田 雨,王艷殊,張佳楠,許世超,董全中,李文濱,李文霞,寧海龍

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院,大豆生物學教育部重點實驗室,農(nóng)業(yè)部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院 克山分院,黑龍江 克山 161606)

大豆(Glycinemax(L.) Merr.)是重要的食用油和植物蛋白的來源,在農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟生產(chǎn)中占據(jù)舉足輕重的地位,提高油分含量和蛋白質(zhì)含量是大豆育種的主要目標。為了加快育種進程,分子標記技術(shù)定位QTL已廣泛應(yīng)用于大豆蛋白質(zhì)和油分含量的遺傳育種研究中,國內(nèi)外關(guān)于大豆蛋白質(zhì)和油分含量QTL定位的報道已有很多,控制蛋白質(zhì)和油分性狀的 QTL 基本分散在 20條染色體上[1-4]。1992 年,Diers等[5]利用A81356022×PI468916雜交得到F2∶3單株60個,定位了8個蛋白質(zhì)和9個油分含量 QTL。 1996 年Lee等[6]利用 Young×PI 416937 雜交得到124個株系的F4分離群體定位了 13 個蛋白質(zhì)和 6 個油分含量 RFLP 位點,另外,利用 PI 97100×COKER 237 雜交得到111個株系F2的分離群體定位了6個蛋白質(zhì)和5個油分含量RFLP位點。 2011年,葛振宇等[7]以栽培大豆TK780 與野生大豆 Hidaka4 雜交得到包含96 個株系的重組自交系(RILs),利用該群體定位了 2 個蛋白質(zhì)含量 QTL和3 個油分含量 QTL。 2013年,Rossi等[3]利用來自加拿大和中國的2個品種OAC Millenium和黑農(nóng)38雜交得到92個株系的F4∶7RIL群體,定位了4個油分和4個蛋白含量QTL。2010年,Liang等[8]利用晉豆 23×Huibuzhi得到含有474個株系的F13RIL群體,利用SSR標記分析共定位到5個蛋白質(zhì)含量和6個油分含量QTL。2012年,Wang等[2]利用SD02-4-59×A02-381100得到含有87個株系的F5RIL群體,利用SSR和SNP標記分析共定位到9個油分含量QTL。 2003年,Chung等[9]利用A3733×P1437088A得到包含75個株系的F5RIL群體,利用SSR標記分析定位到一個蛋白和一個油分含量QTL,位于連鎖群I上。2014年,Wang等[10]利用2個群體SD02-4-59 ×A02-381100和 SD02-911×SD00-1501,共定位到16個油分含量和11個蛋白含量QTL。2015年, Han等[11]利用中豆 27×九農(nóng) 20得到RIL群體,定位到9個蛋白質(zhì)含量和9個油分含量QTL。截至目前,Soybase 網(wǎng)站(www.soybase.org)統(tǒng)計了241個蛋白含量的 QTL 位點,320 個油分含量的 QTL 位點。

綜上所述,國內(nèi)外定位的蛋白質(zhì)和油分含量QTL數(shù)量很多,但多是運用單一環(huán)境進行兩親本衍生的群體定位,同時蛋白質(zhì)和油分含量表現(xiàn)為數(shù)量性狀,其遺傳基礎(chǔ)復雜,這可能使遺傳發(fā)生較高的偏分離,從而降低遺傳作圖精度。本研究應(yīng)用前期構(gòu)建的關(guān)聯(lián)重組自交系群體,關(guān)聯(lián)重組自交系群體中由于含有共同的親本(東農(nóng)L13),突破了以往單一親本的限制,可以增加后代的多態(tài)性以及變異率,使后代在具有更高變異的同時還可以使2個遺傳圖譜間緊密聯(lián)系,提高作圖精度,拓展圖譜豐富度,在研究大豆蛋白質(zhì)和油分QTL時降低了定位誤差,從而提高主效QTL的真實性。

1 材料和方法

1.1 關(guān)聯(lián)重組自交系的構(gòu)建

2008年用品質(zhì)性狀差異較大的大豆親本東農(nóng)L13(蛋白質(zhì)含量45.50%,油分含量18.74%)、合農(nóng)60(蛋白質(zhì)含量38.47%,油分含量22.25%)和黑河36(蛋白質(zhì)含量39.8%,油分含量19.28%),配制2個雜交組合,分別獲得東農(nóng)L13×合農(nóng)60的F1和L13×黑河36的F1,將F1自交,自F2世代,在每一單株按單粒傳法摘粒,在哈爾濱和海南島連續(xù)自交5代,獲得關(guān)聯(lián)重組自交系群體。東農(nóng)L13×黑河36衍生的重組自交系群體(RIL3613)包含134個家系,東農(nóng)L13×合農(nóng)60衍生的重組自交系群體(RIL6013)包含156個家系,用于本研究的蛋白質(zhì)和油分含量QTL初步定位。

