yàn)組50、75、100μmol/L芒柄花素RKO細(xì)胞蛋白表達(dá)分別：MMPI：（1.324±0.034）、（1.219±0.028）、（0.923±0.037）、（0.436±0.029）；（0.639±0.025）、（0.462±0.031）、34）、（0.517±0.022）、（1.218±0.0313）。對照組相比，實(shí)驗(yàn)組MMP1蛋白水平、VEGFA蛋白水平下調(diào)，PPP2R2A蛋白水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1

4 實(shí)驗(yàn)分析

凋亡是活體內(nèi)局部組織中單個(gè)細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的表現(xiàn)形式，細(xì)胞凋亡機(jī)制在細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，一旦細(xì)胞凋亡機(jī)制失去作用，細(xì)胞生長失控就會(huì)演變成癌細(xì)胞，在當(dāng)今以手術(shù)治療結(jié)腸癌為主特別是晚期結(jié)腸癌效果不佳的背景下，細(xì)胞凋亡機(jī)制成為結(jié)腸癌基因治療的熱點(diǎn)。芒柄花素存在于豆類植物紅車軸草的花序及帶花枝葉，刺芒柄花全草中，有研究發(fā)現(xiàn)芒柄花素對結(jié)腸癌[4]、乳腺癌[5]、膀胱癌[6]、鼻咽癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞的生長均有不同程度的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的芒柄花素作用于RKO細(xì)胞，觀察在細(xì)胞凋亡機(jī)制中的某些蛋白（MMP1、VEGFA、PPP2R2A）的表達(dá)情況，進(jìn)而探討其對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的介導(dǎo)作用。

間質(zhì)膠原酶（MMP1）作為MMPs家族的其中一類，能夠降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，參與機(jī)體生理及病理過程，與多種癌變有關(guān)，有研究證明，MMP1幾乎在所有類型的癌癥中均能表達(dá)，且其高表達(dá)往往預(yù)示著預(yù)后不良[8-10]，王大平等研究發(fā)現(xiàn)TIMPs能夠限制骨腫瘤向周圍組織浸潤和侵襲，可能與其抑制MMP1的活性有關(guān)。[11]。實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中離不開新血管的生成[8]，結(jié)腸癌作為實(shí)體惡性腫瘤的一類其發(fā)生發(fā)展過程自然也離不開血管的供應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)VEGFA過表達(dá)能夠有效的刺激新血管的產(chǎn)生[13],某些抗腫瘤藥物可以通過下調(diào)VEGFA蛋白水平抑制腫瘤血管的生成從而發(fā)揮抗腫瘤效果，姚子涵等研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，抑制裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤瘤體的生長，可能與下調(diào)VEGFA蛋白水平有關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果顯示MMP1、VEGFA蛋白水平均下調(diào)，且成濃度依賴性。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)PPP2R2A作為細(xì)胞凋亡通中的作用靶點(diǎn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)，Wei Zhao研究發(fā)現(xiàn)miR-556-5p通過抑制PPP2R2A的表達(dá)參與前列腺癌的發(fā)生[15]；Zhang Jing發(fā)現(xiàn)miR-614通過靶向PPP2R2A促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖[16]；Wen Long Liang發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-892a可能通過直接抑制PPP2R2A的表達(dá)選擇性的促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[17]，但藥物對PPP2R2A蛋白的直接調(diào)節(jié)作用卻鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過檢測PPP2R2A蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，結(jié)果呈上調(diào)趨勢，推測芒柄花素可能激活了細(xì)胞凋亡機(jī)制，促進(jìn)了RKO細(xì)胞凋亡

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

綜上，本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：芒柄花素可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，介導(dǎo)其凋亡，可能與下調(diào)MMP1、VEGFA蛋白水平，上調(diào)PPP2R2A蛋白水平，激活細(xì)胞凋亡機(jī)制有關(guān)。