向 華，黃 忍，朱江江，岳 華，湯 承，張煥容

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用，四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

羊傳染性膿皰皮炎俗稱“羊口瘡”，是由羊口瘡病毒(Orfvirus，ORFV)引起的一種急性、接觸性、嗜上皮性的人獸共患傳染病[1]。該病毒主要感染綿羊及山羊，特別是羔羊，人類接觸也可感染[2]。臨床上主要以感染動物的唇、鼻孔、口腔黏膜、乳房、陰部等部位皮膚形成紅斑、水皰、膿皰、丘疹和疣狀痂皮為特征[3-5]。初生羔羊和幼齡羊感染ORFV后發(fā)病率高達100%，死亡率達93%；雖然成年羊感染ORFV后的死亡率較低，但由此引起的采食困難，會導(dǎo)致機體消瘦、生長緩慢，以及繼發(fā)感染，帶來巨大的經(jīng)濟損失。近年來，隨著我國養(yǎng)羊數(shù)量增加和跨境流通，ORF作為人畜共患的傳染病，對人類的健康也產(chǎn)生了威脅，受到社會的廣泛關(guān)注。然而，由于ORFV特有的免疫機制和免疫逃逸機制，目前的疫苗并不能為羊提供完全的免疫保護。同時，現(xiàn)有的針對羊口瘡的治療藥物大多為“對癥治療”的緩解性藥物，其治療效果不甚理想，且費時費力。羊口瘡難以根治的特點和反復(fù)發(fā)作的現(xiàn)狀已成為制約養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

ORFV屬于痘病毒科副痘病毒屬，為雙股DNA病毒，共包含130多個基因[6]。由末端基因區(qū)(ORFVs001-008和ORFVs112-134)和中間核心基因區(qū)(ORFVs009-111)組成，中間核心區(qū)包含眾多保守基因，多與病毒的復(fù)制和形態(tài)相關(guān)，末端基因區(qū)多為非保守基因，與病毒毒力和致病性相關(guān)[7-9]。其中末端基因中包括5種編碼錨蛋白的基因，分別為ORFV008、ORFV123、ORFV126、ORFV128和ORFV129。ORFV129蛋白與其他ORFV錨蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，包含多個錨蛋白重復(fù)基序(ANKs)和1個F-Box樣結(jié)構(gòu)域[10-11]。ORFV129蛋白的功能目前不清楚，而蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮往往與該蛋白的亞細胞定位密切相關(guān)[12]。本研究旨在克隆羊口瘡病毒ORFV129基因全長，并對其進行生物信息學(xué)分析。進一步構(gòu)建真核表達載體pEGFP-ORFV129，轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細胞研究該蛋白在細胞中的定位特征，為進一步研究ORFV129在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株、菌株、真核質(zhì)粒和細胞

羊口瘡病毒JYY-ORFV株、新生山羊睪丸原代細胞和pEGFP-N1載體及大腸桿菌DH5α購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)。

1.2 主要試劑及儀器

PremixTaq、DL2000 DNA Marker、T4DNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；Hind Ⅲ、PstⅠ購自上海玉博生物科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自美國Omega公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和OPTI-MEM 1(1X)均購自美國Gibco公司；RAPI裂解液、廣譜蛋白酶抑制劑、廣譜磷酸酶抑制劑、組織固定液、一抗鼠源GFP、一抗兔源GADPH均購自武漢博士德生物工程有限公司；HRP標記的山羊抗鼠IgG購自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；DAPI核酸染料、LipoGeneTM2000均購自US Everbright?Inc.(簡稱UE)公司；Triton X-100、DNase Ⅰ均購自廣州賽國生物科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯(Olympus Corporation)；激光共聚焦顯微鏡購自德國卡爾·蔡司公司股份公司(Carl Zeiss AG)。