1.2 田間試驗與性狀調(diào)查

分別于2013,2014,2015年分別在黑龍江省克山和哈爾濱進行田間試驗。將3個親本和2個 RIL在田間種植,其中親本種植40株,田間試驗采取隨機區(qū)組試驗設(shè)計,3次重復,每小區(qū)3行,行長3 m,行距0.7 m,株距0.07 m。田間管理同一般大田栽培。成熟后收獲種子應(yīng)用Perton8620近紅外品質(zhì)分析儀測定蛋白質(zhì)含量和油分含量[12]。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

對多年多點條件下蛋白質(zhì)和油分含量數(shù)據(jù)進行描述性分析,并使用SAS 9.1軟件對不同環(huán)境下的表型觀測值進行聯(lián)合方差分析,估算相應(yīng)的方差分量,通過遺傳方差、基因型與環(huán)境互作方差和誤差方差進行遺傳率的估計,遺傳率估計的計算方法如下：

1.4 QTL定位分析

基于前期研究構(gòu)建的連鎖圖譜[13],對各環(huán)境的蛋白質(zhì)和油分含量分別采用完備復合區(qū)間作圖法進行QTL定位,其統(tǒng)計分析過程通過IciMapping軟件實現(xiàn)。背景標記選擇的概率標準為0.001,染色體掃描步長為1 cM,LOD值得全基因組臨界值由排列法(Permutation)確定,重復次數(shù)為1 000次,第一類錯誤的臨界值為0.05,最小臨界值為2.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

對3個環(huán)境下蛋白質(zhì)和油分含量的分析(表1)可看出,在RIL3613和RIL6013的蛋白質(zhì)含量和油分含量存在較大的變異,2個群體的蛋白質(zhì)含量和油分含量在基因型間或不同環(huán)境條件下差異均達極顯著水平,且環(huán)境和基因型之間存在極顯著的互作效應(yīng)。蛋白質(zhì)和油分性狀在兩群體中均表現(xiàn)為連續(xù)分布(圖1),表明蛋白質(zhì)含量和油分含量這2個性狀是受多基因控制的數(shù)量性狀,在E1環(huán)境下,RIL6013群體油分含量高于RIL3613群體油分含量,RIL3613群體在E2環(huán)境下油分含量高于E1環(huán)境,兩群體在E3環(huán)境下油分和蛋白質(zhì)含量均表現(xiàn)較為集中。因此,可用該群體進行QTL定位研究,并且不同環(huán)境下定位結(jié)果可能發(fā)現(xiàn)不同的QTL。

表1 不同環(huán)境下2個群體蛋白質(zhì)和油分含量的方差分析Tab.1 Analysis of variance on protein and oil contents across multiple environments in RIL

E1.克山2013；E2.哈爾濱2014；E3.哈爾濱2015。E1.Keshan in 2013；E2.Harbin in 2014；E3.Harbin in 2015.

2.2 蛋白質(zhì)含量的 QTL 定位

本試驗在3個環(huán)境中檢測到控制大豆蛋白質(zhì)含量QTL共8個,定位在大豆的7個連鎖群上(表2),在RIL3613群體中檢測到6個蛋白質(zhì)含量相關(guān) QTL,分布于連鎖群O、B1、F、D2、L、I、G上,LOD值分別為3.11,2.60,4.06,3.04,3.89和4.77,貢獻率分別為11.53%,11.76%,7.93%,7.29%,12.11%和7.56%,其中qPro-O-1、qPro-B1-1、qPro-I-1的貢獻率高于10%，加性效應(yīng)分別為1.31,0.38,-0.91,0.82,1.12和0.60,其中,qPro-O-1、qPro-B1-1、qPro-L-1、qPro-I-1和qPro-G-1的正向加性效應(yīng)來自于親本東農(nóng)L13,而qPro-D2-1的正向加性效應(yīng)來自于親本黑河36。在RIL6013群體中檢測到2個蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL,分布于連鎖群O、F上,LOD值分別為2.65和3.04,貢獻率分別為6.53%和9.26%,加性效應(yīng)分別為0.76和-0.71,其中,qPro-O-2的正向加性效應(yīng)來自于親本東農(nóng)L13,而qPro-F-1的正向加性效應(yīng)來自于親本合農(nóng)60。

表2 不同環(huán)境下蛋白質(zhì)含量QTL定位結(jié)果Tab.2 QTLs underlying protein content in soybean detected in different environments

