李 晶，張夢(mèng)瑤，劉開(kāi)東，柳 楠，賀建寧

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，山東 曲阜 273100；3.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266121)

敖漢細(xì)毛羊是我國(guó)很早培育出的細(xì)毛羊品種，它主要分布在東北部地區(qū)，是我國(guó)最具有代表性的細(xì)毛羊之一[1]，其羊毛是紡織工業(yè)的重要原料。敖漢細(xì)毛羊毛囊的結(jié)構(gòu)和特性直接決定毛發(fā)品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值[2]，毛囊擁有著相對(duì)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它的形成是由多種細(xì)胞來(lái)協(xié)同完成的。毛囊通過(guò)一系列的分化生長(zhǎng)最后成為羊毛，其生長(zhǎng)發(fā)育也有些復(fù)雜，它是由多種因子來(lái)相互調(diào)節(jié)，因此,通過(guò)研究相關(guān)因子來(lái)探討毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育顯得尤為重要。

Hox家族在生物體內(nèi)是一類(lèi)與發(fā)育調(diào)控相關(guān)十分重要的基因。Hox家族這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子都是高度保守的[3]，對(duì)毛囊細(xì)胞增殖分化也起著十分重要的作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚和毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中Hox家族基因起到了主導(dǎo)作用[6]，Hoxa5主導(dǎo)了皮膚細(xì)胞增殖、分化與凋亡[5]，對(duì)毛囊退行期進(jìn)行了調(diào)控，并誘導(dǎo)了細(xì)胞分化[7]。動(dòng)物形態(tài)的進(jìn)化和多樣性與Hox基因數(shù)目、序列及其表達(dá)方式密切相關(guān)，已有研究結(jié)果表明，當(dāng)Hox家族基因發(fā)生變化時(shí)，動(dòng)物在被毛生長(zhǎng)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出缺陷[8]。BMP6基因是TGF-β超家族中的一員[9-10]，TGF通路中的許多轉(zhuǎn)錄因子都受BMP6調(diào)控，均表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)趨勢(shì)。楊燕燕等[11]在生殖發(fā)育上對(duì)BMP6進(jìn)行了研究，它控制著羊的多胎，尤其是在發(fā)情期基因表達(dá)相當(dāng)明顯。也有研究表明，BMPs通路中的轉(zhuǎn)錄組因子對(duì)毛囊發(fā)育主要表現(xiàn)出抑制作用，而它的下游靶標(biāo)BMPRs主要表現(xiàn)出促進(jìn)的作用[12-13]。程旭等[14]通過(guò)對(duì)鐵調(diào)素在BMP6-HJV-SMAD信號(hào)通路的作用，驗(yàn)證了BMP6的重要性。由此可見(jiàn)，Hoxa5和BMP6基因都能抑制毛囊生長(zhǎng)，但二者之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。

對(duì)于家畜皮膚毛囊的一些研究大多集中在單個(gè)基因的功能驗(yàn)證上，還有一些是與骨的調(diào)節(jié)、繁殖等與皮膚毛囊無(wú)關(guān)的研究，本試驗(yàn)主要的側(cè)重點(diǎn)是利用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體通過(guò)與單、共轉(zhuǎn)染比較基因表達(dá)量的變化來(lái)研究Hoxa5和BMP6之間的作用關(guān)系，旨在為更深層次上研究毛囊功能基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康的30日齡胎羊由青島畜牧所奧特種羊場(chǎng)提供；TRIzol、KpnⅠ、倒置顯微鏡、熒光定量PCR等均購(gòu)自Bio-Rad公司[9]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 選取綿羊Hoxa5基因(GenBank登錄號(hào)為NM-001009431.1)CDS區(qū) 和BMP6基因(GenBank登錄號(hào)為NM-001110277.1)CDS區(qū)，軟件導(dǎo)入pcDNA3.1表達(dá)載體的序列，通過(guò)Snap Gene設(shè)計(jì)Hoxa5基因和BMP6基因上下游引物，序列分別如下：

