大葉蒲公英耐鹽性變異株系的培育

張立娜 張曉東 王怡天 董梅英 魯雪林 王秀萍

摘要：以大葉蒲公英耐鹽愈傷組織為試驗(yàn)材料，采用植物組織培養(yǎng)的方法，研究不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、培養(yǎng)光質(zhì)、移栽基質(zhì)配比對(duì)其耐鹽性愈傷組織分化和組培苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，在相同不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隨鹽脅迫濃度梯度升高，大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織分化率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì);在大葉蒲公英耐鹽性組培苗培養(yǎng)過(guò)程中，選擇紅 ∶白=2 ∶3 的光質(zhì)，有利于組培苗的生長(zhǎng);幼苗移栽到 蛭石 ∶營(yíng)養(yǎng)土 ∶珍珠巖=1 ∶4 ∶3的混合基質(zhì)上成活率最高，為78%。最優(yōu)培養(yǎng)條件的確定對(duì)大葉蒲公英組培苗的后期高成苗率提供了保障。

關(guān)鍵詞：大葉蒲公英;組織培養(yǎng);基質(zhì)配比;耐鹽性;株系;成活率

中圖分類號(hào)：S567.23+9.043?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0174-04

我國(guó)從濱海到內(nèi)陸，從低海拔地區(qū)到高原地區(qū)都分布著不同類型的鹽漬化土壤，而且由于氣候變化、農(nóng)業(yè)灌溉方法不當(dāng)、過(guò)度放牧等原因，土壤次生鹽漬化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[1]。在耕地面積有限的情況下，開(kāi)發(fā)利用鹽荒地、選擇培育耐鹽植物品種及尋找提高植物耐鹽性的途徑和方法是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。

蒲公英為菊科多年生的草本植物，耐性好，適應(yīng)性強(qiáng)，為常用的清熱、解毒、消炎藥，同時(shí)也是一種保健野菜，被國(guó)家衛(wèi)生部列為藥食兼用食品[3]。隨著人們對(duì)蒲公英功能特性研究的深入和對(duì)健康生活追求的不斷提升，市場(chǎng)對(duì)優(yōu)良蒲公英品種的需求日益增長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)利用蒲公英的耐鹽特性，培育優(yōu)良的耐鹽品種對(duì)于蒲公英的開(kāi)發(fā)利用以及鹽漬化土壤的利用和改良都具有重要的意義[4]。大葉蒲公英的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都較高，而且生物量大，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。通過(guò)組織培養(yǎng)篩選耐鹽的愈傷組織，進(jìn)而培育出耐鹽的品種或品系，是蒲公英生物技術(shù)抗性育種的研究方向之一[5]。陳華等利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立了藥蒲公英的植株再生體系[6];張新果等通過(guò)篩選藥蒲公英的愈傷組織獲得藥蒲公英的耐鹽愈傷組織，并進(jìn)一步研究其生理生化特性[7-8];劉艷芬等以大葉蒲公英為材料，建立了完整的蒲公英再生體系，并篩選到不同梯度的耐鹽愈傷組織，誘導(dǎo)獲得大葉蒲公英耐鹽變異株[9-10]。

筆者所在課題組前期以大葉蒲公英葉片為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，在含鹽培養(yǎng)基上篩選獲得了不同鹽濃度梯度下的耐鹽愈傷組織[9-10]，并通過(guò)進(jìn)一步誘導(dǎo)分化獲得了不同鹽濃度梯度下的耐鹽性變異株系。本研究以不同鹽濃度梯度下的大葉蒲公英耐鹽性變異株系為試驗(yàn)材料，研究不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、培養(yǎng)光質(zhì)、移栽基質(zhì)配比對(duì)其生長(zhǎng)的影響，以期為進(jìn)一步快速、高效地培育大葉蒲公英耐鹽品種及促進(jìn)蒲公英產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以大葉蒲公英葉片為外植體，經(jīng)不同鹽濃度梯度（0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%）培養(yǎng)基篩選得到耐鹽性愈傷組織，分別命名為T(mén)1、T2、T3、T4、T5、T6[9]，通過(guò)進(jìn)一步誘導(dǎo)分化獲得了蒲公英耐鹽再生株系。培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，光照度為1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為16 h/d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的分化情況

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將耐鹽性愈傷組織在MS+0.2 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.01 mg/L萘乙酸（NAA）的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)（前期試驗(yàn)），連續(xù)觀察25 d，并記錄組培苗不定芽生長(zhǎng)分化情況。

1.2.2 培養(yǎng)光質(zhì)對(duì)大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗生長(zhǎng)勢(shì)的影響

