元麥β-葡聚糖衍生物的合成及其抑菌作用

宋居易 陳惠 魏亞鳳 劉建

摘要：以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為試驗菌，比較元麥β-葡聚糖和其衍生物對這2種細菌的體外抑菌作用，為元麥β-葡聚糖在食品保鮮中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。以元麥β-葡聚糖為原料，采用氨基磺酸為酯化劑，制備硫酸化元麥β-葡聚糖;氯乙酸為醚化劑，制備羧甲基元麥β-葡聚糖;通過測量抑菌圈直徑、最低抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)、細菌生長曲線來考察元麥β-葡聚糖和其衍生物的抑菌活性。結(jié)果表明，制備出的硫酸化元麥β-葡聚糖取代度為0.82，修飾后的β-葡聚糖羧甲基的取代度為0.70，且紅外光譜表明，元麥β-葡聚糖分子中已經(jīng)分別成功引入了這2種基團;對比3種樣品的抑菌活性，羧甲基元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性均較好，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為40 mg/mL，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為80 mg/mL。綜上所述，羧甲基元麥β-葡聚糖可用作生物抑菌劑。

關(guān)鍵詞：元麥β-葡聚糖;硫酸化;羧甲基化;抑菌

中圖分類號：TS201?? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0234-05

β-葡聚糖是一類存在于谷類作物和某些微生物中的高分子多糖。微生物中尤以酵母菌等真菌細胞壁中β-葡聚糖含量較高;谷物中一般以大麥和燕麥含量較高，大麥含量最高，燕麥次之[1]，元麥（裸大麥）的β-葡聚糖含量高于皮大麥，是食物中可溶性纖維的最佳來源[2]。β-葡聚糖由于具有天然、安全、無毒、可降解等特點，可作為生物保鮮劑進行開發(fā)，但它本身難溶于水，無法很好地發(fā)揮抑菌效果，抗菌譜不夠?qū)?。因此，對?葡聚糖進行改性研究，為β-葡聚糖在食品保鮮中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，同時為食品深加工提供新思路，促進食品產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，對我國食品安全具有重大的戰(zhàn)略意義。

在ISI和CNKI數(shù)據(jù)庫中，對2001—2011年與葡聚糖相關(guān)的國際文獻和國內(nèi)文獻分別進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外學(xué)者對葡聚糖的研究主要集中在提取、結(jié)構(gòu)和活性方面，但關(guān)于修飾改性葡聚糖使其具有更強或者新的生物活性的研究尚未成熟，相關(guān)領(lǐng)域研究的文獻數(shù)量均不多[3]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，羧甲基化會使虎奶菇菌核β-葡聚糖分子質(zhì)量Mw從1×104～42×104 g/mol增至2.08×104～53.2×104 g/mol，而且體內(nèi)和體外試驗均表明，經(jīng)羧甲基化修飾改性的β-葡聚糖具有抗腫瘤活性，而未修飾改性的β-葡聚糖無抗腫瘤活性[4]。Williams等采用二甲基亞砜和脲組成的均相反應(yīng)體系和濃硫酸對釀酒酵母β-葡聚糖進行硫酸酯化改性，研究發(fā)現(xiàn)，酵母葡聚糖硫酸酯具有良好的水溶性、巨噬細胞活性和骨髓刺激作用，并且具有抗腫瘤活性[5]。Chen等分別研究了磷酸酯化修飾改性茯苓β-葡聚糖和茯苓菌絲α-葡聚糖的鏈構(gòu)象及抗腫瘤活性，這一改變使得茯苓β-葡聚糖磷酸酯和茯苓菌絲α-葡聚糖磷酸酯具有顯著的抗腫瘤活性[6-7]。目前，葡聚糖的修飾改性及其抑菌功能的研究較多集中在酵母葡聚糖上。牛宏彥等利用得到的硫酸化葡聚糖進行體外和體內(nèi)抑制大腸桿菌效果研究，小鼠活體試驗結(jié)果表明，硫酸化葡聚糖能顯著提高大腸桿菌致腹膜炎的小鼠的成活率[8]。王米等測定了硫酸化酵母葡聚糖對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、豬鏈球菌等的體外抗菌活性，結(jié)果表明，葡聚糖對這幾種菌具有一定的抑制作用[9]。

而關(guān)于元麥β-葡聚糖修飾改性并研究其抑菌作用的報道很少看到。本研究以元麥β-葡聚糖為原料，對其進行硫酸化和羧甲基化，得到易溶于水的元麥β-葡聚糖衍生物，并研究其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用，篩選出活性較高的 β-葡聚糖衍生物，為元麥β-葡聚糖的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