1.3 ORFV129基因全長的克隆鑒定及生物信息學(xué)分析

參照GenBank中登錄的羊口瘡病毒SY 17株ORFV129(登錄號：MG 712417.1)，運用Primier Primer 5設(shè)計1對特異性引物。上游引物：5′-AACGCCACGCCATGGACGC-3′；下游引物：5′-GATGGGCAGTCACTCGGGCG-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。選取接種了ORFV且具有明顯細胞病變的新生山羊睪丸原代細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心2 min，留上清，使用DNA提取試劑盒提取病毒DNA。以提取的病毒DNA為模板，使用上下游引物進行PCR反應(yīng)，特異性擴增全長ORFV129基因。反應(yīng)體系：Pre mix Taq 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，其余用ddH2O補足20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收產(chǎn)物連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒后陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序后保存?zhèn)溆茫瑢㈣b定正確的質(zhì)粒命名為pMD19-ORFV129。對測序鑒定正確的ORFV129全基因序列進行相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測：使用SMART(http：//smart.emblheidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)軟件進行一級結(jié)構(gòu)分析；使用TMHMM Server v. 2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件進行跨膜區(qū)域分析；使用在線軟件SignalP 5.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行信號肽分析以及在線軟件WOLF(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行蛋白亞細胞定位的預(yù)測。

1.4 融合表達ORFV129基因真核重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

參照ORFV SY 17株ORFV129(登錄號：MG 712417.1)，運用Primier Primer 5設(shè)計引物。上游引物5′-AAGCTTATGGACGCCGCCGAGATGGAGGAGCTCGACATC-3′(劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點)；下游引物5′-CTGCAGCTCGGGCGCGCGGCGGTCGCACGAGCGGCGC-3′(劃線部分為PstⅠ酶切位點)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以1.3中質(zhì)粒pMD19-ORFV129為模板，PCR擴增帶酶切位點的129基因，反應(yīng)體系及條件同1.3，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收產(chǎn)物。將膠回收產(chǎn)物和載體pEGFP-N1分別使用Hind Ⅲ、PstⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后，T4DNA連接酶16 ℃金屬儀連接過夜，轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒后經(jīng)PCR、雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序后保存?zhèn)溆茫瑢㈣b定正確的質(zhì)粒命名為pEGFP-ORFV129。

1.5 pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細胞

將生長良好的新生山羊睪丸原代細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達70%～90%時，按照LipoGeneTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORFV129轉(zhuǎn)染至生長良好的新生山羊睪丸原代細胞，以空載體pEGFP-N1為轉(zhuǎn)染對照，并以正常生長的細胞為非轉(zhuǎn)染空白對照。

1.6 檢測pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒在睪丸細胞的mRNA表達

在轉(zhuǎn)染12～24 h后，將轉(zhuǎn)染空載pEGFP-N1和融合載體pEGFP-ORFV129的細胞培養(yǎng)板置于熒光倒置顯微鏡下，觀察pEGFP-ORFV129融合蛋白在睪丸細胞中的瞬時表達情況。對于檢測轉(zhuǎn)錄動力學(xué)，在轉(zhuǎn)染48 h后，用TRIzol法提取細胞總RNA，并用DNase Ⅰ消化殘留于總RNA中的DNA，總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增引物和條件同1.4，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測ORFV129基因在細胞中ORFV復(fù)制期間的mRNA表達。

1.7 檢測ORFV129蛋白在羊睪丸細胞中的蛋白表達

將生長良好的睪丸細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板上，設(shè)3組，每組2個重復(fù)，分別為空白對照組、pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組(4.0 μg)、pEGFP-ORFV129轉(zhuǎn)染組(4.0 μg)。轉(zhuǎn)染36 h后，將貼壁細胞刮取到1.5 mL的離心管，將廣譜蛋白酶抑制劑：RAPI細胞裂解液按照1∶100的比例混勻的細胞裂解液加入裝有細胞的離心管，在超聲波破碎儀作用下破碎，離心，收集蛋白。隨后，將提取的細胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，經(jīng)5%(m/V)脫脂奶中，4 ℃封閉過夜。隨后分別加入鼠源GFP(1∶400)和兔源GADPH(1∶1 000)，室溫孵育2 h，10 min/次TBST(3次)的洗膜。利用HRP標記山羊抗鼠IgG(1∶400)和HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶400)，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，隨后使用ECL試劑顯色，成像。