以“1.2.1”節(jié)中的試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選擇大葉蒲公英耐鹽性變異體T2作為后續(xù)試驗(yàn)材料。繼代培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)健壯的T2組培苗分為2組（Y1-T2、Y2-T2），每組10瓶，在紅白光（2 ∶3）和日光燈的光照條件下培養(yǎng)。25 d后測(cè)定并記錄組培苗葉長(zhǎng)、干質(zhì)量、鮮質(zhì)量。

1.2.3 基質(zhì)配比對(duì)大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗移栽的影響

選取直徑為50 mm的育苗盆，每盆裝60 g不同配比基質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。第1組試驗(yàn)共6個(gè)基質(zhì)配比處理（A～F），每個(gè)處理5個(gè)重復(fù);在第1組試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，改良營(yíng)養(yǎng)土和蛭石比例，并添加不同比例珍珠巖，進(jìn)行第2組6個(gè)基質(zhì)配比處理（G～L），每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)（表1）。幼苗生長(zhǎng)溫度控制在（25±2） ℃，相對(duì)濕度控制在（70±2）%，分別在移栽后5、10、15、20、25、30 d記錄幼苗成活率，根據(jù)成活率及生長(zhǎng)狀況選取最適宜生長(zhǎng)基質(zhì)配比。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的分化情況

將大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在MS+0.2 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，15 d后，蒲公英耐鹽性愈傷組織 T1～T6 均出現(xiàn)分化增殖現(xiàn)象，幼苗基部逐漸腫大，并有新的愈傷生成，新葉逐漸生長(zhǎng)，顏色為淺綠色。20 d后，蒲公英耐鹽性愈傷組織T1～T6組培苗均發(fā)生不同程度的不定芽分化，25 d后剔除褐變及染菌材料，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)發(fā)生情況。觀察發(fā)現(xiàn)，同種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)不同大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織的不定芽分化影響不同（表2），隨著鹽脅迫濃度增高，愈傷組織不定芽分化程度降低。蒲公英耐鹽性愈傷組織T1～T3不定芽分化較多，幼苗生長(zhǎng)較好;蒲公英耐鹽性愈傷組織T4～T6不定芽分化減少，葉片發(fā)黃，幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱（圖1）。蒲公英耐鹽性愈傷組織T2的不定芽增殖倍數(shù)較高，為8.3，分化率高，且幼苗生長(zhǎng)狀態(tài)良好，所以后期幼苗移栽等試驗(yàn)選取愈傷組織T2分化形成的蒲公英耐鹽性變異株系。

2.2 培養(yǎng)光質(zhì)對(duì)大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗生長(zhǎng)勢(shì)的影響

從圖2可以看出，不同光譜條件對(duì)蒲公英組培苗生長(zhǎng)勢(shì)有著明顯的影響，2 ∶3紅白光照射下的Y2-T2比日光燈照射下的Y1-T2長(zhǎng)勢(shì)好，生長(zhǎng)速度快。Y2-T2的葉片平均長(zhǎng)度為6.5 cm，而Y1-T2的葉片平均長(zhǎng)度僅為4.3 cm（圖2-B）。Y2-T2的平均干質(zhì)量為0.81 g，鮮質(zhì)量為1.77 g，Y1-T2的平均干質(zhì)量為0.39 g，鮮質(zhì)量為1.23 g（圖2-A）。在2 ∶3紅白光照射下，幼苗的葉片長(zhǎng)度，干質(zhì)量、鮮質(zhì)量都大于日光燈下。因此，在蒲公英組培苗培養(yǎng)過(guò)程中時(shí)， 可選擇紅 ∶白=2 ∶3的光質(zhì)， 以提高蒲公英組培苗的生長(zhǎng)速度及幼苗長(zhǎng)勢(shì)。

2.3 基質(zhì)配比對(duì)大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗移栽的影響

由第1組試驗(yàn)結(jié)果（表3）可知，幼苗移栽到基質(zhì)中30 d 后，蛭石和營(yíng)養(yǎng)土的比例為2 ∶3時(shí)幼苗成活率最高，為60%。但是葉色黃綠，長(zhǎng)勢(shì)一般，根系生長(zhǎng)弱。為了進(jìn)一步提高移栽幼苗成活率，第2組試驗(yàn)適當(dāng)調(diào)節(jié)蛭石和營(yíng)養(yǎng)土比例，并加入了一定量的珍珠巖。當(dāng)蛭石、營(yíng)養(yǎng)土和珍珠巖比例為 1 ∶4 ∶3 時(shí)成活率最高，為78%，且幼苗葉片呈青綠色，葉基堅(jiān)挺，根系長(zhǎng)勢(shì)較好，新根長(zhǎng)出1～4條，說(shuō)明該比例較適于幼苗移栽成活。