F(Hoxa5)：5′-ATGCGTTAACTCAGGAATCGGATGCATCGGTCAAGCTGGCAT-3′；R(Hoxa5)：5′-TGGCCTTAAAATCTCCGAGGAAATACTCGCTCACGCGGTAG-3′。F(BMP6)：5′-TTACGGGCATCGGTAGGGAAATTCGTATTGCATGCAAAGCT-3′；R(BMP6)：5′-TGTCCGAGACCTGCACATCCACGGCGGCCCTTCAGCATACCCCTA-3′。擴(kuò)增體系：20 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix 17 μL。

1.2.2 pcDNA3.1與Hoxa5、BMP6基因同源重組 對(duì)Hoxa5、BMP6進(jìn)行切膠，用KpnⅠ對(duì)pcDNA3.1進(jìn)行單酶切，體系：KpnⅠ 1 μL，pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL。通過(guò)電泳對(duì)BMP6、Hoxa5基因片段及pcDNA3.1進(jìn)行膠回收，SoSo連接體系：BMP6、Hoxa5基因上、下游引物各1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL，轉(zhuǎn)化DH5α，過(guò)夜對(duì)菌液進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，將菌液生長(zhǎng)良好的送往公司進(jìn)行測(cè)序[12-13]。

1.2.3 胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 在細(xì)胞室將30日齡胎羊從母羊子宮內(nèi)取出，先用75%的酒精對(duì)胎兒進(jìn)行消毒，再用PBS將胎兒表面的酒精沖洗掉。在培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀將胎兒的頭部和四肢、內(nèi)臟等全部剔除，只用胎羊的軀干，將其剪碎，分布在培養(yǎng)皿中，在每一個(gè)肌肉塊上面加2滴已經(jīng)預(yù)熱的胎牛血清，放進(jìn)CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5.0% CO2)，24 h對(duì)其進(jìn)行觀察并且換液[15-16]。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞進(jìn)行傳代以后，等密度再次達(dá)到95%左右時(shí)，借助轉(zhuǎn)染試劑對(duì)重組的載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。取脂質(zhì)體20 μL，PBS 480 μL，加入到無(wú)菌的離心管中并混勻，靜置5 min。進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)分為2組，分別是共轉(zhuǎn)染組和單轉(zhuǎn)染組，共轉(zhuǎn)染組中加入Hoxa5、BMP6質(zhì)粒各20 μL，單轉(zhuǎn)染組加入Hoxa5質(zhì)粒40 μL或者BMP6質(zhì)粒40 μL，2組均加入PBS 460 μL，具體詳細(xì)操作步驟參照Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)[17]。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的qPCR 重組載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后需要進(jìn)一步的增殖培養(yǎng)，當(dāng)密度達(dá)到95%左右時(shí)，對(duì)成纖維細(xì)胞的RNA進(jìn)行提取，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA[18]。使用Snap Gene軟件對(duì)Hoxa5、BMP6和GAPDH基因進(jìn)行qPCR引物設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

qPCR反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)7 min；95 ℃ 40 s，60 ℃退火40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s，4 ℃保存。每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，對(duì)數(shù)據(jù)利用Ct(2-ΔΔCt)公式進(jìn)行計(jì)算，得出Hoxa5、BMP6的相對(duì)表達(dá)量。借助SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性的分析，以P<0.01作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.2.6 Hoxa5、BMP6蛋白表達(dá)的檢測(cè) 提取成纖維細(xì)胞中的組蛋白，進(jìn)行Western Blot，首先進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，后進(jìn)行封閉，時(shí)長(zhǎng)2 h；進(jìn)行一抗、二抗的孵育，均對(duì)抗體進(jìn)行2 000倍的稀釋。孵育完成后利用1∶1的曝光液進(jìn)行曝光拍照[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hoxa5、BMP6基因PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，添加引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增獲取Hoxa5、BMP6基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖1)，Hoxa5基因條帶在圖中804 bp處，BMP6基因條帶在圖中537 bp處，都與目的基因CDS區(qū)大小吻合，可用于后期的試驗(yàn)。

M.2000 Marker；1.Hoxa5基因擴(kuò)增片段(804 bp)；2.BMP6基因擴(kuò)增片段(537 bp)。M.2000 Marker；1.Hoxa5 product(804 bp)；2.BMP6 product(537 bp).