1.8 融合蛋白ORFV129的亞細胞定位

將睪丸細胞培養(yǎng)于含有蓋玻片的6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞匯合度達70%～90%時，轉(zhuǎn)染重組表達質(zhì)粒pEGFP-ORFV129，以空載體pEGFP-N1為對照，重組表達質(zhì)粒組和空載體組每組設(shè)2個平行。轉(zhuǎn)染48 h后吸盡培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗3次，4%的多聚甲醛室溫孵育15 min，預(yù)冷PBS洗3次；0.1%的Triton X-100室溫孵育10 min，預(yù)冷PBS洗3次；加入10～50 μmol/L DAPI核酸染料，室溫孵育15 min，預(yù)冷PBS洗2次；取出蓋玻片，將其貼于含有封片劑的載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡下觀察ORFV129在細胞內(nèi)的分布情況，分析其亞細胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 ORFV129基因的PCR擴增、克隆鑒定及生物信息學(xué)分析

成功擴增ORFV129基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可見與預(yù)期大小(1 551 bp)相符的目的片段(圖1-A)。膠回收克隆轉(zhuǎn)化后，進行菌落PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預(yù)期ORFV129基因的大小相符(圖1-B)。測序結(jié)果顯示，與NCBI上收錄的同一病毒的不同毒株基因序列相似性均在99%以上。利用DNAStar軟件分析發(fā)現(xiàn)，ORFV129基因共編碼516個氨基酸。SMART分析顯示，ORFV129基因共含有8個ANK基序，分別位于49-80 aa,85-117 aa,123-157 aa，161-192 aa，196-227 aa，231-262 aa，266-297 aa，302-331 aa(圖2-A)?？缒^(qū)域分析顯示，ORFV129蛋白不存在跨膜區(qū)域，推測其可能作為胞內(nèi)蛋白而起作用(圖2-B)。通過WoLFPSORT在線比對軟件預(yù)測ORFV129蛋白的亞細胞定位，結(jié)果顯示蛋白質(zhì)主要定位于細胞質(zhì)(圖2-C)。

M. 相對分子質(zhì)量標準(2 000 bp DNA ladder)；P. 陽性對照；N. 陰性對照；1-5. ORFV129基因；A. ORFV129基因的PCR擴增；B. 重組質(zhì)粒pMD-19T-ORFV129 的PCR擴增。

A. ORFV129蛋白的一級結(jié)構(gòu)分析；B. ORFV129蛋白的跨膜區(qū)域分析；C. ORFV129蛋白的亞細胞定位分析。A. Predicted primary-structure of ORFV129 protein；B. Predicted transmembrane region of ORFV129 protein；C. Predicted subcellular localization of ORFV129 protein.

2.2 融合表達ORFV129基因真核重組表達載體的構(gòu)建及鑒定

使用帶Hind Ⅲ、PstⅠ酶切位點的引物進行PCR擴增，結(jié)果顯示片段大小約為1 600 bp，與預(yù)期的片段大小(1 560 bp)相符合。隨后，膠回收后定向克隆至pEGFP-N1構(gòu)建融合重組質(zhì)粒pEGFP-ORFV129，經(jīng)雙酶切鑒定表明構(gòu)建的質(zhì)粒正確(圖3)。

M. 相對分子質(zhì)量標準(1 kb DNA ladder)；1. pEGFP-ORFV129的Hind Ⅲ、Pst Ⅰ雙酶切鑒定。M. Relative molecular mass (1 kb DNA ladder)；1. pEGFP-ORFV129 digested by Hind Ⅲ and Pst Ⅰ.