元麥β-葡聚糖由江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供;試驗使用的菌株分別是大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538;營養(yǎng)瓊脂和營養(yǎng)肉湯均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;主要儀器設(shè)備有DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗設(shè)備有限公司）、LDZX-50KBS高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、BS-lEA恒溫振蕩培養(yǎng)箱（常州國華電器有限公司）、SCL-1300型垂直流潔凈工作臺（北京賽伯樂實驗儀器有限公司）、Avatar FTIR360 紅外光譜儀（美國Nicolet公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 元麥β-葡聚糖硫酸化

1.2.1.1 硫酸化元麥β-葡聚糖的制備[10]

稱取0.5 g元麥β-葡聚糖溶于30 mL甲酰胺中，磁力攪拌使其充分溶解，加入1 g氨基磺酸，在70 ℃水浴下反應(yīng)4 h，冰水浴冷卻，用NaOH調(diào)pH值至中性，加入3倍體積無水乙醇使多糖沉淀，于4 ℃靜置，離心，沉淀用水復(fù)溶，透析2 d，冷凍干燥得硫酸化元麥β-葡聚糖。

1.2.1.2 元麥β-葡聚糖硫酸化取代度的測定[11] 根據(jù)下列公式計算樣品取代度（degree of substitution，簡稱DS）：

DS=（1.62×S%）/（32-1.02×S%）

式中：DS表示硫酸根取代度;S%表示硫元素含量（m/m），由硫酸根含量折算而得。

1.2.2 元麥β-葡聚糖羧甲基化

1.2.2.1 羧甲基元麥β-葡聚糖的制備

根據(jù)文獻[12-13]進行操作，略有改變。稱取2 g元麥 β-葡聚糖，加入到裝有20 mL異丙醇的三口燒瓶，放入65 ℃恒溫水浴鍋中加熱并振蕩1 h;加入質(zhì)量濃度為40%的NaOH溶液并攪拌，于65 ℃條件下反應(yīng) 2 h;堿化完成后，稱取200 mL的氯乙酸，緩慢加入后，反應(yīng)5 h;反應(yīng)結(jié)束后，添加蒸餾水至溶解，用鹽酸中和停止反應(yīng)，后抽濾，濾液依次用70%乙醇、無水乙醇洗滌，二次抽濾;然后將沉淀物放置于65 ℃烘箱中干燥，即可得到羧甲基元麥β-葡聚糖試樣。

1.2.2.2 元麥β-葡聚糖羧甲基化取代度的測定[13]

利用下式計算羧甲基元麥β-葡聚糖的取代度。

DS=0.161A/（1-0.058A）;

A=（V2-V1）m/W。

式中：DS表示取代度;A表示每克樣品中羧甲基的毫摩爾數(shù);V2表示pH值為4.3時滴定消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積;V1表示pH值為2.1時滴定消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積;m表示樣品凈重;W表示NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。

1.2.3 改性元麥β-葡聚糖紅外光譜測定

采用KBr壓片，400～4 000 cm 區(qū)間掃描。

1.2.4 元麥β-葡聚糖衍生物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌試驗[14-17]

1.2.4.1 菌種的活化與菌懸液的制備

試驗前將所選菌種進行傳代培養(yǎng)，用取菌環(huán)將菌種以劃線法接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，并按上述操作將所需菌種培養(yǎng)到第3代以上。將菌種活化后，培養(yǎng)至菌種生長良好。用接種環(huán)蘸取少量菌落于滅菌生理鹽水中，搖勻，稀釋成1×106～1×107 CFU/mL的菌懸液。

1.2.4.2 牛津杯法測定抑菌作用

將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約20 mL，凝固。吸取200 μL 菌液入平板表面，用涂布器將菌液涂布均勻。在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，在杯中加入200 μL不同稀釋度的待測樣品，37 ℃培養(yǎng)12 h，測定抑菌圈直徑（含孔徑），以抑菌圈直徑的大小表示抑菌活性的大小。

1.2.4.3 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡稱MIC） 的測定

采用2倍稀釋法將硫酸化元麥β-葡聚糖和羧甲基化元麥β-葡聚糖供試液稀釋成濃度分別為160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL 等7個系列濃度稀釋溶液，向平皿中分別移取不同濃度的稀釋液各1.0 mL，再分別移取各菌懸液0.2 mL，然后倒入相應(yīng)的溫度在 60 ℃左右的固體培養(yǎng)基，充分混勻，待其冷卻凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，在適宜溫度下培養(yǎng)、觀察，以不長菌的最低濃度為最小抑制濃度。

1.2.4.4 羧甲基元麥β-葡聚糖作用下供試菌生長曲線的測定

以D600 nm為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間t為橫坐標(biāo)，繪制羧甲基元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用的生長曲線圖。