2.3 油分含量的 QTL 定位

在3個環(huán)境中檢測控制大豆油分含量QTL 5個(表3),定位在大豆的5個連鎖群上,在RIL3613群體中檢測到2個油分含量相關(guān)QTL,分布于連鎖群D1a和A2上,LOD值分別為3.16和5.67,貢獻率分別為9.95%和17.73%,加性效應(yīng)分別為-0.23和-0.38,正向加性效應(yīng)來自于親本黑河36,其中,qOil-A2-1可以同時在2013年克山和2014年哈爾濱的2個環(huán)境中檢測到為多環(huán)境通用QTL。在RIL6013群體中檢測到3個油分含量相關(guān)QTL,分布于連鎖群C1、H和D2上,LOD值分別為3.61,2.75和5.33,貢獻率分別為11.84%,5.72%和13.62%,加性效應(yīng)分別為-0.40,-0.27和-0.43,正向加性效應(yīng)來自于親本合農(nóng)60。兩群體共檢測到貢獻率高于10%的QTL有3個，分別為qOil-C1-1、qOil-A2-1、qOil-D2-1。

表3 不同環(huán)境下油分含量QTL定位結(jié)果Tab.3 QTLs underlying oil content in soybean detected in different environments

3 討論

在以往的QTL定位群體中,多是應(yīng)用單個雙親本衍生的群體,由于分子標記的多態(tài)性的原因,使構(gòu)建的遺傳圖譜難以覆蓋全基因組區(qū)域,因此,也不可能發(fā)現(xiàn)遺漏基因組區(qū)域上的QTL。為覆蓋不同基因組區(qū)域,可采用同一個親本與多個親本雜交衍生的關(guān)聯(lián)重組自交系群體進行圖譜構(gòu)建,通過不同親本與共同親本間分子標記的多態(tài)性以增加基因組的覆蓋范圍,進而提高QTL發(fā)掘能力。Buckler等[14]構(gòu)建了包含25個玉米株系的RIL群體的關(guān)聯(lián)重組自交系群體,對玉米開花期性狀進行研究,在2個群體中共同發(fā)現(xiàn)了大量的微效QTL。李君[15]構(gòu)建了包含2個小麥RIL的關(guān)聯(lián)重組自交系群體進行QTL檢測,其中有13對 QTL 在 2 個 RIL 群體中被同時定位或具有相同的連鎖標記區(qū)間。本研究采用東農(nóng)L13作為共同親本與合農(nóng)60和黑河36分別雜交,構(gòu)建了包含2個RIL 群體的關(guān)聯(lián)重組自交系群體進行蛋白質(zhì)和油分含量的QTL定位。應(yīng)用RIL3613定位了6個蛋白質(zhì)含量QTL,而RIL6013定位了2個蛋白質(zhì)含量QTL。這2個群體定位的QTL在不同的基因組區(qū)域,說明應(yīng)用關(guān)聯(lián)群體可提高QTL的發(fā)現(xiàn)能力。