2.2 pcDNA3.1表達(dá)載體酶切純化

使用KpnⅠ將pcDNA3.1表達(dá)載體從環(huán)狀酶切成鏈狀，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否酶切成功(圖2)。1，2是對(duì)pcDNA3.1的KpnⅠ單酶切，pcDNA3.1長(zhǎng)度為5 428 bp，圖中條帶所在位置約是5 428 bp，結(jié)果顯示酶切完成，回收條帶進(jìn)行重組。

圖2 pcDNA3.1載體單酶切鑒定Fig.2 Single enzyme digestion identification of pcDNA3.1 vector

2.3 pcDNA3.1表達(dá)載體的重組及鑒定

將pcDNA3.1酶切成鏈狀后，用SoSo試劑盒將BMP6、Hoxa5分別與pcDNA3.1相連接，轉(zhuǎn)化，振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證如圖3所示，在約804 bp處有明亮電泳條帶，是Hoxa5基因；537 bp處的是BMP6基因。菌液測(cè)序結(jié)果用Blast進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖4，說(shuō)明BMP6、Hoxa5沒(méi)有堿基的突變，已成功的連接到pcDNA3.1載體上。將連接好的重組載體從菌液中提取出來(lái)，如圖5所示，1-2為pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒，大小為5 965 bp，3-4為pcDNA3.1-Hoxa5重組質(zhì)粒，大小為6 232 bp，與圖中條帶相符。

M.2000 Marker；1，4.BMP6菌液PCR；2，3.Hoxa5菌液PCR。M.2000 Marker；1，4.BMP6 bacterial PCR；2，3. Hoxa5 bacterial PCR.

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)觀察

對(duì)胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察記錄(圖6)，24 h能夠觀察到細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始貼到培養(yǎng)皿底部，周?chē)灿幸恍┢〉慕M織。培養(yǎng)至96 h后，密度再次達(dá)到95%左右，此時(shí)即可對(duì)原代細(xì)胞進(jìn)行傳代[18]。

2.5 RT-PCR檢測(cè)Hoxa5、BMP6基因mRNA表達(dá)

對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖7)表明，引物擴(kuò)增效果良好，沒(méi)有出現(xiàn)二聚體等雜物，在128 bp 處的是內(nèi)參基因GAPDH，在186 bp處的是Hoxa5基因，在116 bp處的是BMP6基因，綜上可得引物均可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

圖4 BMP6(上)和Hoxa5(下)表達(dá)載體菌液的測(cè)序比對(duì)Fig.4 Sequencing comparison of BMP6 (up) and Hoxa5 (down) expression vector bacilli

M.10000 Marker；1-2.pcDNA3.1-BMPR6；3-4.pcDNA3.1-Hoxa5。M. 10000 Marker；1-2. pcDNA3.1-BMPR6 recombinant plasmids；3-4. pcDNA3.1-Hoxa5 recombinant plasmids

圖 8，9分別為Hoxa5、BMP6和GAPDH的qPCR過(guò)程中的擴(kuò)增曲線、熔解曲線，兩線效果顯示均良好，在qPCR過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。對(duì)2組的mRNA表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析(圖10)，分析顯示Hoxa5與BMP6共轉(zhuǎn)染后的Hoxa5基因相對(duì)表達(dá)量極顯著低于單轉(zhuǎn)染(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染后的BMP6基因相對(duì)表達(dá)量在共轉(zhuǎn)染卻極顯著高于單轉(zhuǎn)染(P<0.01)。

圖6 成纖維細(xì)胞原代(左)、傳代(右)培養(yǎng)(×100)Fig.6 Primary (left) and passage (right) culture of fibroblasts (×100)

A：M.500 Marker；1-2.內(nèi)參基因GAPDH；B：M.500 Marker；1-2.目的基因BMP6；C：M.500 Marker；1-2.目的基因Hoxa5。A：M.500 Marker；1-2 .Reference gene GAPDH；B：M. 500 Marker；1-2.Target gene BMP6；C：M.500 Marker；1-2. Target gene Hoxa5.