1.2.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸化元麥β-葡聚糖的紅外光譜

由圖1、圖2對比可以看出，在1 243、818 cm-1處有特征吸收峰，它們分別對應(yīng)S[FY=，1]O伸縮振動吸收峰和C—O—S吸收峰，這2個特征吸收峰可以說明硫酸根已經(jīng)連接在元麥β-葡聚糖上了。用電位滴定法測得的產(chǎn)品的取代度為0.82。

2.2 羧甲基元麥β-葡聚糖的紅外光譜

由圖1、圖3對比可以看出，在1 609、1 480 cm-1 處有特征吸收峰，它們分別對應(yīng) —COO— 特征吸收峰和與—COO—相連的次甲基吸收峰，這2個特征吸收峰可以說明元麥β-葡聚糖已經(jīng)發(fā)生了羧甲基化。用電位滴定法測得的產(chǎn)品的取代度為0.70。

2.3 不同元麥β-葡聚糖改性產(chǎn)物的抗菌活性

經(jīng)過12 h的培養(yǎng)，元麥β-葡聚糖、硫酸化元麥β-葡聚糖以及羧甲基元麥β-葡聚糖對2種細菌顯示出不同的抗菌活性，分別測量抑菌圈直徑。由表1可看出，元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均是低敏感度的（抑菌圈直徑在0～10 mm），硫酸化和羧甲基的元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌是高敏感度的（抑菌圈直徑在15～20 mm），兩者對大腸桿菌是中敏感度的（抑菌圈直徑在10～14 mm）。硫酸化和羧甲基化的元麥 β-葡聚糖對2種細菌的抑菌圈直徑更大一些，這是由于水溶性的元麥β-葡聚糖擴散性更好，可以更加迅速地進入細胞內(nèi)部，擾亂細胞的正常代謝，從而使抑菌效果更強。羧甲基元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑均顯著大于硫酸化元麥β-葡聚糖的（P<0.05）。綜上所述，對2種細菌抑菌效果均較好的是羧甲基元麥β-葡聚糖。

2.4 最低抑菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)（MIC）的測定

選取對這2種供試菌均有較強抑制作用的羧甲基元麥β-葡聚糖，測定其MIC。由表2可知，當(dāng)羧甲基元麥β-葡聚糖的濃度大于80 mg/mL時，對這2種致病菌均表現(xiàn)出良好的抑菌效果。羧甲基元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用強于大腸桿菌，其對金黃色葡萄球菌的MIC為40 mg/mL，對大腸桿菌的MIC為80 mg/mL。

2.5 羧甲基元麥β-葡聚糖對2種細菌生長曲線的影響

由圖4可知，添加1/4MIC、1/2MIC、MIC的羧甲基元麥β-葡聚糖，金黃色葡萄球菌的生長受到了抑制，1/4MIC的羧甲基元麥β-葡聚糖可以輕微抑制金黃色葡萄球菌的生長，1/2MIC的羧甲基元麥 β-葡聚糖抑制1/3左右的金黃色葡萄球菌生長量，MIC的羧甲基元麥β-葡聚糖可以完全限制金黃色葡萄球菌的生長，說明其抑菌作用具有一定的濃度梯度性。

由圖5可知，濃度在1/4MIC時，羧甲基元麥 β-葡聚糖對大腸桿菌沒有抑制作用，1/2 MIC的羧甲基元麥β-葡聚糖抑制了大腸桿菌生長的1/6左右，處于MIC的羧甲基元麥β-葡聚糖對大腸桿菌生長具有明顯的抑制作用，令其立即停止生長。

3 結(jié)論

根據(jù)試驗結(jié)果可知，對元麥β-葡聚糖進行改性，制備出取代度為0.82的硫酸化元麥β-葡聚糖和取代度為0.70的羧甲基元麥β-葡聚糖， 且紅外光譜表明，元麥β-葡聚糖分子中已經(jīng)分別成功引入了這2種基團。

研究元麥β-葡聚糖2種衍生物的抑菌活性，結(jié)果表明，羧甲基元麥β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑均最大，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為40 mg/mL，對大腸桿菌的最低抑菌濃度為80 mg/mL，對這2 種致病菌生長曲線的抑制作用也呈現(xiàn)一定濃度依賴性。

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收稿日期：2019-08-11

基金項目：南通市應(yīng)用基礎(chǔ)研究（編號：MS12017022-6）。

作者簡介：宋居易（1989—），女，安徽淮南人，碩士，助理研究員，主要從事食品加工及貯藏研究。E-mail：songjuyi526@163.com。

通信作者：劉 建，碩士，研究員，主要從事元麥的研究。E-mail：ntliuj@sina.com。