2.3 pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒在睪丸細胞ORFV復(fù)制期間的mRNA表達分析

轉(zhuǎn)染12～24 h后，將融合載體pEGFP-ORFV129和空載體pEGFP-N1置于熒光倒置顯微鏡下，均能觀察到綠色熒光(圖4)。mRNA表達檢測發(fā)現(xiàn)，細胞總RNA經(jīng)RT-PCR擴增后，可見與預(yù)期ORFV129基因大小相似的目的條帶(圖5)，表明ORFV129基因在細胞中ORFV復(fù)制期間發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。

A. 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載的新生山羊睪丸原代細胞；B. 轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV129的新生山羊睪丸原代細胞。A. Testis cells of newborn goat transfected with pEGFP-N1；B. Testis cells of newborn goat transfected with pEGFP-ORFV129.

M.相對分子質(zhì)量標準(2 000 bp DNA ladder)；P.陽性對照；N.無模板對照；1.ORFV129基因。M.Relative molecular mass (2 000 bp DNA ladder)；P.Positive product；N.No template control；1.ORFV129 gene.

2.4 融合蛋白ORFV129在羊睪丸細胞中的表達

將 pEGFP-N1和pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊睪丸原代細胞36 h后，Western Blot 結(jié)果顯示，空白對照組中沒有GFP蛋白的表達，而轉(zhuǎn)染了pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒的山羊睪丸原代細胞中檢測到了ORFV129-GFP蛋白(75 ku

圖6 ORF129蛋白表達的Western Blot鑒定Fig.6 Western Blot identification of ORF129 protein

2.5 融合蛋白ORFV129-GFP的亞細胞定位

將 pEGFP-N1和pEGFP-ORFV129重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染羊睪丸原代細胞24 h后，經(jīng)染料DAPI對細胞核進行藍染，激光共聚焦顯微鏡下分析ORFV129蛋白在細胞內(nèi)的定位情況。結(jié)果顯示，在表達pEGFP-N1的細胞內(nèi)，綠色熒光彌散性分布于整個細胞；而在表達pEGFP-ORFV129的睪丸細胞中，綠色熒光呈點狀地分布于細胞質(zhì)(圖7)。

A. 轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的睪丸細胞明場觀察；B．轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的睪丸細胞綠色熒光觀察；C. DAPI 染色后細胞核；D. 圖B和C的合并；E. 轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV129的睪丸細胞明場觀察；F. 轉(zhuǎn)染pEGFP-ORFV129的睪丸細胞綠色熒光觀察；G. DAPI 染色后細胞核；H. 圖F和G的合并。

3 討論與結(jié)論

錨蛋白重復(fù)序列 (Ankyrinrepeat，ANKs )是普遍存在于生物體中的一種由33個氨基酸殘基基序組成的蛋白質(zhì)序列模體，由2個α螺旋和1個Loop區(qū)構(gòu)成，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞骨架完整性、細胞周期調(diào)控、免疫應(yīng)答、蛋白轉(zhuǎn)運等過程中均具有重要作用[13-14]。ANKs不僅存在生物體，也存在于痘病毒編碼的蛋白，而其他病毒幾乎不編碼錨蛋白。錨蛋白作為痘病毒編碼的蛋白中最大的家族，其特征是具有ANKs的N末端和1個F-Box樣的C末端結(jié)構(gòu)域[15-17]。已有研究報道，痘病毒編碼的錨蛋白主要功能是可通過多層次的方式來影響NF-κB信號通路。例如，天花病毒(Variola，VARV)編碼的蛋白G1R，痘苗病毒(Vacciniavirus，VACV)編碼的蛋白CP77，兩者均可通過其N端的ANK重復(fù)基序，分別與NF-κB1/p105、NF-κB p65蛋白直接或間接結(jié)合抑制宿主NF-κB的活化[18-20]。2004年，Shisler等[21-22]發(fā)現(xiàn)VACV編碼的蛋白K1L可通過競爭與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的結(jié)合，阻止IκBα的降解，從而抑制NF-κB的活化。同時，該團隊也證實K1L蛋白能通過阻礙IKK的磷酸化從而抑制NF-κB的活化。因此，KIL蛋白準確的抑制機制仍然需進一步的研究。VACA A52和K7蛋白均能與腫瘤壞死因子受體相關(guān)分子6(TNF receptor-associated factor 6，TRAF6)相互作用，間接抑制NF-κB的激活[23]。羊口瘡病毒編碼的蛋白ORFV119，能通過與視網(wǎng)膜瘤蛋白相互作用抑制IKK的活化，從而抑制NF-κB信號通路的活化[24]。2014年，Lamb等[25]發(fā)現(xiàn)，黏液瘤病毒(Myxomavirus，MYXV)編碼的錨蛋白M-T 5、M148R、M149R和M150R均能抑制NF-κB p65蛋白從細胞質(zhì)遷移到細胞核，減少細胞核內(nèi)NF-κB p65的聚集，抑制或者降低NF-κB信號通路的活性。同樣VACV編碼的錨蛋白K1L可通過對NF-κB信號途徑不同位點的作用而調(diào)控宿主的天然抗病毒免疫應(yīng)答[26]。