圖8 Hoxa5、BMP6和GAPDH 熔解曲線Fig.8 Hoxa5，BMP6 and GAPDH melting curves

圖9 Hoxa5、BMP6和GAPDH擴(kuò)增曲線 Fig.9 Hoxa5， BMP6 and GAPDH amplification curve

2.6 Hoxa5、BMP6蛋白表達(dá)的檢測(cè)

對(duì)Hoxa5、BMP6基因的共轉(zhuǎn)染、單轉(zhuǎn)染蛋白的表達(dá)(圖11)進(jìn)行比較分析，從灰暗度以及條帶的大小，使用ImageJ和SPSS軟件進(jìn)行分析，Hoxa5與BMP6共轉(zhuǎn)染后的Hoxa5蛋白表達(dá)量極顯著低于單轉(zhuǎn)染過(guò)程(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染的BMP6蛋白表達(dá)量卻極顯著高于單轉(zhuǎn)染過(guò)程(P<0.01)(圖12)，這與mRNA相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果一致。

不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖12同。Different capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Fig.12.

圖11 Hoxa5、BMP6蛋白表達(dá) Fig.11 Hoxa5 and BMP6 expression protein

圖12 Hoxa5、BMP6蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.12 Relative expression of Hoxa5 and BMP6 protein

3 討論

許多研究表明，毛囊的發(fā)育依靠一系列的信號(hào)分子，這些信號(hào)分子在真皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞間穿梭著，介導(dǎo)了這2個(gè)細(xì)胞群體間的相互作用，毛囊能夠穩(wěn)定的進(jìn)行發(fā)育全靠這兩者的介導(dǎo)。毛囊的形成過(guò)程中離不開(kāi)所謂的原始信號(hào)，此信號(hào)來(lái)源于真皮下[18]，并且在真皮下去激活Wnt信號(hào)[19-20]。目前，許多信號(hào)通路都參與毛囊的發(fā)育，最常見(jiàn)的有Wnt通路、FGF家族、BMP家族、TGF家族[21]等。Botchkarev等[22]利用小鼠來(lái)研究BMPs在皮膚中的表達(dá)位置以及表達(dá)時(shí)期，表明BMPs家族基因?qū)γ业陌l(fā)育存在著一定的抑制作用。BMP6基因和BMP4一樣同屬于BMP家族，是一種抑制毛囊發(fā)育的信號(hào)分子，Hoxa5基因是TNF家族中尤為重要的基因，同樣也是一種抑制毛囊發(fā)育的信號(hào)分子，兩基因?qū)γ业陌l(fā)育均有抑制作用[23]。在信號(hào)通路中，BMP家族中的信號(hào)分子對(duì)TNF通路中信號(hào)分子有干涉作用，有些是輔助基因的表達(dá)，有些是抑制基因的表達(dá)。現(xiàn)在對(duì)單個(gè)基因功能的驗(yàn)證普遍存在，多個(gè)基因相互作用還是尤為少見(jiàn)，本研究通過(guò)利用同源重組手段來(lái)驗(yàn)證多基因相互之間的作用，幫助篩選相關(guān)基因，有助于后期育種和羊毛生產(chǎn)。

為探討Hoxa5、BMP6基因在細(xì)胞水平上是否存在互作效應(yīng)，本研究利用同源重組技術(shù)，快速構(gòu)建了pc-DNA3.1-Hoxa5、pc-DNA3.1-BMP6表達(dá)載體，并通過(guò)共轉(zhuǎn)染、單轉(zhuǎn)染后基因mRNA、蛋白表達(dá)量的比較分析，發(fā)現(xiàn)Hoxa5基因有促進(jìn)BMP6基因表達(dá)，BMP6基因有抑制Hoxa5基因表達(dá)的現(xiàn)象。本研究在構(gòu)建表達(dá)載體過(guò)程中所用同源重組技術(shù)較傳統(tǒng)的T克隆技術(shù)節(jié)約了時(shí)間，減少了堿基突變；同時(shí)由分子水平到細(xì)胞水平得到了Hoxa5和BMP6基因的互作關(guān)系，一方面驗(yàn)證了與羊毛生長(zhǎng)有關(guān)的基因，為信號(hào)通路的解析添加了論證，另一方面為進(jìn)一步在個(gè)體水平上驗(yàn)證其功能奠定基礎(chǔ)。