通過比較含有不同遺傳背景的QTL的基因組區(qū)域,結(jié)果發(fā)現(xiàn),O連鎖群上的蛋白質(zhì)QTL(qPro-O-1)基因組所在的區(qū)域為5.44(Satt358)～20.93 cM(Sat_303)已經(jīng)定位1個蛋白質(zhì)含量QTL和1個油分含量QTL[4,16],O連鎖群上的另一個蛋白質(zhì)QTL(qPro-O-2)基因組所在的區(qū)域為20.93(Sat_303)～56.93 cM(Satt633),已經(jīng)定位1個蛋白質(zhì)含量QTL和3個油分含量QTL[12,17-19]。B1連鎖群上的蛋白質(zhì)QTL(qPro-B1-1) 基因組所在的區(qū)域46.38(Satt197)～102.55 cM(Satt359),已經(jīng)定位3個蛋白質(zhì)含量QTL和1個油分含量QTL[4,20-21]。F連鎖群上的蛋白質(zhì)QTL (qPro-F-1)基因組所在的區(qū)域為27.87(Sat_039)～135.94 cM(Sat_417),已經(jīng)定位8個蛋白質(zhì)含量QTL和5個油分含量QTL[2-3,12,16,21-25]。D2連鎖群上的蛋白質(zhì)QTL (qPro-D2-1)基因組所在的區(qū)域為92.12(Sat_001)～112.84 cM(Sat_326),已經(jīng)定位3個蛋白質(zhì)含量QTL和4個油分含量QTL[8,11-12,19-20]。L連鎖群上的蛋白質(zhì)QTL (qPro-L-1)基因組所在的區(qū)域為28.27(Sat_134)～32.00 cM(Sat_191),在標記Sat_134處與Mao等[12]定位的油分含量QTL有相同的標記,但是否為同一QTL 有待進一步驗證。Ⅰ連鎖群上的蛋白質(zhì)QTL (qPro-I-1)基因組所在的區(qū)域為27.98(Satt367)～50.11 cM(Satt270),已經(jīng)定位14個蛋白質(zhì)含量QTL和12個油分含量QTL[4-5,9-11,22,26-30]。D1a連鎖群上的控制油分含量的QTL (qOil-D1a-1)基因組所在的區(qū)域為8.23 (AZ254740)～55.68 cM(Satt515),已經(jīng)定位1個蛋白質(zhì)含量和1個油分含量QTL[11,22]。A2連鎖群上的控制油分含量的QTL (qOil-A2-1)基因組所在的區(qū)域為14.99(Sct_067)～33.95 cM(Satt589),與Qi等[4]在A2連鎖群上的油分含量QTL在大豆公共圖譜上相距很近,可以認為是同一個QTL。D2連鎖群上的控制油分含量的QTL (qOil-D2-1)基因組所在的區(qū)域為5.38(Sat_333)～86.69 cM(Sat_194),已經(jīng)定位3個蛋白質(zhì)含量QTL和11個油分含量QTL[4,6,10-12,15,23]。以上 QTL 與前人的定位結(jié)果相一致,是多個遺傳背景通用的QTL。但蛋白質(zhì)QTL(qPro-G-1)和油分含量QTL (qOil-C1-1、qOil-H-1)在公共圖譜上并未發(fā)現(xiàn)與之重疊區(qū)域,是RIL3613和RIL6013的特異性QTL位點,可為以后的分子育種奠定基礎(chǔ)。

國內(nèi)外關(guān)于大豆蛋白質(zhì)含量、油分含量QTL的研究日益增多,研究方法也有所不同,但在以往研究多是利用單環(huán)境的數(shù)據(jù)進行分析,由于蛋白質(zhì)和油分含量多表現(xiàn)為數(shù)量性狀,易受環(huán)境條件的影響,這將導致一些QTL由于LOD值較高而未被檢測到或是出現(xiàn)假陽性。Wang等[10]利用2個重組自交系群體,共定位到12個產(chǎn)量性狀,16個油分含量和11個蛋白質(zhì)含量多環(huán)境通用QTL。侯萌等[31]構(gòu)建了包含147個株系的重組自交系群體,進行油分和蛋白質(zhì)含量的QTL分析,6個環(huán)境下共定位到9個蛋白質(zhì)含量QTL和11個油分含量QTL,其中有2個油分含量QTL為多環(huán)境通用QTL。Ning等[13]利用包含204個株系的大豆4項重組自交系群體,共檢測到29個蛋白質(zhì)含量QTL和39個油分含量QTL,分別有5個蛋白質(zhì)和10個油分QTL為多環(huán)境通用QTL。應(yīng)用多環(huán)境的數(shù)據(jù)分析,可以同時發(fā)現(xiàn)環(huán)境特異QTL和多環(huán)境通用QTL,較準確估計 QTL 的效應(yīng),更有利于搜索穩(wěn)定的QTL。本研究共檢測到1個油分含量QTL為多環(huán)境通用QTL,12個QTL為單個環(huán)境特異QTL。

在以往進行QTL的研究中,多研究主效QTL,即貢獻率值高于10%的QTL。葛振宇等[7]利用包含96個株系的RIL群體,進行油分和蛋白質(zhì)含量的QTL分析,定位到2個蛋白質(zhì)含量和3個油分含量QTL,且貢獻率均高于10%。侯萌等[31]構(gòu)建了包含147個株系的重組自交系群體,進行油分和蛋白質(zhì)含量的QTL分析,共定位到9個蛋白質(zhì)含量QTL和11個油分含量QTL,其中有6個蛋白質(zhì)含量和7個油分含量QTL 貢獻率高于10%。本研究有3個蛋白質(zhì)QTL和3個油分含量QTL的貢獻率高于10%,這些QTL具有重要的潛在價值,可以對其進行精細定位,為相應(yīng)基因的圖位克隆奠定基礎(chǔ)。

本試驗定位出了8個蛋白質(zhì)含量QTL與5個油分含量QTL,有1個蛋白質(zhì)QTL和2個油分含量QTL為本研究群體特異性QTL；有1個油分含量QTL為多環(huán)境通用QTL,其他12個QTL為單個環(huán)境特異QTL；在本研究中,有3個蛋白質(zhì)QTL和3個油分含量QTL為主效QTL,可進行分子設(shè)計育種研究。