3 討論與結(jié)論

3.1 大葉蒲公英耐鹽性愈傷組織在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的分化情況

鹽脅迫能夠改變細(xì)胞膜的正常透性，影響細(xì)胞一系列的生理代謝，造成植物發(fā)育遲緩，抑制植物組織和器官的生長(zhǎng)和分化[11]。徐爽在對(duì)蘋(píng)果屬2種植物愈傷組織和組培苗的生長(zhǎng)發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫使得2種蘋(píng)果屬植物的生長(zhǎng)速率受到了較大的影響，并且出現(xiàn)了不同程度的組織損傷，給蘋(píng)果的健康帶來(lái)了較大損害[12]。本研究中，相同的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)不同蒲公英耐鹽性愈傷組織的不定芽分化影響不同，隨鹽脅迫濃度梯度增高，愈傷組織不定芽分化率逐漸降低。蒲公英耐鹽性愈傷組織T1～T3不定芽分化較多，幼苗生長(zhǎng)較好;蒲公英耐鹽性愈傷組織T4～T6不定芽分化減少，葉片發(fā)黃，幼苗長(zhǎng)勢(shì)弱。說(shuō)明前期的鹽脅迫培養(yǎng)對(duì)愈傷組織細(xì)胞產(chǎn)生了滲透損傷，使得愈傷組織的分化能力降低，且隨著鹽脅迫濃度的增高，這種損傷增大，愈傷組織分化程度降低且幼苗長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)酢?/p>

3.2 培養(yǎng)光質(zhì)對(duì)大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗生長(zhǎng)勢(shì)的影響

魏星等通過(guò)研究不同光質(zhì)對(duì)菊花組培苗生長(zhǎng)的影響認(rèn)為，新型半導(dǎo)體光源LEDs是植物組織培養(yǎng)的理想光源[13]。蘇俊等對(duì)煙草組培苗的研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，紅藍(lán)綠和紅藍(lán)白組合光質(zhì)，使煙草組培苗植株株高、葉長(zhǎng)、葉寬、葉面積、莖粗、根數(shù)、根長(zhǎng)和干質(zhì)量顯著增加，植株葉綠素含量也有提高但差異不顯著[14]。任桂萍等使用LED的不同光源照射蝴蝶蘭組培苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同光源對(duì)其生根和分化增殖效果的影響不同，紅色的LED光照射可以促進(jìn)葉芽的生長(zhǎng)，而對(duì)于葉綠素的增長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用[15]。孫翊等對(duì)非洲菊組培苗的研究發(fā)現(xiàn)，不同LED光質(zhì)條件下，非洲菊組培苗的增殖系數(shù)差異顯著，其中紅藍(lán)光比例為4 ∶1處理顯著高于其他處理[16]。在本研究中，大葉蒲公英組培苗培養(yǎng)過(guò)程中，選擇 2 ∶3 紅白光質(zhì)，增強(qiáng)了植物的光合作用效率，使得幼苗葉片長(zhǎng)度及干鮮質(zhì)量都有明顯增加，提高了組培苗的生長(zhǎng)速度，為快速繁育大葉蒲公英耐鹽性變異株提供了有利條件。

3.3 基質(zhì)配比對(duì)大葉蒲公英耐鹽性變異組培苗移栽的影響

細(xì)蛭石保水性效果好，珍珠巖透氣性較好，二者混合，保證了基質(zhì)的保水透氣性，搭配適量營(yíng)養(yǎng)土，能夠提供植物生長(zhǎng)所需土壤營(yíng)養(yǎng)成分，提高大葉蒲公英耐鹽性變異株移栽成活率。本研究將根系生長(zhǎng)良好的大葉蒲公英耐鹽性變異株，移栽于營(yíng)養(yǎng)土 ∶蛭石 ∶珍珠巖=1 ∶4 ∶3的混合基質(zhì)中時(shí)，移栽成活率最高，達(dá)78%。

經(jīng)過(guò)對(duì)大葉蒲公英耐鹽愈傷組織的不定芽分化誘導(dǎo)、培養(yǎng)光質(zhì)的選擇和移栽基質(zhì)的篩選，使其組培苗移栽技術(shù)得以完善，基本建立了大葉蒲公英耐鹽性變異株系的培育體系，為后續(xù)培育和開(kāi)發(fā)應(yīng)用大葉蒲公英耐鹽株系提供理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2019-08-09

基金項(xiàng)目：河北省農(nóng)林科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（編號(hào)：F18R18001）;河北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：16226304D）。

作者簡(jiǎn)介：張立娜（1983—），女，河北任丘人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事作物種質(zhì)創(chuàng)新及基因挖掘研究。E-mail：3336905069@qq.com。

通信作者：張曉東，副研究員，主要從事濱海鹽堿地高效利用方面的研究。E-mail：bhszxd@163.com。