對于ORFV編碼的5種錨蛋白，ORFV008蛋白可通過阻止IκBα蛋白磷酸化降解過程而抑制細胞NF-κB p65蛋白核移位，從而減弱細胞NF-κB信號通路的活化[27]。ORFV128蛋白在病毒感染早期表達且定位于宿主的細胞核，通過抑制IκBα蛋白磷酸化降解過程，阻止NF-κB p65蛋白核移位，進而抑制宿主NF-κB信號通路的活化[28]?？梢姡徊《緝?nèi)具有ANKs基序的錨蛋白，能通過對NF-κB信號途徑的不同位點的作用而調(diào)控宿主的天然抗病毒免疫應(yīng)答。羊口瘡病毒ORFV129基因編碼的錨蛋白具有典型的N末端多個ANK重復(fù)序列和1個F-Box的C末端結(jié)構(gòu)域。2013年，白剛等[10]利用真核表達系統(tǒng)對ORFV129基因編碼的蛋白進行表達并篩選出穩(wěn)定表達ORFV129基因的細胞株，為研究ORFV129蛋白調(diào)控宿主天然免疫應(yīng)答的作用機制奠定了基礎(chǔ)。2016年，葛士坤等[29]對ORFV129基因序列及其編碼蛋白進行生物信息學(xué)分析，該結(jié)果為深入研究ANK在ORFV致病過程中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對于ORFV編碼的129錨蛋白功能目前不清楚，這也正是本研究選擇ORFV129蛋白作為研究切入點的重要原因。本研究克隆了羊口瘡病毒ORFV129基因全序列，對其進行生物信息學(xué)分析；進一步構(gòu)建真核表達載體pEGFP-ORFV129，并將其轉(zhuǎn)染新生山羊睪丸原代細胞，以空載體pEGFP-N1作為陰性對照，借助激光共聚焦顯微鏡觀察了ORFV129在細胞中的定位；亞細胞定位發(fā)現(xiàn)ORFV129分布于細胞質(zhì)中。ORFV編碼的其他錨蛋白，如ORFV126蛋白表達后靶向定位于線粒體內(nèi)，且ORFV126編碼的AR8和AR9對錨蛋白定位于線粒體內(nèi)起著關(guān)鍵性的作用[30]。ORFV128蛋白表達后靶向定位于細胞核中[17]。ORFV129蛋白是否類似于ORFV126，定位于細胞質(zhì)內(nèi)的線粒體，或者其蛋白功能是否與ORFV128的不一致，目前仍不清楚，需要進一步的研究。

本研究成功克隆得到羊口瘡病毒ORFV129基因的全長，定位在新生山羊睪丸原代細胞細胞質(zhì)中，這些結(jié)果為進一步研究ORFV129在誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答中的作用奠定了基礎(chǔ)。